CHUYÊN ĐỀ SẮC KÝ LỚP MỎNG

Chuyên đề: SẮC KÝ LỚP MỎNG A TỔNG QUÁT SKLM I Phương pháp sắc ký - Năm 1906, nhà bác học người NgaMikhail Tswett (1872-1919) cho dung dịch sắc tổ thực vật (Clorophyl Xanthophyl ) ete dầu hỏa lên cột nhồi bột mịn Calci carbonat, ông thấy sắc tố bị hấp phụ đầu cột - Khi cho dung môi nguyên chất (ete dầu hỏa) lên cột, sắc tố di chuyển cột từ xuống dưới, sắc tố có tốc độ riêng, tách thành vùng hay vòng màu xếp chồng lên nhau, hình thành hệ mà Tsvet gọi sắc đồ Ông đặt tên cho phương pháptách sắc ký (chromato-graphy) - KN : Sắc ký(Chromatography) phương pháp tách, phân ly, phân tích chất dựa vào phân bố khác chúng hai pha động pha tĩnh II Sắc ký lớp mỏng 1.Lịch sử hình thành    1938,Izmailov Schraiber:(bản thủy tinh để phân tách dịch chiết alcaloid thực vật) 1958, Stahl hồn thiện chuẩn hóa phương pháp SKLM (silicagel, CaS,0.25mm) 1965, hãng Merck chuẩn hoá bảng mỏng sắc ký 2.Khái niệm Sắc ký lớp mỏng ( TLC: Thin Layer Chromatography) kỹ thuật tách chất tiến hành cho pha động di chuyển qua pha tĩnh đặt hỗn hợp chất cần tách Nguyên tắc Dựa vào chế hấp phụ đó: - Pha động dung mơi (hỗn hợp dung môi) - Pha tĩnh tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên phẳng kính, nhựa hay kim loại a) Pha động Hệ dung môi gồm hay thành phần - Dung môi xếp theo thứ tự mạnh dần : “Kém phân cực – Phân cực TB – Phân cực mạnh” VD: Chloroform : Methanol : Nước (65:35:7) b) Pha tĩnh Yếu tố định đến trình tách sắc ký - Khả phân tách pha tĩnh phụ thuộc nhiều vào mức độ tiếp xúc pha tĩnh với mẫu thử pha động -Yếu tố liên quan nhiều tới diện tích bề mặt riêng mật độ pha tĩnh Mật độ pha tĩnh cao, khả tạo cân pha lớn, hệ phân tách tốt - Pha tĩnh Thông dụng dùng sắc ký hấp phụ Silica gel Pha tĩnh Silicagel G Cơ chế sắc ký Phân tích Hấp phụ A.amin, vitamin Dẫn chất siloxan Phân bố Chất phân cực Cellulose Phân bố A.amin, carbohydrat Alumina Hấp phụ Hydrocarbon, lipid Cát biển Phân bố Đường, acid béo Cellulose trao đổi Trao đổi ion ion Ion KL, halogenid Gel sephadex Protein, polymer Loại cỡ Vd: để phân tách a.amin mẫu dd ta cần lựa chọn pha tĩnh Silica gel G, để tách hydrocacbon cần dùng Alumina Bình triển khai Tủ hút Bộ sắc ký Những dụng cụ cần thiết Tủ sấy Đèn tử ngoại B CÁC BƯỚC CHUẨN BI CHUẨN BỊ BẢN MỎNG 01 ĐIỀU CHẾ VỮA 02 CHUẨN BI BÌNH KHAI TRIỂN 03 CHẤM CHẤT PHÂN TÍCH 04 TRIỂN KHAI SẮC KÝ 05 Chuẩn bị mỏng - Bản mỏng dính chắc: chất hấp phụ trộn thêm – 15% chất kết dính (thạch cao, tinh bột, dextrin) - Bản mỏng khơng dính Điều chế vữa chất hấp phụ Chất hấp phụ chọn lọc cho phù hợp với yêu cầu phân tích như: Silicagel, cellulose, nhơm oxyd… (silicagel dùng thơng dụng nhất) Hoạt hóa: Cho mỏng khơ mặt vào tủ sấy 105 – 110/30 phút Ðể nguội bảo quản bình hút ẩm Chuẩn bị bình khai triển - Các bình khai triển thường bình thủy tinh, hình hộp hay hình trụ, có nắp đậy kín - Lưu ý: chọn bình phù hợp với lượng dung môi pha động theo nhu cầu lượng dung mơi bình khơng vượt q vạch bảng mỏng ( vạch chấm chất phân tích) Chấm chất phân tích lên mỏng - Dùng pipet ống nhỏ giọt đưa mẫu lên - Lượng mẫu đưa lên phải phù hợp - Đối với dung dịch phân tích q lỗng, thêm mẫu Triển khai sắc ký  Là trình tách cấu tử mỏng Thông số đặc trưng pp Hệ số lưu giữ Rf - Thông số thể cho khả di chuyển chất cần tách 0:chất tan hồn tồn khơng di chuyển, nằm điểm xuất phát 1: chất tan di chuyển với vận tốc dung môi : khoảng cách di chuyển chất cần tách : khoảng cách di chuyển dung môi v: vận tốc di chuyển chất cần tách : vận tốc di chuyển dung môi Các yếu tố ảnh hưởng đến Rf      Chất lượng hoạt tính chất hấp phụ Chiều dài lớp mỏng, quãng đường sắc ký, lượng chất chấm Vị trí số lượng chất cần tách bảng mỏng Thành phần độ tinh khiết pha động Phương pháp triển khai sắc ký    Ảnh hưởng cấu tử khác phần hỗn hợp cần tách Độ ẩm , nhiệt độ, pH Độ bão hòa dung mơi ( tượng “bờ” ) D ỨNG DỤNG VÀ CÔNG DỤNG SKLM Định tính thử độ tinh khiết: - Để nhận biết có mặt chất cần tách dd mẫu, ngồi nhận biết số tạp dd mẫu để đánh giá độ tinh khiết dd mẫu � Ưu điểm - Nhanh - Tách riêng chất - Dễ thực � Nhược điểm - Thành phần pha động dễ thay đổi - Các vết sau khai triển thường bị kéo đuôi - Chỉ sử dụng hỗn hợp cần tách số lượng vết bị kéo đuôi Bán định lượng – định lượng pp: tách chiết dung môi định lương trực tiếp bảng mỏng - - Tách chiết chất phân tích sắc ký dung mơi : (làm dịch chiết định lượng) -) nhiều thời gian nên sử dụng Định lương bảng mỏng : đo điện tích hay cường độ vết sắc ký có kĩ thuật + Dùng máy đo mật độ quang Densitometer : chiếu chùm tia vào vết sắc ký đo cường độ hấp phụ huỳnh quang + Xử lý ảnh với camera kĩ thuật số độ phân giải cao: quét bảng mỏng với hệ thống phân tích thu nhận hình ảnh vết sắc ký Xử lý liệu ảnh máy tính Xác định sắc tố tế bào thực vật Xét nghiệm độ tinh khiết chất phóng xạ Giám sát Phản ứng hữu Nhận biết hợp chất chất có sẵn Xác định sắc tố TBTV E CÁC HIỆN TƯỢNG NGOÀI Ý VÀ CÁCH KHẮC PHỤC Hiện tượng Nguyên nhân Khắc phục Vết di chuyển khơng hồn tồn Mẫu nhiều tạp phân cực Loại tạp kĩ trước chấm lên Vết hình móng ngựa Vết chấm hình tròn lớn Chấm nhỏ với nồng độ cao chấm vạch Các vết lân cận trùng vào Chấm vết gần Chấm khoảng cách vết theo quy định Vết hình lửa nhiều Chấm vết không trùng Chấm kỹ lại mỏng khác đầu Bản mỏng bị mẻ hai bờ, Thay mỏng khác thay Tuyến dung môi bị lệch thành mỏng tiếp xúc dung nắp bình, thay bình SK mơi, hở bình sắc ký Vết trải dài khơng tách Chọn DM sắc ký chưa tốt Thăm dò lại hệ DM SK chọn DM chiết không chuyên DM chiết xuất mẫu riêng biệt biệt Vết di chuyển xéo Bản mỏng bị mẻ hai bờ, Thay mỏng khác, thay bình thành mỏng tiếp xúc DM SK khác Vết loang Vết khuếch tán bay Vẽ chụp hình màu để lâu nhúng thuốc thử xong nhúng nhanh, loại bỏ lâu thuốc thử dư Bản mỏng bị loang màu vd vd Bản mỏng đặt sát Kê mỏng cách xa (dùng que thủy tinh kẹp treo) Ưu nhược điểm TLC Ưu điểm - Đơn giản, dễ thực - Tiết kiệm thời gian - Có thể phát tất chất kể chất không di chuyển theo pha động - Tách dễ dàng mẫu có nhiều thành phần - Phạm vi ứng dụng rộng rãi Nhược điểm - Chỉ số Rf có độ lặp lại thấp thành phần pha động thay đổi lúc triển khai sắc ký - Tăng giãn rộng vết khuết tán tốc độ dòng pha động thấp ... lại mỏng khác đầu Bản mỏng bị mẻ hai bờ, Thay mỏng khác thay Tuyến dung môi bị lệch thành mỏng tiếp xúc dung nắp bình, thay bình SK mơi, hở bình sắc ký Vết trải dài khơng tách Chọn DM sắc ký chưa... chất hấp phụ Chiều dài lớp mỏng, quãng đường sắc ký, lượng chất chấm Vị trí số lượng chất cần tách bảng mỏng Thành phần độ tinh khiết pha động Phương pháp triển khai sắc ký    Ảnh hưởng cấu... chuẩn hóa phương pháp SKLM (silicagel, CaS,0.25mm) 1965, hãng Merck chuẩn hoá bảng mỏng sắc ký 2.Khái niệm Sắc ký lớp mỏng ( TLC: Thin Layer Chromatography) kỹ thuật tách chất tiến hành cho pha động