ĐẠI CƯƠNG về sắc ký

 Sắc ký là một qui trình trong đó chất tan được tách riêng ra bởi quá trình dịch chuyển khác nhau về động lực học của chúng trong một hệ thống hai hay nhiều pha.. Một trong các pha này

ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ

1906 Mikhail Tswett  Công bố sắc ký hấp phụ các chất màu trong cây  gọi là sắc ký đồ, đặt tên là phương pháp sắc ký

 sắc ký lỏng hấp phụ trên cột

1931 Richard Kuhn và Edgar Lederer Sắc ký cột tách đồng phân  và  caroten

1938 Izmailov & Schraiber Xây dựng phương pháp SKLM, sắc ký trao đổi ion

1941 Martin & Synge đặt nền tảng cho sắc ký phân bố: SKG và SKK

1952 Martin & James  bài báo đầu tiên về SKK  giải Nobel về sắc ký phân bố

1958 Stahl hoàn thiện phương pháp SKLM

Cuối

năm

1960

sắc ký lỏng hiệu năng cao ra đời

1937 –

Đầu

năm

2005

sắc ký lỏng siêu áp

1- Khái niệm

 Sắc ký là sự phát triển một cách logic của sự chiết ngược dòng

 Sắc ký là sự chiết liên tục và sự cân bằng liên tục của chất tan giữa 2 pha

 Phương pháp sắc ký là phương pháp tách các chất bằng phương pháp chuyển pha

 Quá trình tách dựa vào tỷ lệ giữa 2 pha:

 Phương pháp chiết

 Phương pháp sắc ký

 Sắc ký là một qui trình trong đó chất tan được tách riêng ra bởi quá trình dịch chuyển khác

nhau về động lực học của chúng trong một hệ thống hai hay nhiều pha Một trong các pha này

chuyển động một cách liên tục theo một hướng nhất định và trong pha này các chất riêng biệt thể

hiện linh độ khác nhau là do có sự khác nhau về:

 phân bố,

 hấp phụ,

 điện tích,

 kích thước phân tử,

 độ hòa tan

 áp suất hơi

2- Thành phần của sắc ký

 Sắc ký đòi hỏi hai pha:

 Pha động:

+ lỏng, khí, lỏng siêu tới hạn

+ chuyển động dọc theo hệ sắc ký

 Pha tĩnh:

+ cố định trong cột hay trên bề mặt chất rắn

+ chất rắn hay chất trơ tẩm hay trộn trong chất lỏng

+ tương tác với chất tan theo các cơ chế: hấp phụ, phân bố, rây phân tử, trao đổi ion, ái

lực

 Các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với

các chất tương tác yếu hơn pha này:

 Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh

tương ứng với tính chất của chúng (hấp phụ, tính tan, …)

 Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh

 Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh

khác, sẽ lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ

 Ứng dụng: tách các chất qua quá trình sắc ký

 Nguyên nhân tách của các loại hình sắc ký:

 Mẫu phân tích được hòa tan trong pha động được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn với nó

 Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác

nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan  các thành phần

của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lượng

 Thực tế, tách là do sự kết hợp nhiều cơ chế

 Phương pháp sắc ký được áp dụng trong các ngành khoa học khác nhau

 Ngành Dược: nghiên cứu, phân tích, kiểm nghiệm thuốc



3- Quá trình sắc ký

a Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh

b Khai triển sắc ký

 Sắc ký khai triển

 Sắc ký rửa giải:

 Quá trình rửa giải

 Dung môi rửa giải (eluent)

 Dung dịch rửa giải (eluate)

c Phát hiện các chất

 Màu của chất

 Đèn tử ngoại

 Phun thuốc thử

 Đầu dò (detector)

` Triển khai cột

Hứng và kiểm tra các phân đoạn Sắc ký khai triển

III- PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

A THEO BẢN CHẤT VẬT LÝ CÁC PHA

1- Sắc ký lỏng

(liquid chromatography)

Thực hiện trên cột hay trên

mặt phẳng

 chất lỏng  Chất lỏng được

hấp phụ trên 1 chất rắn (chất mang)

 Pha liên kết

 Chất rắn

 Phân bố giữa hai pha lỏng

 Phân bố giữa pha lỏng và bề mặt pha liên kết

 Hấp phụ

2- Sắc ký khí

(gas chromatography,

GC)

Chỉ thực hiện trên cột

 chất khí  Chất lỏng được

hấp phụ trên chất rắn

 Pha liên kết

 Chất rắn

 Phân bố giữa pha khí

và pha lỏng

 Phân bố giữa pha khí

và pha liên kết

 Hấp phụ

3- Sắc ký lỏng siêu tới

hạn

(supercritical fluid

chromatography, SFC)

Chỉ thực hiện trên cột

 chất lỏng siêu tới hạn

 Pha liên kết  Phân bố giữa pha

lỏng siêu tới hạn và pha liên kết

B THEO PHƯƠNG CÁCH CHO PHA ĐỘNG ĐI QUA PHA TĨNH

1- Sắc ký khai triển (development chromatography)

2- Sắc ký rửa giải (elution chromatography)

 Pha động đưa các thành phần trong mẫu

di chuyển và tách ngay trên pha tĩnh

 Sắc ký đồ nằm ngay trên pha tĩnh

 Sắc ký khai triển thường được thực hiện

trên mặt phẳng

 Pha động đưa các thành phần trong mẫu

di chuyển lần lượt ra ngoài pha tĩnh

 Sắc ký đồ thực hiện ngoài pha tĩnh

 Sắc ký rửa giải thực hiện trên cột

C THEO BẢN CHẤT CỦA QUÁ TRÌNH SẮC KÝ – THEO CƠ CHẾ TÁCH

1- Sắc ký hấp phụ (absorption chromatography)

 Là kỹ thuật sắc ký trong đó sự phân tách các chất tan là do cân bằng hấp phụ trên bề

mặt của chất tan giữa các tiểu phân chất rắn của pha tĩnh với pha động (hệ lỏng-rắn hay khí-rắn)

 Pha động luôn chạy theo một chiều nhất định nên luôn xảy ra quá trình hấp phụ và phản

hấp phụ

 Các chất tan sẽ bị kéo theo

pha động

 Các chất tan khác nhau có ái

lực khác nhau với pha tĩnh

 Là kiểu sắc ký cổ nhất

 Thí nghiệm của Tswett; sắc

ký lớp mỏng theo cơ chế này

2- Sắc ký phân bố (partition chromatography)



 Là kỹ thuật sắc ký trong đó chất tan được tách riêng ra do sự cân bằng về sự phân bố của chất tan giữa:

 Pha tĩnh lỏng: chất lỏng này được bao trên bề mặt một chất rắn trơ, không tham gia vào quá trình sắc

ký (gọi là chất mang)

 Pha động: lỏng hay khí

 Phổ biến nhất

 Pha động luôn luôn chuyển động theo một chiều nhất định kéo theo chất tan đi

 Sự phân bố ngược dòng với hàng loạt lần chiết gián đoạn

 Sau một khoảng thời gian nhất định, chất tan dịch chuyển một khoảng nhất định trong pha

tĩnh

 Hai chất tan khác nhau với hệ số K khác nhau thì sẽ có linh độ khác nhau trong pha tĩnh

và sẽ được tách riêng ra khỏi hỗn hợp của chúng trong một khoảng thời gian nhất định

3- Sắc ký trao đổi ion (ion-exchange chromatography)

 Là kỹ thuật sắc ký hiện đại trong đó sự phân tách

các chất tan là do lực hút tĩnh điện giữa các phân tử chất

tan mang điện tích trái dấu với các nhóm cation

[-N(CH 3 )] + hay anion (-SO 3 ) - liên kết cộng hóa trị với các

tiểu phân của pha tĩnh (nhựa trao đổi ion)

 Pha tĩnh là các chất trao đổi ion

 Nhựa trao đổi ion là những hợp chất cao phân tử,

thể rắn, không tan trong nước và có chứa nhóm chức

có khả năng trao đổi

 Gồm 2 loại:

Nhựa trao đổi cation (cationit) Nhựa trao đổi anion (anionit)

 Cationit acid mạnh -SO3

-H+

 Cationit acid yếu -COO-H+

 Anionit base mạnh -N(CH3)3

+

OH

- Anionit base yếu -NH3

+

OH

- Tiến trình trao đổi: (M x+ và A x- : ion chất tan)

 Cation: xRSO3-H+ + Mx+ (RSO3-)xMx+ + xH+

 Anion: xRN(CH3)3+OH- + Ax- [RN(CH3)3+]xAx-+ xOH-

 Pha động thường là các dung dịch đệm có pH và chất điện ly thích hợp

 Pha động có thêm một số dung môi hữu cơ như MeOH, EtOH,…để làm tăng độ hòa tan

hay độ chọn lọc cho chất tan  các ion chất tan cạnh tranh trên mạng ion



 Xét cân bằng trao đổi ion giữa cation B+ và nhựa cationit RSO3

-H+:

 RSO3-H++B+↔ (RSO3-)B++H+

 𝐾𝑐𝑏 = RS O3−B+ [H+]

RS O3−H+ [B+] + Nếu [H + ] trong dung dịch lớn: cân bằng sẽ dịch chuyển sang trái  B + được phản hấp phụ

+ Dùng một dung dịch acid rửa giải cột thì B + sẽ bị đẩy ra khỏi cột  quá trình hoàn

nguyên (tái sinh) nhựa.

+ Nhựa cationit dùng HCl để tái sinh.

+ Nhựa anionit dung NaOH để tái sinh

 Nhận xét:

 Ion có Kcb lớn sẽ bị lưu giữ mạnh trên inoit và ngược lại

 Kcb phụ thuộc điện tích và kích thước của ion đã hydrat hóa

 Chất tan có ái lực khác nhau với nhựa trao đổi ion Kết quả là sẽ có linh độ khác nhau

trong pha tĩnh, sự tách riêng từng chất sẽ xảy ra sau một khoảng thời gian dịch chuyển nhất định trong pha động

 Ứng dụng: tách, định lượng protein, polypeptides, nucleotids, ion, những chất mang điện

tích

 Cột HPLC: có mang pha tĩnh nhóm ionic:

 sulfonic (trao đổi cation)

 tetraalkylamonium (trao đổi anion)

4- Sắc ký rây phân tử (size exclution chromatography)



 Là kỹ thuật sắc ký trong đó sự tách riêng chất tan dựa vào kích thước khác nhau của phân

tử chất tan khi đi qua lỗ trống của các gel

 Các phân tử có kích thước nhỏ bị giữ lại trong lỗ trống của gel nên chuyển động chậm

hơn các phân tử có kích thước lớn hơn (không bị giữ lại)

 Không có bất kỳ một tương tác nào giữa chất tan và pha tĩnh giống như kiểu sắc ký thông thường

 Cơ chế rây phân tử ngược với cơ chế rây cơ học:

 Pha tĩnh là hệ thống gel có các lỗ xốp kích thước cỡ phân tử

 Chất tan trong pha tĩnh đi qua gel bằng kỹ thuật thẩm thấu

 Các phân tử lớn không thẩm thấu được vào các lỗ xốp của pha tĩnh nên được rữa giải bằng thể tích

dung môi bằng với thể tích cột

 Các phân tử nhỏ ở trong hay ngoài gel cần lượng chất rửa giải nhiều hơn

 Các phân tử của chất tan tùy theo kích thước khác nhau có thể chui hoàn toàn hoặc một

phần nào trong lỗ xốp sẽ bị giữ lâu hơn và ra sau cùng

 Các phân tử có kích thước lớn hơn không lọt được vào lỗ xốp của pha tĩnh nên không bị

giữ lại và có linh độ lớn nhất trong pha tĩnh

 Cơ chế của rây phân tử phụ thuộc vào sự khuếch tán chọn lọc của các chất tan qua các lỗ

 Ở trạng thái cân bằng: C s  C m

 C s, C m: nồng độ chất tan trong pha tĩnh và pha động

 Hệ số K được tính theo phương trình: V s

m V R V m

C s

C





+ V m: tổng thể tích của pha động nằm trong các lỗ xốp của các hạt pha tĩnh

+ V S : thể tích dung môi giữa các lỗ

+ V R: thể tích bị lưu giữ của chất tan

 Sắc ký rây phân tử = Sắc ký lọc qua gel = Sắc ký thẩm thấu gel

 Ứng dụng:

 Dùng trong sinh hóa để tách các protein, các carbohydrat,…

 Trong dược liệu

 Tách chất bằng SEC

5- Sắc ký ái lực (affinity chromatography)

 Mới và có tính chọn lọc cao

 Dựa vào tương tác đặc hiệu giữa một loại phân tử chất tan với một phân tử thứ hai liên

kết cộng hóa trị với pha tĩnh

 Ví dụ:

 phân tử liên kết cộng hóa trị với pha tĩnh là một kháng thể của một protein

 Khi cho hỗn hợp gồm hàng ngàn protein qua cột, chỉ có một protein phản ứng với

kháng thể được giữ lại trên cột, các protein còn lại được rửa khỏi cột

 Protein bị giữ lại trên cột sẽ được tách ra khỏi kháng thể bằng cách thay đổi pH hay

nồng độ ion trong pha động





D THEO PHƯƠNG CÁCH LƯU GIỮ PHA TĨNH

1- Sắc ký cột (Column chromatography)

 Pha tĩnh được giữ trong ống nhỏ: sắc ký khí – GC, sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC

 Pha động đi qua pha tĩnh nhờ áp suất hay trọng lực



2- Sắc ký phẳng (planar chromatography)

 Pha tĩnh được cố định trên cột mặt phẳng:

a Sắc ký lớp mỏng

b Sắc ký giấy

 Pha động chuyển qua mặt đó nhờ mao dẫn hoặc tác động của trọng lực

Chất di chuyển nhanh nhất

E THÔNG THƯỜNG

 Phân chia sắc ký theo thiết bị hình thành sắc ký đồ hoặt phân chia theo pha động

1- Sắc ký cột (Column Chromatography, CC)

2- Sắc ký giấy (Paper Chromatography, PC)

3- Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC)

4- Sắc ký khí (Gas Chromatography, GC)

5- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography,

HPLC)

6- Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (Ultra Performance Liquid Chromatography,

UPLC) hoặc UFLC (Ultra Fast Liquid Chromatography)

A SỰ TÁCH SẮC KÝ VÀ SẮC KÝ ĐỒ

sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao

 Xét sự tách 2 chất A và B trên cột

 Tại thời điểm t o , cho hỗn hợp 2 chất này lên cột thì A và B tự phân vào 2 pha

 Thêm một ít dung môi mới vào cột, phần dung môi mới sẽ đẩy dung môi hòa tan A, B xuống phần cột bên dưới

 Có sự phân bố lại A, B giữa 2 pha ở cả 2 phần cột trên và dưới

 Tiếp tục thêm dung môi mới, A và B sẽ bị kéo dần xuống

 Tại thời điểm t1 tách nhau chưa hoàn toàn

 Tại thời điểm t2, 2 dải A và B tách riêng khỏi nhau trên cột  ta có sắc ký đồ ngay trên cột

 Tiếp tục thêm dung môi mới, tại thời điểm t3 dải chất A ra khỏi cột, gặp đầu dò và cho tín hiệu dưới

dạng 1 đỉnh (1 pic)

 Tại t 4 dải B ra khỏi cột lại cho thêm 1 pic

 Ta thu được sắc ký đồ gồm 2 pic riêng biệt ứng với 2 chất A và B

 Vị trí của pic trên trục thời gian là cơ sở để định tính chất tương ứng

 diện tích đỉnh hay chiều cao đỉnh là đặc trưng định lượng của chất

B ẢNH HƯỞNG CỦA TỐC ĐỘ DI CHUYỂN CỦA CHẤT TAN VÀ SỰ MỞ RỘNG DẢI

 Hình 1:

 Tại t1, 2 dải A và B xen phủ nhau 1 phần

 Tại t2, chúng tách khỏi nhau (phần dưới cột)

 Theo thời gian, các dải bị mở rộng làm ảnh hưởng tới việc tách 2 dải cạnh nhau

 Hình 2 mô tả 2 cách làm tăng độ phân giải 2 chất trong hỗn hợp:

 Sắc ký đồ a, 2 pic xen phủ nhau:

+ ta thay đổi điều kiện sắc ký  thay đổi tốc dộ di chuyển của chất tan (tăng tốc độ chất

I và giảm tốc độ chất II) để tách riêng 2 pic (sắc ký đồ b)

+ giảm sự mở rộng dải (giảm sự giãn pic) để tách riêng 2 pic: sắc ký đồ c



 Để tách sắc ký được tốt, cần quan tâm đến tốc độ di chuyển của chất tan và hiện tượng

giãn pic

V- LÝ THUYẾT ĐỘNG HỌC TRONG SẮC KÝ ĐỒ

 Sự giãn pic (sự mở rộng dải) được nghiên cứu qua lý thuyết đĩa và lý thuyết động học

 Sắc ký cột

A HÌNH DẠNG PIC VÀ SỰ GIÃN PIC

1- Hình dạng pic và sự bất đối xứng của pic

 Chất tan di chuyển theo pha động qua pha tĩnh sẽ mở rộng dải và pic trên sắc ký đồ thường trở nên không đối xứng

 Diện tích đỉnh (phần dưới pic) càng gần giống tam giác cân thì phân bố Gaussian càng tốt

 Lý tưởng: hệ số đối xứng =1

 Hệ số đối xứng:

AC

BC

AF  (0,8 < AF < 1,2)

 BC: nửa chiều rộng phía sau của pic được đo ở 1/10 chiều cao của pic

 AC: nửa chiều rộng phía trước của pic được đo ở 1/10 chiều cao của pic

BC AC

A s

2





(1/20 chiều cao)

2- Sự giãn pic (peak spreading) – mở rộng dải (band broadening)

 Hiện tượng đặc biệt trong sắc ký

 Nghiên cứu qua thuyết về đĩa và thuyết động học

 Là kết quả di chuyển nhanh chậm khác nhau của các phân tử cùng một chất khi qua cột

 Pic ra muộn tù hơn pic ra sớm

 Cột sắc ký tốt (hiệu lực cao) sẽ cho pic nhọn (ít bị giãn)



3- Nguyên nhân gây giãn pic

 Khuếch tán xoáy (eddy diffusion): Pha động phải qua các kẽ hở giữa các hạt nhồi trong cột

 Quãng đường di chuyển theo pha động của các phân tử chất tan qua cột không hoàn toàn như nhau  pic giãn rộng ra do di chuyển theo nhiều đường khác nhau

 Phân tử chất tan khuếch tán dọc theo cột (longitudinal diffusion)

 Quá trình phân bố chất tan giữa pha tĩnh và pha động tức là quá trình chuyển khối (mass

transfer) không xảy ra tức thời



 Ảnh hưởng của kích thước hạt nhồi cột:



 Khi cỡ hạt giảm, hiệu lực cột sẽ tăng

 Khi tốc độ dòng tăng, hiệu lực cột giảm

 Dòng chảy tầng:

B LÝ THUYẾT ĐĨA

1- Khái niệm đĩa lý thuyết

 Cột sắc ký được chia thành N lớp

 Ở mỗi lớp, sự phân bố chấ tan vào 2 pha lại đạt đến trạng thái cân bằng

 Những lớp giả định này được gọi là đĩa lý thuyết (không có thực)

 ở mỗi đĩa sẽ diễn ra sự phân bố cân bằng tức thời của chất tan giữa pha tĩnh và pha động

 khi 1 phần mới pha động đưa vào đĩa sẽ làm dịch chuyển cân bằng và một phần chất tan theo pha động sang đĩa tiếp theo, …  nhờ thiết lập cân bằng ở các đĩa nối tiếp như thế, chất tan sẽ được phân bố vào một số đĩa

 Trong số các đĩa, các đĩa ở giữa có nồng độ cực đại so với các đĩa lân cận ở 2 bên

 Cột sắc ký có chiều dài L thì: 𝐍 = 𝐋

𝐇

 Lý thuyết đĩa chưa xem xét các yếu tố trong và ngoài cột ảnh hưởng đến pic sắc ký, làm giãn pic

2- Hiệu lực cột (column efficiency)



2

2 / 1

2

54 , 5

16         

















W

t W

t H

L

 N: số đĩa lý thuyết biểu kiến

 H: chiều cao đĩa lý thuyết

 W: chiều rộng của pic ở đáy pic

 W1/2: chiều rộng của pic đo ở nữa chiều

cao

 N tốt khi N gần bằng Nmax,

p

d

L

Nmax  4000

+ L: chiều dài cột (cm)

+ d p : đường kính hạt pha tĩnh (m)

 Khi cột có hiệu lực cao (H nhỏ, N lớn) thì: W nhỏ (độ giãn pic nhỏ)