Trình bày nguyên tắc phương pháp sắc ký lỏng pha thường (NPLC); cấu tạo máy GC, đưa ra và nói rõ một số ứng dụng trong thực phẩm.

Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động Trong thí nghiệm của Tvest: p

TÊN CHUYÊN ĐỀ

Trình bày nguyên tắc phương pháp sắc ký lỏng pha thường (NP-LC); cấu tạo máy GC, đưa ra và nói rõ một

Sinh viên thực hiện:

1 Lại Đào Hiếu Hạnh 15116017

2 Bùi Thị Thanh Hằng 15116018

3 Huỳnh Quang Thúy Hằng 15116019

4 Phạm Trọng Hiếu 15116020

Thời gian thưc hiện: Sáng Thứ 5

Đánh giá của giảng viên:

1

PHƯƠNG PHÁP SẮC LỎNG KÝ PHA THƯỜNG ( NP-LC)

CẤU TẠO MÁY GC - ỨNG DỤNG TRONG THỰC PHẨM

*Lịch sử:

Năm 1903, nhà bác học Nga Michael Tswett đã cho dung dịch các sắc tố thực vật trong ete dầu hoả lên cột nhồi bột mịn canxi cacbonat, ông thấy các sắc tố bị hấp phụ lên trên đầu cột Khi cho ete dầu hoả lên cột, các sắc tố di chuyển trong cột từ trên xuống dưới, mỗi sắc tố có một tốc độ riêng, tách thành những vùng hay vòng màu xếp chồng lên nhau, hình thành một hệ mà Tvest gọi đó là sắc đồ Ông đặt tên cho phương pháp tách này

là sắc ký (Chromatography) Trong tiếng Hy Lạp,“chroma” có nghĩa là chất màu,

graphein có nghĩa là viết Tên gọi này ngày nay vẫn được sử dụng mặc dù phương pháp này còn được dùng tách các chất không màu

Đến thập kỷ 1930-1940, phương pháp này được phát triển nhanh chóng với nhiều

kỹ thuật khác nhau như sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực,

Năm 1954, Mould D.L phát triển sắc ký gel để tách các hợp chất mang điện tích theo trọng lượng phân tử của chúng Đến năm 1964, Moor gọi là “gel permeation

chromatography” hay gọi là sắc ký lọc gel

Năm 1906, sắc ký khí được biết đến nhưng đến 1952, kỹ thuật này mới phát triển mạnh mẽ, nhất là trong thập niên 1960

Năm 1967, Horvath C là tác giả tạo máy sắc ký lỏng cao áp

I.Phương pháp sắc ký lỏng khí pha thường:

1.Các khái niệm về sắc ký:

a.Khái niệm sắc ký:

Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dừng để tách các thành phần của một hỗn hợp Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động (Trong thí nghiệm của Tvest: pha tĩnh là canxi cacbonat, pha động là ete dầu hoả) Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu Khi các thành phần này di chuyển qua

hệ thống sắc ký với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau theo thời gian Mỗi

một thành phần đi qua hệ thống trong một khoảng thời gian riêng biệt, gọi là thời gian lưu Trong kỹ thuật sắc ký, hỗn hợp được chuyên chở trong chất lỏng hoặc khí và các thành phần của nó được tách ra do sự phân bố khác nhau của các chất hòa tan khi chúng chảy qua pha tĩnh rắn hoặc lỏng Nhiều kỹ thuật khác nhau đã được dùng đểphân tích hợp chất phức tạp dựa trên ái tính khác nhau của các chất trong môi trường động khí hoặc lỏng và đối với môi trường hấp phụtĩnh mà chúng di chuyển qua như giấy, gelatin hay gel magnesium silicate, Sắc ký là phương pháp để phân tách và tinh sạch các phân tử sinh học Sắc ký là phương pháp nhanh, dễ dàng và không ảnh hưởng đến protein, đây là phương pháp được đề nghịtrong nghiên cứu định lượng protein hay các phân tử

2.Khái niệm và nguyên tắc phương pháp sắc ký lỏng:

a.Khái niệm sắc ký lỏng:

Sắc ký lỏng là phương pháp tách sắc ký các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là một chất lỏng chảy qua pha tĩnh chứa trong cột

_ Sắc ký lỏng được tiến hành chủ yếu dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion,loại trừ theo kích thước hoặc tương tác hoá học lập thể

b.Phương pháp sắc ký lỏng pha thường:

b.1.Nguyên tắc chung sắc ký lỏng:

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký

+ Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo + Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion

+Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết

+Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký sel hay rây phân tử

Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột ,chúng ta cần có một pha động

Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A,B,C Vào cột phân tích ,kết quả các chất A,B,C Sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột.Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác

_ Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử

3

_ Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột ,chúng ta cần có một pha động

Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A,B,C Vào cột phân tích ,kết quả các chất A,B,C Sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột.Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác

F1 F2

F3

Tổng của 03 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa rải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất ( F1) và ngược lại

Đối với mỗi chất ,sự lưu giữ được qui định bởi 03 lực F1,F2,F3 Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn

Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột

Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau ,Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột ( như hình dưới đây )

Chất phân tích A+B+C

b.2.Một số đặc điểm phương pháp sắc ký lỏng pha thường:

Không phải là hình thức được sử dụng phổ biến nhất của HPLC

Cột được làm đầy với các hạt silica nhỏ xíu, và dung môi không phân cực -

hexane, ví dụ Một cột điển hình có đường kính 4,6 mm (có thể ít hơn), và chiều dài

150-250 mm

Các hợp chất có cực trong hỗn hợp qua cột sẽ bị giữ trên cột lâu hơn so với các hợp chất không phân cực Những chất không phân cực do đó sẽ vượt qua cột nhanh hơn

b.3.Đặc trưng cơ bản xảy xa trong phương pháp sắc ký lỏng pha thường:

_ Trong hệ thống sắc ký đầu tiên người ta sử dụng:

+ CaCO3 làm chất nhồi cột ( pha tĩnh)

+ Petroleum ether làm dung môi pha động

 Cột mang tính phân cực và pha động mang tính không phân cực

_ Các loại cột sử dụng trong sắc lỏng ký pha thường:

+ Cột Silica gel: dùng đa mục đích

5

-Si-CH 2 CH 2 CH 2 CN -Si-CH 2 CH 2 CH 2 NH 2

-Si-CH CH CH OCH(OH)CH (OH)

+ Cột Cyano:dung đa mục đích.

+ Cột Amino: phân tích đường

+ Cột Diol: phân tích protein

Silica gel Silica gel biến tính _ Liên kết Hydrogen:

+ Chất phân tích có nhóm : Carboxyl (-COOH), Amino (-NH2), Hydroxyl (-OH)

=>lien kết hydrogen sẽ mạnh

+ Nếu mẫu có nhóm tert-butyl hoặc các nhóm không phân cực lớn thì do chướng ngại lập thể =>lien kết hydrogen sẽ yếu

Dung môi pha động sử dụng cho sắc ký lỏng pha thường:

+ Dung môi chủ yếu:

Hydrocarbons (Pentane, Hexane, Heptane, Octane)

Si Si

Aromatic Hydrocarbons (Benzene, Toluene, Xylene)

Methylene Chloride

Chloroform

Carbon Tetrachloride…

+Dung môi phụ:

Methyl-t-butyl ether

Diethyl ether

Tetrahydrofuran

Methanol

Dung môi chủ yếu được sử dụng làm pha động, dung môi phụ thường được thêm vào với tỉ lệ nhất định để thay đổi thời gian lưu

Các dung môi thường không hấp thu vào trong vùng UV để dễ dàng cho việc xác định

II.Cấu tạo máy GC:

Hệ thống sắc ký khí bao gồm các thành phần cơ bản như sau:

1.Nguồn cung cấp khí mang:

7

Có thể sử dụng bình chứa khí hoặc các thiết bị sinh khí (thiết bị tách khí N2 từ không khí, thiết bị cung cấp khí H2 từ nước cất,…)

2 Lò cột:

Dùng để điều khiển nhiệt độ cột phân tích

3 Bộ phận tiêm mẫu:

Bộ phận tiêm mẫu dùng để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đổi Khi đưa mẫu vào cột, có thể sử dụng chế độ chia dòng (split) và không chia dòng (splitless)

Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động

(Autosamper – có hoặc không có bộ phận hóa hơi - headspace)

4 Cột phân tích:

Có 2 loại cột: cột nhồi và cột mao quản

+Cột nhồi (packed column): pha tĩnh được nhồi vào trong cột, cột có đường ính 2-4mkm

và chiều dài 2-3m

+Cột mao quản (capillary): pha tĩnh được phủ mặt trong (bề dày 0.2-0.5µm), cột có đường kính trong 0.1-0.5mm và chiều dài 30-100m

Cột nhồi và cột mao quản

5 Đầu dò:

Các loại đầu dò thông dụng bao gồm đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID) và đầu dò dẫn nhiệt (TCD) Cả 2 loại đầu dò này đều nhạy với hầu hết chất phân tích với các nồng độ khác nhau

_ Đầu dò dẫn nhiệt (TCD): Loại đầu dò thông dụng nhất hiện nay, dựa trên độ dẫn nhiệt của vật chất khi đi quanh một sợi dây Vonfram-rhenium có dòng điện chạy qua Khi các phân tử chất cần phân tích tách ra khỏi cột và hòa trộn với khí mang, độ dẫn nhiệt sẽ giảm

đi, nhiệt độ và điện trở của dây Vonfram-Rhenium tăng lên làm xuất hiện thay đổi điện áp

và tạo ra tín hiệu để đầu dò phát hiện được

_ Đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID): chỉ dùng phát hiện các hợp chất hữu cơ hay các hợp chất chứa hydro carbon do carbon có khả năng hình thành các ion dương và điện tử trong quá trình nhiệt phân, từ đó tạo ra dòng điện giữa các điện cực Hiện tượng tăng dòng điện được chuyển đổi và hiển thị dưới dạng các peak trên sắc ký đồ

_ Đầu dò đốt xúc tác (CCD): dùng để xác định các hydrocarbon cháy được và hydro _ Đầu dò phóng ion (DID): sử dụng thiết bị phóng điện điện áp cao để tạo ra ion

_ Đầu dò độ dẫn điện phân khô (DELCD): sử dụng một pha khí và nhiệt độ cao dùng để xác định các hợp chất clo

_ Đầu dò bẫy điện tử (ECD): sử dụng nguồn phóng xạ beta để đo khả năng bẫy điện tử _ Đầu dò quang kế ngọn lửa (FPD): sử dụng một ống nhân quang để phát hiện các vạch quang phổ của các hợp chất khi chúng bị đốt trong ngọn lửa, phân tích các hợp chất chứa photpho, lưu huỳnh, các Halogen, một số kim loại

_ Đầu dò phát xạ nguyên tử (AED): mẫu sau khi ra khỏi cột sẽ được đưa vào một buồng được hoạt hóa bằng siêu âm tạo ra một trường plasma phân hủy các nguyên tố sẽ tạo ra một phổ phát xạ nguyên tử

_ Đầu dò Nitơ – Phospho (NPD): là một dạng đầu dò nhiệt điện tử trong đó Nitơ và Phospho làm thay đổi chức năng làm việc trên một lớp được bao bằng cuộn sinh nhiệt đặc biệt làm phát sinh ra dòng điện đo đạc được

_ Đầu dò khối phổ (MS), hay còn gọi là GC-MS có độ nhạy và hiệu quả cao kể cả đối với lượng mẫu nhỏ

Một số loại khác:

+ Đầu dò quang hóa ion (PID) + Đầu dò ion hóa phóng xung (PDD) + Đầu dò ion hóa nhiệt (TID)

+ Đầu dò cực tím chân không (VUV)

9

+ Đầu dò hồng ngoại (IRD) + Đầu dò ion hóa Heli (HID) + Đầu dò độ dẫn điện phân (ELCD)…

6 Bộ phận ghi nhận tín hiệu:

Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện

Đối với các hệ thống HPLC hiện đại, phần này được phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan đến peak như tính đối xứng, hệ

số phân giải,… đồng thời tính toán, xử lý các thông số liên quan đến kết quả phân tích

7 In dữ liệu

Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển

*Một số hệ thống GC tại CASE

Cùng với sự phát triển của kỹ thuật sắc ký, sắc ký khí là công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu khoa học đặc biệt trong lĩnh vực hóa học phân tích Phương pháp sắc ký khí là một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến trong việc phân tích các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi trong các loại nền mẫu

Tại CASE, các hệ thống sắc ký khí của các hãng sản xuất thiết bị phân tích nổi tiếng như Shimadzu (GC 2010, GC 2010 Plus), Perkin Elmer, Varian (3800), Thermo Finnigan (Trace GC),… với các đầu dò như FID, ECD, NPD, FPD, TCD, MS có khả năng phân tích được các hợp chất hữu cơ có bản chất khác nhau Các hệ thống GC đều có gắn các bộ phận chích mẫu tự động (Autosampler) và bộ phận hóa hơi (Headspace)

Hệ thống GC Varian 3800

Hệ thống GC Shimadzu 2010

Hệ thống GC Shimadzu 2010 Plus

11

III.Phân tích định lượng:

Chuẩn bị mẫu: cũng như mọi phương pháp khác, mẫu đem phân tích được lấy mẫu sao đại diện đúng cho cả lô nguyên liệu hay sản phẩm Các qui tắc lấy mẫu cần phải tuân thủ cho từng loại mẫu Mẫu cần được làm sạch trước khi tiêm mẫu vào GC Việc này nếu làm không tốt có thể gây nên mất cấu tử cần xác định

Tiêm mẫu: khi chất lỏng tiêm vào buồng tiêm mẫu thì nhiệt độ thiết lập nếu quá cao có thể gây nên sự phân hủy mẫu, hoặc mẫu có tham dự vào một phản ứng nào đó Kỹ thuật tiêm mẫu cũng có thể gây sai số

Mẫu bị phân hủy hoặc bị hấp phụ: có nhiều trường hợp có sự phân hủy hoặc hấp phụ trong buồng tiêm mẫu, trong cột, trong detector có thể làm cho các pic đó không đại diện cho lượng của chúng có trong mẫu Để khắc phục điều này ta nên dùng phương pháp lập đường chuẩn để biết diện tích hay chiều cao của pic có tỉ lệ tuyến tính với lượng mẫu đưa vào hay không Đáp ứng của detector: mỗi detector đáp ứng khác nhau với các hợp chất khác nhau Vì vậy cần biết rõ các hệ số đáp ứng này Hơn nữa khi điều kiện làm việc thay đổi thì đáp ứng của detector cũng thay đổi Trong GC có thể sử dụng phương pháp chuẩn nội để khắc phục điều này Kỹ thuật lấy tích phân: trong GC có nhiều cách thiết lập quan hệ giữa thông tin nhận được từ pic sắc kí với hàm lượng của cấu tử: Đo chiều cao pic, dùng máy ghi và tích phân, cắt và cân giấy Các cách này có thể có những sai số riêng trong quá trình xử lí Ngày nay với sự ghép nối máy tính và các phần mềm hỗ trợ việc tích phân hóa diện tích các pic trở nên dễ dàng và thông dụng Kết quả được báo cáo đầy đủ các thông tin của pic như chiều cao pic, diện tích pic, phần trăm trong mẫu …

- Các phương pháp tính toán định lượng:

***Phương pháp chuẩn hóa diện tích

Đây là phương pháp tính thành phần phần trăm của mẫu bằng cách đo diện tích từng pic trên sắc kí đồ Theo cách này đem diện tích pic của chất quan tâm A cho tổng diện tích

của các pic:

%A = (diện tích pic A/tổng diện tích các pic)x100 %

Khi phân tích thành phần có điểm sôi sát nhau của một dãy đồng đẳng, phương pháp này có thể dùng để tính tỷ lệ phần trăm khối lượng

Phương pháp này chỉ đúng nếu tất cả các cấu tử đều được rửa giải và đáp ứng của detector với mọi cấu tử là giống nhau Nếu những điều kiện này thỏa mãn thì đây là phương pháp nhanh và hiệu quả

*** Phương pháp tính theo hệ số hiệu chỉnh

Như đã biết detector đáp ứng khác nhau đối với các chất khác nhau Vì vậy cần phải tính hệ số hiệu chỉnh Nhờ hệ số này có thể tính được thành phần phần trăm của các cấu tử trong mẫu

Cách xác định hệ số hiệu chỉnh:

Tiêm dung dịch chuẩn đã biết nồng độ các cấu tử A, B, C… vào GC

Sắc kí đồ thu được có các pic phân giải hoàn toàn và diện tích thu được tương ứng

SA , SB , SC… tương ứng với các khối lượng trong mẫu mA, mB, mC …

Chọn một pic làm chuẩn ví dụ A có tỉ lệ SA/mA được gán giá trị F = 1

Từ tỉ lệ SB/mB, SC/mC… suy ra FB, FC…

*** Phương pháp lập đường chuẩn

Lập các đường chuẩn riêng rẽ đối với từng cấu tử trong hỗn hợp bằng cách tiêm những thể tích bằng nhau của một loạt dung dịch hỗn hợp chất chuẩn có nồng độ khác nhau

Như vậy một loạt các nồng độ của các chất chuẩn đã được phân tích và diện tích của chúng được xác định Một đường chuẩn được dựng cho mỗi cấu tử với một trục nồng

độ và trục kia là diện tích tương ứng để kiểm tra sự tuyến tính của đáp ứng của detector

Tiêm cùng thể tích của mẫu có các cấu tử cần phân tích và chạy sắc kí trong cùng điều kiện như khi chạy chuẩn

Từ các diện tích thu được của các cấu tử cần phân tích và đường chuẩn vừa thiết lập suy ra được nồng độ của chúng

*** Phương pháp dùng chuẩn nội

13

%A dientichcua A / F(A) (dientichcua Ai / F (Ai))