HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn
Trang 1Tên chuyên đề: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO(HPLC)-CẤU
TẠO MÁY HPLC-ỨNG DỤNG TRONG
THỰC PHẨM
SV thực hiện: Nguyễn Song Khoa -15116024
Nguyễn Thành Lân –15116025
Lê Ngọc Pha Lê – 15116026
Nguyễn Thị Cẩm Tú-15116060
Thời gian: 13/4/2016
Đánh giá của GV
Trang 1
PHƯƠN
G PHÁP
SẮC KỶ
LỎNG
HIỆU
NĂNG
CAO,
CẤU
TẠO
MÁY
HPLC
-ỨNG
DỤNG
TRONG
THỰC
PHẨM
Trang 2MỤC LỤC A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO(HPLC)…………Trang 3
1. Giới thiệu phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao……… Trang 3
3. Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao……… Trang 5
4. Chọn điều kiện sắc ký……… Trang 7
5. Kỹ thuật tiến hành sắc ký………Trang 10
B-CẤU TẠO MÁY HPLC……… Trang 11
1. Bình chứa pha động……… Trang 11
4. Bộ phận tiêm mẫu ……… Trang 13
C-ỨNG DỤNG……… Trang15
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO(HPLC)-CẤU TẠO MÁY
HPLC-ỨNG DỤNG TRONG THỰC PHẨM
Trang 3A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO(HPLC)
I. Giới thiệu
- HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography ), trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (sắc ký lỏng cao áp) là một công cụ mạnh mẽ dùng trong
phân tích môi trường
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao về cơ bản là một hình thức cải tiến của sắc ký cột Thay vì dung môi qua cột dưới lực hấp dẫn, chúng qua cột dưới áp lực cao lên đến 400 lần áp suất khí quyển Điều này cho phép bạn sử dụng một kích thước hạt nhỏ hơn rất nhiều cho các vật liệu trong cột và một diện tích bề mặt lớn hơn nhiều cho các tương tác giữa các pha và các phân tử được chuyển qua
- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt
- Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…
Khái niệm về kỹ thuật sắc ký
II. Phân loại
Trang 4Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:
• Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography)
• Sắc ký phân bố (partition chromatography)
• Sắc ký ion (ion chromatography)
• Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography)
Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000)
Sắc ký phân bố được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động:
• Sắc ký pha thường – SKPT (normal phase chromatography):
- Trong sắc ký pha thường, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực SKPT dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm
- Cột điển hình có đường kính 4,6 mm (có thể ít hơn), và chiều dài
150-250 mm
- Các hợp chất có cực trong hỗn hợp qua cột sẽ bị giữ trên cột lâu hơn
so với các hợp chất không phân cực Những chất không phân cực do
đó sẽ vượt qua cột nhanh hơn
• Sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography):
- Sắc ký pha đảo là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng SKPĐ Dung môi sử dụng trong SKPĐ là các dung môi phân cực, trong đó dung môi nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền Do
đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn SKPT
- Trong trường hợp này, kích thước cột là như nhau, nhưng silica được thay đổi để làm cho nó không phân cực bằng cách gắn các chuỗi hydrocacbon lên bề mặt của
nó - thường là 8 hoặc 18 nguyên tử carbon Một dung môi cực được sử dụng - ví
dụ, một hỗn hợp của nước và rượu như methanol
- Điều đó có nghĩa các phân tử phân cực sẽ đi qua cột một cách nhanh chóng
- Đảo ngược giai đoạn HPLC là hình thức được sử dụng phổ biến nhất của HPLC
Trang 5III. Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phương pháp săc ký lỏng hiệu năng cao được thực hiện dựa trên việc bơm để đẩy một lượng chất lỏng dưới áp suất cao và hỗn hợp mẫu cần phân tích đi qua một cột được nhồi đầy một loại chất hấp phụ và từ đó dẫn tới việc tách các thành phần của mẫu Chất hấp phụ – được nhồi trong cột, là các hạt rắn (như silica, polymers) với kích thước từ 2 –
50 µm Các thành phần trong hỗn hợp mẫu được tách ra khỏi nhau nhờ vào mức độ tương tác khác nhau với các hạt chất hấp phụ Dòng chất lỏng dưới áp suất cao thường là hỗn hợp của các dung môi (nước, acetonitrile và/hoặc methanol), được gọi là “pha động” Thành phần và nhiệt độ dung môi đóng vai trò chính trong quá trình tách chất do tương tác xảy ra giữa các thành phần của mẫu và chất hấp phụ
Phương pháp sắc ký lỏng là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình vừa có tính chất hóa học lại vừa có cả tính chất lý học Nó là những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động, là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan ( hỗn hợp mẫu phân tích) theo từng lớp chất trong cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách Trong quá trình đó chất tan luôn luôn được phân bố lại giưa hai pha, trong khi pha động chảy liên tục qua cột tách với một thành phần pha động nhất định, hay gradient Nghĩa là đối với một phân tử chất tan, thì trong quá trình sắc ký, nó luôn chuyển từ pha này sang pha kia nhiều lần từ đầu cột đến cuối cột sắc ký Mặt khác, cũng vì cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử của chất tan là khác nhau nên tốc độ dịch chuyển trung bình của mỗi chất tan là khác nhau Khi ở trong pha động, nó chuyển dịch theo tốc
độ của dòng pha dộng, còn khi ở trên pha tĩnh nó lại không dịch chuyển, mà bị pha tĩnh giữ lại Như vậy là có một khoảng thời gian nhất định chất tan bị giữ lại trong cột tách sắc
ký, thời gian này phụ thuộc vào bản chất sắc ký của cột pha tĩnh, cũng như tính chất và cấu trúc của mỗi chất tan khác nhau đồng thời phụ thuộc vào bản chất của thành phần pha động dùng để rửa giải chất tan, có chất tan ít bị lưu giữ, điều đó dẫn đến kết quả là có quá trình tách của các chất xảy ra trong cột sắc ký
Quá trình tách chất có thể xảy ra theo ba cơ chế chính như sau:
• Tương tác hấp thụ
Trang 6• Tương tác trao đổi ion
• Tương tác theo cơ chế rây phân tử
Tương ứng với ba cơ chế trên có ba phương pháp tiến hành tách khác nhau:
• Sắc ký hấp thụ ( hấp thụ pha thường NP – HPLC và hấp thụ pha ngược RP- HPLC)
• Sắc ký trao đổi ion ( EX- HPLC)
• Sắc ký rây phân tử (Gel – HPLC)
Tóm lại: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách chất
trong đó xảy ra quá trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứa các chất nhồi kích thước nhỏ, chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ thuộc vào hệ số phân bố của nó Các chất nhồi cột có kích thước đủ nhỏ để đáp ứng hiểu quả tách sắc ký tốt Thành phần pha động có thể thay đổi để đạt được lực rửa giải phù hợp nhất Sau khi chất tan chuyển tới cuối cột tách được chuyển tới detector để phát hiện Tùy thuộc vào bản chất của chất tan
mà dùng các loại detector khác nhau
TÓM GỌN NGUYÊN TẮC :
- Pha động là chất lỏng
- Pha tĩnh là chất rắn ( chứa trong cột dưới dạng tiểu phân hoặc là chất lỏng đã phủ lên chất mang rắn, hoặc chất đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ
- Ở pha động, chất lỏng được di chuyển qua một cột chứa pha tĩnh
- Hỗn hợp các chất được tạo ở đầu cột và phân tách ra khi hỗn hợp này đi qua cột)
Trang 7- Từng thành phần này (peaks) được nhận biết bằng các máy Detector và kết quả được ghi lại ở hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu
IV. Chọn điều kiện sắc ký
Muốn cho kết quả tốt nhất ta phải tìm được các điều kiện sắc ký tốt nhất cho một hỗn hợp mẫu
Các điều kiện đó bao gồm:
• Pha tĩnh :
- Loại pha tĩnh
- Kích thước cột
• Pha động:
- Thành phần và tỷ lệ ,pH , tốc độ dòng, nhiệt độ Nếu là chương trình rửa giải Isocratic
- Thành phần và tỷ lệ ,pH , tốc độ dòng, nhiệt độ và chương trình dung môi Nếu là chương trình rửa giải Gradient
•Hệ thống trang bị:
-Loại Detector
-Van tiêm mẫu, thể tích tiêm
-Hệ đường dẫn
-Các yếu tố khác (nhiệt độ, độ nhảy của Detector, bước sóng phân tích)
Lựa chọn pha tĩnh
- Dựa vào các thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp có thể là cột pha thuận, cột pha đảo hay các loại cột khác
- Chúng ta thông thường dùng 02 loại cột pha thuận (NP) và cột pha đảo ( RP)
- Ngoài ra ta có thể dùng một số loại cột khác như cột CN,cột NH2 ,
• Cột pha thuận (NP): Silicagel trung tính
- Pha tĩnh : Cột này là loại cột dùng để tách các chất không phân cực hay ít phân cực Trên
bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm OH phân cực ưa nước
Trang 8- Ví dụ: Cột Lichrosorb Si 40,Si 60 Cấu tạo cột như sau :
OH OH OH
O S OSi O Si O
OH OH OH
- Pha động : dùng cho loại này là các dung môi không phân cực hay ít phân
cực như : Methanol,Benzen,Acetonitril,Chlorofoc
• Cột pha đảo ( RP) : ( Silicagel đã Alkyl hóa )
- Pha tĩnh : Dùng để tách các chất không phân cực ,ít phân cực ,các chất phân
cực có thể tạo cặp Ion Trên bề mặt hoạt động các nhóm OH đã bị Alkyl hóa tức là thay thế nguyên tử H bằng các mạch Carbon thẳng ( C8 hay C18 tương đương RP
8 hay RP 18) hay các mạch Carbon vòng( Phenyl- tương đương cột Phenyl ) vì thế
nó ít phân cực hay phân cực rất ít
Ví dụ: cột Lichrosor -Lichrospher RP 8 ODS, Cột Nucleosil C18
- Pha động: Pha động dùng trong loại này là các dung môi có phân cực
như :Methanol ,Acetonitril,,nước hay các loại dung dịch đệm ,hỗn hợp của các dung môi-đệm
Lựa chọn pha động :
- Dựa vào các thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất có trong mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của peak đã trình bày đồng thời phải có thời gian phân tiïch phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi,hóa chất,thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu
sự hoạt động của thiết bị
- Pha động có thể thay đổi:
Trang 9+ Độ chọn lọc α
+ Thời gian lưu
+ Hiệu năng tách của cột
+ Độ phân giải
+ Tính đối xứng của Peak
Do đó ,Trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành phần phù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất đối với hỗn hợp các chất cần phân tích Chính vì vậy pha động cần có những yêu cầu sau:
+ Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có Không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học ( vd giá trị pH : 2.5< pH <8.5)
+ Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng ( đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không làm tủa các chất có trong cột ,hay pha động có sẵn trong cột vd : đệm phosphat rửa ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên column)
+ Pha động phải bền vững theo thời gian : càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất là chúng là pha động không bị phân hủy trong suốt thời gia phân tích mẫu )
+ Phải có độ tinh khiết cao : dung môi cho HPLC, hoá chất tinh khiết để phân tích + Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký
+ Phải phù hợp với loại Detector : vd UV - VIS thì dung môi không được hấp thụ quang (vd acid acetic ở bước sáng thấp < 220 nm) Detector huỳnh quang thì dung môi không được phát quang
+ Phải kinh tế ,không quá hiếm và đắt
Trang 10Trong hệ sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP - HPLC) pha động là dung môi phân cực là : Nước,ACN,MeOH ,acid hay Base hữu cơ và một vài Amin hay Aminoacid
+ Do sự thêm nước vào dung môi hữu cơ tạo thành một pha động phân cực hơn chất hữu cơ nguyên một mình nó
Ví dụ: thêm nước vào ACN hay MeOH Sẽ tạo được pha động phân cực hơn nó
Tất nhiên độ phân cực phụ thuộc vào tỷ lệ nước được thêm vào
+ Ngòai các dung môi chính thì trong thành phần pha động trong rất nhiều trường hợp tách RP- HPLC còn có thêm hỗn hợp đệm pH để ổn định pH.Chất tạo phức,tạo cặp ion để tạo ra sự rửa giải tốt nhất
+ Khi chọn dung môi ta thường dựa vào lực rửa giải E của dung môi theo bảng sau:
V. Kỹ thuật tiến hành sắc ký
1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc:
+ Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy họat động tốt cho kết quả phân tích có độ đúng,độ lặp lại,tuyến tính,tỷ lệ dung môi ,tốc đô dòng,năng lượng đèn đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra
+ Đặc biệt cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi ngờ về khả năng tách ,và rửa đúng qui định sau mỗi lần chạy sắc ký :
2. Chuẩn bị dung môi pha động :
+ Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết HPLC
+ Các hóa chất dùng phải là loại PA
Trang 11+ Pha dung môi đúng ,chính xác theo đúng tỷ lệ, ,để ổn định dung môi đúng thời gian theo chuyên luận đã yêu cầu Lọc dung môi qua màng lọc 0.2 - 0.45 µm ,Siêu âm đuổi bọt khí
3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC:
+ Mẫu Thử : Xử lý mẫu thử theo đúng chuyên luận ,qui trình theo nguyên tắc :
• Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động ,trong nhiều trường hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu
• Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rưẳ giải được bằng cách lọc hay chiết
• Phải lọc và ly tâm ,lọc mẫu qua màng lọc 0.2 - 0.45 µm
• Nồng độ mẫu ở mức vừa phải,không vượt quá khả năng tách của cột.Có thể gây
ra nghẽn cột
+ Mẫu chuẩn : Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi ,riêng về nồng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất ,ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần
4. Cách do HPLC
Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuôcü vào hãng sản xuất ,phần mền sắc ký Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tắc sau :
+ Chạy máy với dung môi pha động để đuỏi hết bọt khí có trong hệ thống ống dẫn trước khi cho vào cột
+ Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký như:
• Cấu hình máy
• Tỷ lệ các dung môi pha động
• Bước sóng, thành phần, các thông số của quá trình phân tích yêu cầu
B-CẤU TẠO MÁY HPLC
Trang 12Máy HPLC
CẤU TẠO MÁY HPLC
*Trong đó
1 Bình chứa pha động
2 Bộ phận khử khí
3 Bơm cao áp
4 Bộ phận tiêm mẫu
5 Cộ sắc ký (pha tĩnh)
6 Đầu dò
7 Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống
8 In dữ liệu
Trang 131 Bình chứa pha động.
• Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng
tỉ lệ của 4 đường là 100%
Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà thường sử dụng 2 hoặc 3 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn giúp ổn định quá trình rửa giải
• Lưu ý: Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết sử dùng cho HPLC Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đều phải là hóa chất tích khiết dùng cho phân tích.Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên các peak tạp trong quá trình phân tích
2 Bộ phận khử khí Degases