định danh vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn gây bệnh cháy bìa lá lúa phân lập tại an giang

Mục tiêu của đề tài là định danh được 2 chủng vi khuẩn NMCM2 và VTTS1 phân lập tại An Giang có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn Xoo trên đĩa thạch và giúp giảm bệnh cháy bìa lá trong

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỊNH DANH VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG VỚI

VI KHUẨN GÂY BỆNH CHÁY BÌA LÁ LÚA

PHÂN LẬP TẠI AN GIANG

MSSV: 3102795 LỚP: CNSH K36

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỊNH DANH VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG VỚI

VI KHUẨN GÂY BỆNH CHÁY BÌA LÁ LÚA

PHÂN LẬP TẠI AN GIANG

MSSV: 3102795 LỚP: CNSH K36

Cần Thơ, tháng 11/2013

PHẦN KÝ DUYỆT

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

Trong thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp tại trường Đại học Cần Thơ, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và động viên từ gia đình, sự hướng dẫn và chỉ dạy tận tình của quý thầy cô cùng sự giúp đỡ nhiệt tình của bạn bè để hoàn thành được luận văn tốt nghiệp này

Đầu tiên xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo cùng tất cả quý thầy cô Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã tận tình truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện cho em học tập, nghiên cứu

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Đắc Khoa, người đã tận tâm dìu dắt, chỉ dẫn và truyền đạt những kiến thức cũng như kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập cũng như trong quá trình thực hiện thí nghiệm và viết luận văn Xin chân thành biết ơn cô Trần Thị Xuân Mai, cô Nguyễn Thị Liên và cô Nguyễn Thị Pha – Phòng Thí nghiệm Công nghệ Gen Thực vật thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt quá trình học tập tại Viện cũng như trong thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp Đại học

Thân gửi đến chị Võ Thị Phương Trang, anh Trần Quốc Tuấn, anh Trần Văn Bé Năm, anh Đỗ Tấn Khang, anh Trần Văn Điệp và anh Trần Minh Đức lời cảm ơn chân thành vì đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn Chân thành cảm ơn bạn Nguyễn Văn Cà, bạn Nguyễn Hoàng Khuyên và em Phan Trần Khải đã nhiệt tình giúp

đỡ, động viên và cho tôi những lời khuyên bổ ích trong thời gian học tập cũng như lúc thực hiện đề tài

Xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến cha mẹ đã luôn ủng hộ tôi về mọi phương diện, là sức mạnh tinh thần giúp tôi vươn lên trong cuộc sống

Cuối lời, xin chúc cha mẹ, quý thầy cô và các anh chị luôn dồi dào sức khỏe và luôn thành công trong mọi lĩnh vực

Cần Thơ, ngày 27 tháng 10 năm 2013

Nguyễn Văn Vinh

TÓM TẮT

Bệnh cháy bìa lá (bạc lá) do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây ra

là một trong những bệnh nghiêm trọng trên ruộng lúa Mục tiêu của đề tài là định danh được 2 chủng vi khuẩn NMCM2 và VTTS1 phân lập tại An Giang có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn Xoo trên đĩa thạch và giúp giảm bệnh cháy bìa lá trong điều kiện nhà lưới, tạo tiền đề cho việc sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh này Quá trình định danh vi khuẩn được thực hiện bằng cách kết hợp giữa phương pháp truyền thống sử dụng

Hệ thống phân loại Bergey và phương pháp hiện đại sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn

Chủng vi khuẩn NMCM2 là Bacillus stratophericus và chủng VTTS1 là Bacillus safensis Kết quả sử dụng Hệ thống phân loại Bergey cho thấy 2 chủng vi khuẩn NMCM2

và VTTS1 có khuẩn lạc màu trắng, tròn, lài và bìa gợn sóng trên môi trường thạch dinh dưỡng Cả 2 là vi khuẩn Gram dương, hình que, sinh nội bào tử, sống riêng lẻ, có khả năng di động và kích thước lần lượt là 0,7-0,9 x 1,2-2,7 µm và 0,5-0,7 x 1,0-1,2 µm Các chủng vi khuẩn này không thuộc nhóm kỵ khí bắt buộc, cho phản ứng catalase dương tính

và có khả năng sử dụng nguồn carbon myo-inositol để sinh trưởng; trong đó, chủng NMCM2 mẫn cảm với kháng sinh ampicillin Kết quả của kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA của 2 chủng vi khuẩn cho thấy sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rRNA bằng cặp mồi tổng 27F và 1492R hiện băng rõ và không có băng phụ, kích thước khoảng 1500 bp

Số nucleotide được giải trình tự của 2 chủng vi khuẩn NMCM2 và VTTS1 tương đối cao, lần lượt là 770 và 780 Độ tương đồng cao nhất khi so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng NMCM2 với cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI là 92% và của chủng VTTS1 là 94% Khi định danh vi khuẩn, cần kết hợp linh hoạt giữa phương pháp truyền thống (sử dụng hệ thống phân loại của Bergey) và phương pháp hiện đại (giải trình tự gen 16S rRNA để tiết kiệm chi phí, thời gian và cho kết quả đáng tin cậy Hai vi khuẩn B stratophericus và B safensis không thuộc nhóm độc hại đối với môi trường, con người, động vật và cây trồng nên có triển vọng được dùng để sản xuất chế sinh học phòng trừ bệnh cháy bìa lá lúa sau khi thử nghiệm thành công trong điều kiện ngoài đồng

Từ khóa: định danh, Bacillus stratophericus, Bacillus safensis, cháy bìa lá, bạc lá,

MỤC LỤC

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM TẮT

MỤC LỤC

DANH SÁCH BẢNG

DANH SÁCH HÌNH

TỪ VIẾT TẮT

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

1.2 Mục tiêu đề tài

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Bệnh cháy bìa lá lúa

2.1.1 Lịch sử

2.1.2 Triệu chứng

2.1.3 Tác nhân gây bệnh

2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh

2.2 Biện pháp phòng trừ bệnh

2.2.1 Biện pháp canh tác

2.2.2 Biện pháp sử dụng giống kháng

2.2.3 Biện pháp hóa học

2.2.4 Biện pháp sinh học

2.3 Phương pháp định danh vi khuẩn

2.3.1 Phương pháp truyền thống - Hệ thống phân loại Bergey

2.3.1.1 Khảo sát hình thái và cấu tạo của vi khuẩn

i

ii

v

vi viii

1

1

2

3

3

3

4

6

7

8

8

8

9

9

11

11

11

2.3.1.2 Khảo sát các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn

2.3.2 Phương pháp hiện đại - Giải trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn

2.3.2.1 Ly trích vật liệu di truyền của vi khuẩn

2.3.2.2 Khuếch đại đoạn gen 16S rRNA của vi khuẩn

2.3.2.3 Điện di sản phẩm PCR

2.3.2.4 Giải trình tự đoạn gen 16S rRNA

2.3.2.5 So sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA với cơ sở dữ liệu

2.4 Một số nghiên cứu định danh vi khuẩn gần đây

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện

3.1.1 Thời gian

3.1.2 Địa điểm

3.1.3 Vật liệu thí nghiệm

3.1.4 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

3.1.4.1 Dụng cụ thí nghiệm

3.1.4.2 Thiết bị thí nghiệm

3.1.5 Hóa chất

3.2 Phương pháp

3.2.1 Phương pháp truyền thống-Hệ thống phân loại Bergey

3.2.1.1 Khảo sát hình thái và cấu tạo của vi khuẩn

3.2.1.2 Khảo sát các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn

3.2.2 Phương pháp hiện đại - Giải trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn

3.2.2.1 Kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA

3.2.2.2 So sánh trình tự với cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả sử dụng hệ thống phân loại Bergey

15

19

19

20

21

21

22

22

24

24

24

24

24

24

24

24

24

25

25

25

27

28

28

32

34

34

4.2 Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn .

4.3 Định danh vi khuẩn bằng cách kết hợp khảo sát các đặc tính sinh hóa với kết quả giải trình tự gen 16S rRNA

4.3.1 Chủng vi khuẩn NMCM2

4.3.2 Chủng vi khuẩn VTTS1

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận

5.2 Đề nghị

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

Tiếng Anh

Website

PHỤ LỤC

39

44

44

47

50

50

51

52

52

56

61

Các đặc tính khác nhau giữa các nhóm vi khuẩn sinh nội bào tử trong

nhóm 18 của Hệ thống phân loại Bergey .Giá trị OD, nồng độ DNA ban đầu và nồng độ DNA sau pha loãng

Các đặc tính dùng để phân biệt hai vi khuẩn Bacillus stratophericus và

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1

Hình 2

Hình 3

Hình 4

Hình 5

Hình 6

Hình 7

Hình 8

Hình 9

Hình 10

Hình 11

Hình 12

Hình 13

Hình 14

Hình 15

Hình 16

Triệu chứng bệnh cháy bìa lá trên ruộng lúa

Giọt dịch vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae

Phân nhóm vi khuẩn hình cầu và hình que Gram âm

Phân nhóm vi khuẩn hình cầu và hình que Gram dương

Các phân nhóm chính trong Hệ thống phân loại Bergey

Khuẩn lạc của 2 chủng vi khuẩn NMCM2 (A) và VTTS1 (B) trên môi trường thạch dinh dưỡng sau 2 ngày nuôi cấy

Hình nhuộm Gram của 2 chủng vi khuẩn NMCM2 (A) và VTTS1 (B) dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần

Hình nhuộm bào tử của 2 chủng vi khuẩn NMCM2 (A) và VTTS1 (B) dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần

Khảo sát khả năng di động của 2 chủng vi khuẩn NMCM2 (A) và VTTS1 (B)

Khảo sát hoạt tính catalase của 2 chủng vi khuẩn NMCM2 (A) và VTTS1 (B)

Sản phẩm khuếch đại gen 16S rRNA của 2 chủng vi khuẩn NMCM2 và VTTS1

Trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn NMCM2

Trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn VTTS1

Kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng với trình tự 16S rRNA của chủng NMCM2 bằng công cụ Blastn trên NCBI

Kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng với trình tự 16S rRNA của chủng VTTS1 bằng công cụ Blastn trên NCBI

Vòng vô khuẩn được tạo ra do chủng NMCM2 mẫn cảm với kháng sinh ampicillin

6

6

15

16

34

35

35

36

38

38

40

41

41

42

43

46

Hình 17

Hình 18

Kết quả dương tính làm đổi màu môi trường từ xanh sang vàng trong khảo sát khả năng sử dụng nguồn carbon myo-inositol của chủng vi khuẩn NMCM2 Kết quả dương tính làm đổi màu môi trường từ xanh sang vàng trong khảo

sát khả năng sử dụng nguồn carbon carbon myo-inositol của chủng vi khuẩn VTTS1

46

48

TỪ VIẾT TẮT

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Dân số thế giới tăng nhanh, đạt 7 tỷ người vào ngày 31/10/2011 (United Nations Population Fund, 2011) Theo Tổ chức Lương Nông Thế giới (FAO), cuộc khủng hoảng lương thực toàn cầu rất có thể xảy ra, đặc biệt khi dân số thế giới sẽ đạt 9,1 tỷ vào năm

2050 (FAO, 2009) Để đảm bảo an ninh lương thực cho 9,1 tỷ người, sản lượng lương thực toàn cầu phải tăng 70% so với năm 2006 Đây là một thách thức lớn trong khi diện tích đất canh tác ngày càng giảm, điều kiện thời tiết bất lợi và dịch bệnh ngày càng tăng Việt Nam đang đứng trước nhiều thách thức về an ninh lương thực dù là quốc gia xuất khẩu gạo lớn thứ 2 thế giới với hơn 7 triệu tấn/năm Mỗi năm, dân số tăng thêm 1 triệu người, sẽ cần thêm 200.000 tấn lúa (Đào Quốc Luận, 2011), trong khi diện tích đất sản xuất lương thực liên tục giảm cả số lượng và chất lượng Từ năm 2000-2010, Việt Nam mất 270.000 ha đất trồng lúa do canh tác chưa hợp lý, suy thoái đất, xâm nhập mặn vùng cửa sông và phát triển hạ tầng kinh tế (Bộ Tài nguyên và Môi trường, 2011) Nếu mực nước biển dâng 1m, khoảng 39% diện tích Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL), 10,5% diện tích Đồng bằng Sông Hồng và trên 2,5% diện tích các tỉnh ven biển miền Trung sẽ có nguy cơ bị ngập (Bộ Tài nguyên và Môi trường, 2012)

ĐBSCL là vùng sản xuất lúa lớn nhất cả nước, có sản lượng lúa đạt 24,6 triệu tấn vào năm 2012, chiếm 56% sản lượng lúa cả nước (Sở NN&PTNT Vĩnh Long, 2012) Điều kiện thời tiết ngày càng khắc nghiệt, nắng nóng mưa nhiều, đan xen nhiều cơn bão,

là điều kiện thuận lợi cho sâu bệnh hại lúa phát triển Trong đó, bệnh cháy bìa lá (bạc lá)

là một trong những bệnh hại lúa nguy hiểm nhất (Ezuka và Kaku, 2000) Từ những năm

1978, bệnh cháy bìa lá bùng phát thành dịch ở vùng ĐBSCL làm thiệt hại năng suất khoảng 40% (Nguyễn Vĩnh Phúc và Nguyễn Thị Lang, 2005)

An Giang có 262.286 ha canh tác lúa (Cục Thống kê An Giang, 2009), là một trong những tỉnh sản xuất lúa gạo trọng điểm của cả nước Trong các loại dịch hại, bệnh cháy bìa lá xảy ra thường xuyên và trên diện tích lớn Theo Nguyễn Trung Thành (2011), An Giang đang đẩy mạnh sản xuất lúa thơm với các giống Jasmine 85, VD 20, OM4900…

Các giống này thường là các giống nhiễm bệnh cháy bìa lá nặng nên đã gây ảnh hưởng nhiều đến năng suất và chất lượng của hạt

Đứng trước những thách thức về vấn đề an ninh lương thực, bên cạnh việc lai tạo ra các giống lúa siêu năng suất hoặc có khả năng chịu mặn cao thì việc phòng trị cũng như hạn chế tác hại của sâu bệnh hại lúa nói chung và bệnh cháy bìa lá nói riêng là một vấn đề đang được quan tâm nghiên cứu Theo Cao et al (2003) và Lee et al (2002), để kiểm soát bệnh cháy bìa lá, thuốc hóa học và giống kháng là 2 biện pháp thường được nghiên cứu

và ứng dụng, tuy nhiên các biện pháp này chưa thu được kết quả cao và còn tồn tại nhiều hạn chế Chưa có thuốc đặc trị, bên cạnh đó sử dụng thuốc hóa học làm ô nhiễm môi trường, tiêu diệt thiên địch, có thể làm cho vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc, lưu tồn thuốc trên sản phẩm, bệnh bùng phát và gây hại trên diện rộng Tuyển chọn và lai tạo giống kháng tốn nhiều thời gian và kinh phí trong khi gen kháng dễ mất tác dụng sau một thời gian triển khai ngoài đồng Do vậy, phòng trừ sinh học sử dụng vi sinh vật đối kháng là biện pháp có triển vọng để hạn chế bệnh cháy bìa lá, biện pháp này an toàn với sức khỏe con người, không gây ô nhiễm môi trường và góp phần quan trọng trong việc phát triển nền nông nghiệp bền vững và hiệu quả

Qua khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn được phân lập tại tỉnh An Giang với vi khuẩn gây bệnh cháy bìa lá lúa trên đĩa thạch và khả năng giúp giảm bệnh cháy bìa lá của các vi khuẩn này trong điều kiện nhà lưới, Võ Thị Phương Trang (2013) đã tìm ra được 2 chủng vi khuẩn có hiệu quả cao Đề tài này được thực hiện nhằm mục đích định danh 2 vi khuẩn trên, tạo tiền đề cho việc sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh cháy bìa lá, là một bệnh rất quan trọng trên ruộng lúa tại An Giang cũng như ĐBSCL, Việt Nam và trên thế giới

1.2 Mục tiêu đề tài

Định danh được 2 chủng vi khuẩn phân lập tại An Giang có khả năng đối kháng mạnh

với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae trên đĩa thạch và giúp giảm bệnh cháy bìa lá

trong điều kiện nhà lưới bằng 2 phương pháp:

1 Phương pháp truyền thống: sử dụng hệ thống phân loại Bergey

2 Phương pháp hiện đại: sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Bệnh cháy bìa lá lúa

Từ thập niên 1960, bệnh cháy bìa lá gây hại ở hầu hết các quốc gia trồng lúa, đặc biệt trên các giống lúa có năng suất cao lá như TN1 và IR8 (Ray và Sengupta, 1970) Năm 1954, 90,000-150,000 ha ruộng lúa ở Nhật bị ảnh hưởng và thiệt hại 22,000-110,000 tấn Tại Ấn Độ, bệnh được ghi nhận từ năm 1951 và đến năm 1963 bệnh bùng phát thành dịch Tại Philippines, thiệt hại vào mùa mưa lên đến 22,5%, thiệt hại vào mùa khô khoảng 7,2% đối với những giống mẫn cảm (Exconde, 1973)

Theo Phạm Văn Biên et al (2003), bệnh đã gây hại ở Việt Nam từ lâu trên các giống lúa mùa cũ; đặc biệt trong mùa mưa, bệnh cháy bìa lá là một trong những tác nhân gây ảnh hưởng đến sản lượng lúa của Việt Nam Những năm 1970-1975, bệnh cháy bìa lá đã gây thành dịch hại rộng lớn ở các tỉnh Đồng bằng Sông Hồng trên giống lúa Trân Châu lùn và các giống lúa mùa địa phương, trên giống NN8 mức độ nhiễm bệnh lên tới 60-100% làm giảm năng suất từ 30-60% Gần đây bệnh phổ biến trên một số giống lúa lai nhập nội Bệnh cháy bìa lá có chiều hướng gia tăng và trở thành một trong những bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng trong cả 2 vụ lúa ở miền Bắc Việt Nam (Phan Hữu Tôn, 2004)

Bệnh cháy bìa lá cũng được ghi nhận bùng phát thành dịch ở vùng ĐBSCL từ những năm 1978 làm thiệt hại về năng suất khoảng 40% Năm 1984, bệnh bùng phát thành dịch trên 77.000 ha Đến năm 1991-1992 bệnh tái phát ở các tỉnh Long An, Tiền Giang, Hậu Giang Có khoảng 10.000 ha lúa IR50404 và OM269 bị thiệt hại, trên 200.000 ha trồng

các giống lúa khác bị nhiễm ở hầu hết các tỉnh ĐBSCL, mức thiệt hại khoảng 10-15% (Nguyễn Vĩnh Phúc và Nguyễn Thị Lang, 2005)

Theo Nguyễn Trung Thành (2011), bệnh cháy bìa lá lúa đã gây hại trong vụ Thu Đông của tỉnh An Giang trong 5 năm liên tiếp từ 2006 đến 2010 với diện tích gần 42.000

ha, chiếm 10% tổng diện tích canh tác (Bảng 1) Trong đó, diện tích lúa Thu Đông nhiễm bệnh cháy bìa lá tăng dần theo các năm

Bảng 1 Diện tích nhiễm cháy bìa lá lúa vụ Thu Đông qua 5 năm tại An Giang

Thu Đông 2009 11.233,7 1.263,0 0,0 12.496,7 91.269 13,69 Thu Đông 2010 13.690,0 287,0 15,0 13.992,0 115.037 12,16

Mức độ tác hại của bệnh phụ thuộc vào giống, thời kỳ nhiễm bệnh của cây và mức

độ nhiễm bệnh Nếu cây lúa bị bệnh ngay từ khi đẻ nhánh thì mức độ bị bệnh về sau thường rất nặng, ảnh hưởng rõ rệt hơn đến năng suất, có thể làm giảm từ 41% trở lên, nếu

bị bệnh từ thời kỳ lúa làm đòng đến trổ thì tác hại có thể vẫn còn lớn, trung bình làm giảm năng suất của cây lúa khoảng 30% Nhưng nếu ở thời kỳ cuối chín sữa đến chín chắc thì mức độ tác hại sẽ ít hơn 10% (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999) Bệnh cháy bìa lá làm giảm khả năng quang hợp, giảm khả năng thụ phấn của bông lúa, làm tăng số hạt lép, hạt lửng, giảm lượng đạm và protein thô trong hạt Nếu gặp điều kiện thời tiết thuận lợi thì khả năng lây lan bệnh rất nhanh và có thể bị mất trắng (Ou, 1972)

2.1.2 Triệu chứng

Bệnh cháy bìa lá lúa có thể tấn công cây lúa suốt thới kỳ mạ đến khi lúa chín, nhưng

có triệu chứng điển hình ở thời kỳ cây lúa trên ruộng từ sau đẻ nhánh đến trổ và chín sữa (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999; Vũ Triệu Mân et al., 2007) Theo Võ Thanh

Hoàng và Nguyễn Thị Nghiêm (1993), bệnh cháy bìa lá gồm ba dạng triệu chứng: héo xanh (kresek), vàng lá và cháy bìa lá

Theo Ou (1972), triệu chứng “kresek” được hai nhà khoa học người Indonesia là Reitsma và Schure tìm thấy vào năm 1950 Một hoặc hai tuần lễ sau khi cấy, các lá bị bệnh trở nên xanh xám nhạt và bắt đầu gập, cuộn lại dọc theo gân chính Ở lúa cấy có lá

bị cắt, bên dưới mặt cắt có đốm úng nước, sau đó đổi sang màu xanh xám, toàn bộ lá bị cuộn lại và héo, tiếp đến là bẹ lá Vi khuẩn truyền theo mạch dẫn đến những vùng tăng trưởng của cây non và bệnh lây truyền đến gốc các lá khác, khiến cho cây non bị chết toàn

bộ

Triệu chứng vàng lá thường xuất hiện vào giai đoạn lúa lớn Khi cây lúa bị nhiễm bệnh, các lá già vẫn xanh bình thường, các lá non bị vàng nhạt không đồng đều, trên phiến lá có sọc rộng màu vàng hoặc vàng xanh nhạt Trong các lá vàng này không tìm thấy vi khuẩn, nhưng ở các đốt và lóng ngay bên dưới lá bệnh sẽ có rất nhiều vi khuẩn Vi khuẩn ở đây sẽ nhân mật số và hạn chế việc đưa dinh dưỡng lên lá làm cho lá bị vàng Triệu chứng có thể xuất hiện sau khi vi khuẩn xâm nhiễm 20-30 ngày (Ou, 1972)

Triệu chứng cháy bìa lá thường xuất hiện ở giai đoạn lúa trổ, tuy nhiên cũng có khi bệnh gây hại trên mạ Trên mạ, bìa của các lá bên dưới có những đốm úng nước nhỏ, đốm lớn dần ra làm lá trở nên vàng và khô héo Trên lá lúa triệu chứng bệnh thể hiện rõ rệt hơn, tuy có thể biến đổi ít nhiều theo giống lúa và điều kiện bên ngoài nhưng vết bệnh có những đặc điểm điển hình chung như ban đầu trên phiến lá có những đường kẻ dài không đều, hoặc ở chóp lá tạo thành một sọc dài nhũng nước hay ở hai bên bìa lá, khi đẫm nước vết bệnh sẽ lan dài ra những vết có màu vàng và phát triển dần ra tạo thành màu vàng xám khô chạy theo hai bìa lá (Agrios, 2005), rìa lá bị quăn queo và lan ra khắp lá, vết bệnh lan nhanh chóng xuống phần bẹ lá, lá bị khô nhanh chóng và cuộn lại (Sharma, 2006) Vết bệnh đầu tiên xuất hiện ở chóp lá hay mép lá thường nhỏ, trông giống như những giọt dầu

có màu xanh xám nhạt, sau đó vết bệnh lan rộng trở nên vàng và héo khô nhanh chóng Các vết bệnh có thể xuất hiện ở một hoặc cả hai rìa mép lá, sau đó phát triển rộng phủ kín

cả mặt lá, các vết bệnh sau đó biến thành màu nâu xám (Hình 1) Vào sáng sớm có thể quan sát giọt dịch khuẩn có màu trắng sữa hoặc vàng sáp trên bề mặt của các vết bệnh còn

màu nâu hổ phách, chúng dễ rơi và nổi trên mặt nước (Hình 2) (Lê Lương Tề, 2000; Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999)

Hình 1 Triệu chứng bệnh cháy bìa lá trên ruộng lúa (Ảnh: Trần Quốc Tuấn)

Hình 2 Giọt dịch vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Nguyễn Trung Thành, 2011)

2.1.3 Tác nhân gây bệnh

Theo Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân (1999), bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn

Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây ra (Kloepper, 1993) Ngoài tên gọi trên, vi

khuẩn còn có một số tên khác như: Xanthomonas oryzae (Uyeda et Ishiyama) Dowson (Ou, 1972), Pseudomonas oryzae Uyeda et Ishiyama (Ishiyama, 1922) hoặc Phytomonas

oryzae Magrou (Ou,1972), Xanthomonas campestris pv oryzae (Ishiyama) (Ou,1972); Bacillus oryzae Hori et Bokura (Bokura, 1911); Bacterium oryzae (Uyeda et Ishiyama)

(Ou, 1972)

Theo Ou (1972), vi khuẩn Xoo Gram âm, có hình que hai đầu hơi tròn, có một roi ở

một đầu, kích thước tế bào là 0,55-0,75 x 1,35-2,17 µm với vi khuẩn lấy từ khuẩn lạc trên môi trường và 0,45-0,6 x 0,65-1,4 µm với vi khuẩn lấy từ mô cấy

Trên môi trường nhân tạo, khuẩn lạc của Xoo có màu vàng sáp, có dạng hình tròn,

mô, bìa nguyên, bề mặt khuẩn lạc ướt Vi khuẩn Xoo háo khí, không làm hóa lỏng getalin,

sản sinh Indol, men của Xoo không làm đông sữa, không sản sinh khí và acid từ đường

saccharose (Ou, 1972)

Môi trường nuôi cấy thường dùng là Wakimoto cải tiến (Karganilla et al., 1973)

Ou (1972), Xoo không sống lâu trong nước cất vô trùng, nhưng sống khá lâu trong buffer

phosphate pH = 7 và trong nước có pha peptone Tốt nhất là giữ trong huyền phù đất sét

hạt mịn, sau hơn 12 tháng tỉ lệ sống của vi khuẩn Xoo vẫn rất cao Vi khuẩn Xoo tiết độc

tố phenylacetic acid trong môi trường nuôi cấy và trong lá bệnh, Xoo còn tổng hợp enzyme phân giải protein và cellulose Vi khuẩn Xoo rất dễ kháng streptomycin, đối với

các kháng sinh khác thì kháng ít hơn

Theo Ou (1972) các vết thương trên lá là những đường xâm nhập phổ biến và thuận lợi Vi khuẩn xâm nhập vào thủy khổng và nhân lên trong biểu mô, một số vi khuẩn xâm nhập vào hệ thống mạch dẫn, một số khác thoát ra ngoài qua thủy khổng (Tabei và Muko, 1960) Ngoài ra, vi khuẩn còn xâm nhập vào rễ qua các chỗ đứt, đây cũng là con đường gây bệnh quan trọng (Mizukami, 1957)

2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh

Bệnh phát triển mạnh nhất vào giai đoạn lúa làm đòng, trổ và chín sữa (Lê Lương

Tề, 2000) Ở Nhật Bản, bệnh thường xuất hiện vào giai đoạn cây lúa đẻ nhánh rộ hoặc cuối giai đoạn mạ (Ou, 1972)

Sự phát sinh phát triển và mức độ tác hại của bệnh cháy bìa lá phụ thuộc vào thời tiết (nhiệt độ, ẩm độ), đặc điểm của giống lúa và giai đoạn sinh trưởng, chế độ dinh dưỡng phân bón, nước… (Lê Lương Tề, 2000)

Theo Vũ Triệu Mân (2003), trong điều kiện bình thường, bệnh lan truyền qua hạt giống, lây qua vết thương cơ giới và qua đất trồng trọt nếu đất không được luân canh hay

xử lý bằng các biện pháp canh tác Ngoài ra, các kỹ thuật canh tác như xén bớt lá mạ khi

cấy, trong điều kiện đất chua, úng ngập, mực nước sâu, đất nhiều mùn,… làm cho bệnh xuất hiện sớm và phát triển mạnh (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999; Ou, 1972)

và có hiệu quả thấp khi bệnh đã phát triển mạnh, cần sử dụng kết hợp với biện pháp khác

năng kháng với một hoặc một vài nòi vi khuẩn Xoo (theo thuyết Gen-đối-gen của Flor)

Trong khi đó, vi khuẩn này có rất nhiều nòi khác nhau Cho đến nay, Viện Nghiên cứu

Lúa Quốc tế đã liệt kê được 14 nòi Xoo chuẩn, đặt tên từ 1 đến 10; trong đó nòi 3 gồm 3B

và 3C và nòi 9 gồm 9a, 9b, 9c, và 9d (Khoa, 2005) Bên cạnh đó, trong quá trình tiến hóa

được xem là rất nhanh của mầm bệnh, vẫn còn khả năng các nòi Xoo khác sẽ được tìm

thấy Như vậy, để có thể phòng trừ bệnh cháy bìa lá hiệu quả bằng giống kháng, chúng ta

cần phải biết hiện tại trên ruộng lúa có những nòi Xoo nào để triển khai đúng giống kháng

tương thích Việc này không đơn giản do phải ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử tốn

kém để xác định nòi Xoo; hơn nữa, trong khi việc lai tạo giống kháng rất tốn thời gian thì quần thể vi khuẩn Xoo luôn có khả năng biến đổi về mặt di truyền rất nhanh (thay đổi cấu

trúc nòi trong quần thể) để phá vỡ tính kháng của cây lúa Vì vậy, biện pháp phòng trừ bệnh cháy bìa lá bằng giống kháng thường không cho hiệu quả lâu dài và vì thế khó triển khai ứng dụng

ô nhiễm môi trường đất, nguồn nước, trực tiếp gây độc cho người, sinh vật có ích hoặc để lại dư lượng chất hóa học trong nông sản vượt mức cho phép, gây ngộ độc thực phẩm cho người và gia súc Nếu sử dụng liên tục một loại thuốc trừ bệnh ở một vùng sẽ dẫn đến kết quả làm vi sinh vật quen thuốc và kháng thuốc (Vũ Triệu Mân et al., 2007)

2.2.4 Biện pháp sinh học

Biện pháp sinh học là biện pháp sử dụng các sinh vật, chất kháng sinh hoặc dịch trích có nguồn gốc từ cơ thể sống để tiêu diệt hay hạn chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh (Vũ Triệu Mân et al., 2007) Trong đó, phòng trừ sinh học bằng vi sinh vật đối kháng là hướng nghiên cứu còn rất nhiều tiềm năng để khai thác (Lê Gia Hy, 1994) Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng để phòng trừ bệnh cây trồng bắt đầu phát triển từ những năm 1990, trong đó, nhóm nghiên cứu do Phạm Văn Kim đứng đầu là một trong những nhóm tiên phong và đạt được một số thành tựu khả quan Nhóm

đã nghiên cứu sử dụng vi khuẩn đối kháng phòng trừ bệnh đốm vằn trên lúa từ năm 1998 (Phạm Văn Kim et al., 1999; Mew et al., 2004), cho ra đời sản phảm sinh học BIOBAC-1 ĐHCT có khả năng phòng trừ một cách bền vững bệnh đốm vằn trên ruộng lúa và triển

khai đến nông dân (Nguyễn Đắc Khoa et al., 2010) Ngoài ra, biện pháp sinh học đã được

sử dụng để phòng trừ sâu bệnh trên nhiều loại cây và đạt được nhiều thành tựu

Đối với bệnh cháy bìa lá lúa, từ năm 1994, Thind và Ahrmad đã phân lập và so sánh

hiệu quả ức chế mầm bệnh Xoo của một số loài vi khuẩn như Bacillus subtilis, Erwinia

herbicola, Enterobacter aerogens, Micrococcus sp., Pseudomonas fluorescens, Aspergillus flavus, Cladosporium cladosporioides, Penicillium oxalicum và Trichoderma eharzianum; kết quả cho thấy Bacillus subtilis có hiệu quả cao nhất Những nghiên cứu

tiếp theo cũng chứng minh các chủng vi khuẩn Bacillus sp có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn Xoo (Weiliang et al., 1997; Lin et al., 2001; Beríc et al., 2012) Ngoài

ra, vi khuẩn Delftia tsuruhatensis HR4 do Han et al (2005) phân lập từ vùng trồng lúa ở phía Bắc Trung Quốc cũng có khả năng ức chế Xoo và các mầm bệnh khác như R solani

và Pyricularia oryzae Trong một nghiên cứu gần đây, Gesheva và Vasileva-Tonkova (2012) đã phân lập được chủng vi khuẩn Nocardioides sp từ vùng đất Nam cực có khả

năng sinh ra các enzyme thủy phân và các hợp chất đặc biệt có khả năng ức chế sự phát

triển không những của vi khuẩn Xoo mà cả Staphylococcus aureus Bên cạnh đó,

Mageshwaran et al (2012) đã ly trích được hợp chất lipopeptide từ vi khuẩn

Paenibacillus polymyxa HKA-15 phân lập từ cây đậu nành có khả năng ức chế mầm bệnh

cháy bìa lá Xoo trên lúa Bên cạnh vi khuẩn, xạ khuẩn Streptomyces cũng được thử nghiệm khả năng đối kháng với vi khuẩn Xoo nhưng không mang lại kết quả khả quan

(Ndonde và Semu, 2000) Biện pháp phòng trừ bệnh cháy bìa lá bằng vi sinh vật đối kháng hiện đang bắt đầu được tập trung nghiên cứu trở lại

Tại Việt Nam, việc nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng có khả năng phòng trừ bệnh cháy bìa lá vẫn còn rất hạn chế, chỉ tìm được thông tin của Nguyễn Hồng Anh (2011) và Nguyễn Đình Hải (2012) về chủ đề này, trong đó Nguyễn Hồng Anh chọn lọc được chủng

xạ khuẩn VN10-A44 có khả năng đối kháng với mầm bệnh Xoo và Nguyễn Đình Hải đã xác định được chủng xạ khuẩn VN08A12 có tiềm năng đối kháng với Xoo là

Streptomyces toxytricini, cải tiến môi trường sinh kháng sinh và khẳng định VN08A12

không gây hại cho các sinh vật có ích trong môi trường sống

Phòng trừ bệnh cháy bìa là bằng vi khuẩn đối kháng tuy hiệu quả chậm hơn thuốc hóa học nhưng hiệu quả lâu dài, thường không độc với con người và môi trường, bảo vệ

được sự cân bằng sinh học trong tự nhiên, hạn chế tình trạng bùng phát bệnh, tránh được

dư lượng chất hóa học độc hại trên nông sản, không gây ô nhiễm môi trường và góp phần

2.3 Phương pháp định danh vi khuẩn

Hiện nay, do sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, nhiều loài vi khuẩn đã được định danh bằng kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA Các trình tự nucleotide của vi khuẩn được lưu trữ trên các cơ sở dữ liệu lớn và việc tìm kiếm thông tin về trình tự nucleotide cũng rất đơn giản nên việc định danh vi khuẩn chủ yếu dựa vào kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA Tuy nhiên, kết quả định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật giải trình tự còn gây nhiều tranh cãi, nên ở đề tài này vi khuẩn được định danh bằng cách kết hợp kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA và phương pháp truyền thống sử dụng hệ thống phân loại của Bergey (John et al., 1994) để tăng độ tin cậy

2.3.1 Phương pháp truyền thống - Hệ thống phân loại Bergey

2.3.1.1 Khảo sát hình thái và cấu tạo của vi khuẩn

a) Nhuộm Gram

Theo John (1994) và Benson (1997), bước thứ nhất là nhuộm Gram mẫu vi khuẩn Nhuộm Gram là phương pháp dùng để chia các loài vi khuẩn thành 2 nhóm là Gram dương (Gram positive) và Gram âm (Gram negative) dựa trên các đặc tính hóa lý của vách tế bào Phương pháp này được đặt tên theo người phát minh ra nó, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853-1938) Ông phát triển kỹ thuật này vào năm

1884, về sau được Hucker và nhiều nhà khoa học khác cải tiến

Theo Nguyễn Lân Dũng et al (2007), phương pháp nhuộm Gram dựa vào khả năng lưu giữ crystal violet của vách tế bào vi khuẩn sau khi bị tẩy bằng cồn Xác định thời gian tẩy màu là yếu tố quan trọng trong việc phân biệt vi khuẩn Gram dương và Gram âm Nếu kéo dài thời gian tẩy màu, ngay cả vi khuẩn Gram dương cũng không giữ được màu nhuộm ban đầu Ngoài ra, một số loài vi khuẩn Gram dương cũng có thể bị tẩy màu dễ dàng và vì thế chúng được coi là các chủng vi khuẩn có tính chất bắt màu Gram thay đổi (có thể âm lẫn dương) Chất nhuộm fuchsin (hoặc có thể thay bằng safranin) tạo cho vi

safranin Vi khuẩn Haemophilus spp và một vài chủng vi khuẩn kỵ khí không ăn màu

safranin

như sau:

- Nguyên nhân làm cho vi khuẩn Gram dương lại cho kết quả Gram âm:

+ Nhiệt độ cố định mẫu quá nóng làm cho các tế bào dễ dàng bị mất màu + Rửa nước hơn 5 giây sau khi nhuộm vi khuẩn đã được cố định với crystal violet, crystal violet rất dễ bị rửa trôi bằng nước Thời gian rửa tốt nhất là 2 giây

+ Lứa cấy quá già: vi khuẩn trong quá trình biến dưỡng sinh ra một số chất có khả năng làm tăng tính acid của môi trường nuôi cấy gây sai lệch kết quả Tốt nhất nên nhuộm Gram với lứa cấy từ 18-24 giờ

+ Dung dịch Lugol bị hỏng: phải bảo quản dung dịch lugol trong chai nâu, tránh ánh sáng và cần loại bỏ ngay khi thấy dung dịch chuyển màu từ nâu sang vàng + Tẩy màu quá mức: nhỏ quá nhiều cồn hoặc không rửa nước ngay Nếu nhỏ từ

từ cồn 95% cho đến khi vùng phiến kính bạc màu đi, thông thường từ 10-15 giây Rửa ngay với nước để chấm dứt công đoạn tẩy màu

- Nguyên nhân làm cho vi khuẩn Gram âm lại cho kết quả Gram dương:

+ Cố định tiêu bản khi còn ướt, các hợp chất protein có trong môi trường hoặc

trong mẫu vi khuẩn làm tiêu bản khó tẩy màu

+ Tẩy màu chưa đạt

+ Vết bôi vi khuẩn quá dày

b) Khảo sát hình thái kích thước và sự liên kết tế bào

Sau bước nhuộm Gram, vi khuẩn được quan sát qua tiêu bản sống dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần để xác định hình dạng, kích thước và sự liên kết của

tế bào

Theo Phạm Văn Kim (2007), vi khuẩn có ba hình dạng chính là cầu khuẩn (coccus), trực khuẩn (bacille, monas) và xoắn khuẩn (spira) Giữa ba loại này thường có những

dạng trung gian Thí dụ như dạng cầu trực khuẩn (coccobacille) hoặc dạng phẩy khuẩn (vibrie)

* Cầu khuẩn: là loại vi khuẩn có hình cầu, hình hạt cà phê nhưng cũng có thể là hình bầu dục hoặc ngọn nến, có đường kính trung bình khoảng 0,5-1 µm Cầu khuẩn được chia thành một số loại sau:

- Đơn cầu (Micrococcus): vi khuẩn hình cầu, sống riêng lẻ, sống hoại sinh trong đất,

nước, không khí

- Song cầu (Diplococci) là những cầu khuẩn liên kết với nhau thành từng đôi (do phân cắt theo mặt phẳng xích đạo) như phế cầu (Streptococcus pneunoniae), lậu cầu (Neisseria gonorrhoeae) và não mô cầu (Neisseria meningitidis)

- Liên cầu (Streptococci) là những cầu khuẩn liên kết với nhau tạo thành chuỗi

- Tụ cầu (Staphylococci) là những cầu khuẩn phân cắt theo các mặt phẳng bất kỳ và

liên kết với nhau thành từng đám như chùm nho, hoại sinh hoặc ký sinh gây bệnh cho người và gia súc

- Sarcina phân cắt theo ba mặt phẳng trực giao với nhau và tạo thành khối gồm 8, 16

tế bào hoặc nhiều hơn Hoại sinh trong không khí Sarcina urea có khả năng phân giải urê

khá mạnh

* Trực khuẩn: là những vi khuẩn hình que, đầu tròn hay đầu vuông, kích thước thường gặp có chiều rộng khoảng 0,5-1 µm, chiều dài khoảng 1-4 µm (các trực khuẩn không gây bệnh thường có kích thước lớn hơn), bao gồm:

- Bacillus: là những trực khuẩn Gram dương, có nội bào tử, không thay đổi hình

dạng khi sinh nội bào tử

- Các trực khuẩn Gram âm, không sinh nội bào tử, có roi gồm các chi Pseudomonas

có 1-7 roi, Xanthomonas có 1 roi, Erwinia có nhiều roi mọc chung quanh

- Corynebacterium có hình chùy, không có nội bào tử, hình dạng và kích thước có

thay đổi nhiều khi nhuộm màu, tế bào thường tạo thành các đoạn nhỏ bắt màu khác nhau

- Clostridium: là những trực khuẩn Gram dương, 0,4-1 x 3-8 µm, có sinh nội bào tử,

nội bào tử to hơn chiều ngang tế bào nên khi có nội bào tử tế bào thường phình ra ở giữa

hay ở một đầu Có thể gây bệnh như Clostridium tetani gây bệnh uốn ván hoặc có lợi như

Clostridium pasteurianum là vi khuẩn cố định đạm trong đất

* Xoắn khuẩn: là những vi khuẩn có từ hai vòng xoắn trở lên, Gram dương di động được nhờ một hay nhiều roi mọc ở đỉnh Kích thước 0,5-3 x 5-40 µm Ví dụ như chi

Spirillum

* Phẩy khuẩn: có hình que hơi uốn cong giống như dấu phẩy Chi thường gặp là

Vobrio Phần lớn hoại sinh, có một số gây bệnh cho người và gia súc

có thể thay đổi theo thời gian Nếu khảo sát khả năng di động của mẫu vi khuẩn đã được nuôi cấy lâu thì khả năng di động của vi khuẩn có khả năng giảm, dễ nhằm lẫn với vi khuẩn không di động Trong một nghiên cứu để phân biệt trực khuẩn thương hàn với các trực khuẩn ruột khác, Hiss (1902) đã sử dụng môi trường bán rắn chứa 0,5% agar và 8% gelatin để cấy các trực khuẩn này Kết quả, trực khuẩn thương hàn làm đục toàn bộ môi trường chỉ trong 18 giờ, trong khi các trực khuẩn ruột khác phải mất nhiều thời gian hơn Năm 1934, Jordan et al đã sử dụng môi trường bán rắn GI như một phương tiện chung để kiểm tra khả năng di động của các vi khuẩn Khả năng di động của vi sinh vật thay đổi theo nhiệt độ ủ

d) Nhuộm nội bào tử

Theo Microbelibrary (2007), nội bào tử được hình thành giúp vi khuẩn tồn tại trong các điều kiện khắc nghiệt của môi trường như nhiệt độ cao, thiếu nước, có sự hiện diện của chất độc, thay đổi pH hoặc thiếu chất dinh dưỡng Nhuộm nội bào tử là một trong những bước đầu trong quá trình định danh vi khuẩn Chỉ có một số ít chi vi khuẩn hình thành nội bào tử, vì thế sự hiện diện của nội bào tử trong một mẫu vi khuẩn là yếu tố quan

trọng giúp quá trình định danh được nhanh hơn Mặc dù nội bào tử đã được quan sát bởi nhiều nhà khoa học như Perty (1852), Pasteur (1869), Koch (1876) và Cohn (1872), các phát hiện này dựa vào sự khúc xạ ánh sáng khác biệt của nội bào tử so với tế bào dinh dưỡng vì nội bào tử không bắt màu các thuốc nhuộm như methylen, carbol fuchsin, safranin bằng phương pháp nhuộm thông thường

Năm 1922, Dorner công bố phương pháp nhuộm nội bào tử, phương pháp này sử dụng một bước hơ nóng dài Năm 1933, Schaeffer và Fulton cải tiến phương pháp nhuộm nội bào tử của Dorner để làm cho quá trình nhuộm nội bào tử được nhanh hơn Khi được

hơ nóng, nội bào tử và tế bào dinh dưỡng đều bắt màu xanh của malachite green Tiếp theo, mẫu nhuộm được rửa bằng nước Tế bào dinh dưỡng bị mất màu trong khi nội bào

tử vẫn giữ được màu xanh của malachite green do có vách dày Sau đó, mẫu được nhuộm tiếp với safranin Tế bào dinh dưỡng đã bị mất màu nên bắt màu đỏ của safranin, nội bào

tử không bắt màu đỏ của safranin do đã bắt màu xanh của malachite green và do có vách dày Kết quả, tế bào dinh dưỡng bắt màu đỏ và nội bào tử bắt màu xanh

2.3.1.2 Khảo sát các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn

Sau khi đã khảo sát hình thái và một số đặc điểm cấu tạo cần thiết, các chủng vi khuẩn cần định danh sẽ được khảo sát các đặc tính sinh hóa Dựa vào kết quả nhuộm Gram, hình dạng, sự liên kết, kích thước tế bào, các vi khuẩn được chia thành các nhóm nhỏ hơn như hình 4 và 5

Hình 3 Phân nhóm vi khuẩn hình cầu và hình que Gram âm (Benson, 1997)

Hình 4 Phân nhóm vi khuẩn hình cầu và hình que Gram dương (Benson, 1997)

Trong quá trình định danh, tùy vào kết quả của từng bước trong hệ thống phân loại Bergey, chỉ các khảo sát sinh hóa cần thiết để xác định vi khuẩn thuộc nhóm nào trong các nhóm nhỏ hơn được thực hiện, từ đó xác định được vi khuẩn cần định danh thuộc chi nào và sau đó là dùng các khảo sát sinh hóa cần thiết để phân biệt vi khuẩn thuộc loài nào của chi Một số khảo sát sinh hóa thông dụng được trích từ Benson (1997) bao gồm:

a) Khả năng chuyển hóa citrate

Khảo sát khả năng chuyển hóa citrate được sử dụng để xác định vi khuẩn có khả năng sử dụng citrate như là nguồn hydrocarbon duy nhất hay không Sản phẩm chuyển hóa làm kiềm hóa môi trường và thay đổi màu của chất chỉ thị Khảo sát này được thực

Phản ứng dương tính làm môi trường đổi từ màu xanh lá cây sang màu xanh nước biển Môi trường không đổi màu trong phản ứng âm tính

b) Hoạt tính men catalase

năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng ở các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy ý Khảo sát này được thực hiện bằng cách dùng que cấy lấy

một ít vi khuẩn và nhúng vào giọt H2O2 Phản ứng dương tính cho thấy có bọt khí xuất hiện Không có bọt khí xuất hiện trong phản ứng âm tính Không nên sử dụng vi khuẩn cấy trên thạch máu vì dễ cho kết quả dương tính giả

c) Hoạt tính men oxidase

Khảo sát hoạt tính men oxidase được sử dụng để phát hiện khả năng sinh enzyme

cytochrome C oxidase của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa , Neisseria gonorrhoeae

và Campylobacter jejuni là những vi khuẩn gây bệnh có oxidase dương tính Khảo sát này

được thực hiện bằng cách lấy một ít vi khuẩn nuôi cấy thuần bôi lên một tờ giấy lọc, nhỏ thuốc thử N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride lên Phản ứng dương tính có màu tím Đọc kết quả trong vòng 10 giây đầu

d) Khả năng phân giải urea

Khảo sát khả năng phân giải urea được sử dụng để phát hiện enzyme urease phân giải urea thành ammonia và carbondioxide Ammonia sinh ra làm kiềm hóa môi trường, là phản ứng đặc trưng cho các loài Proteus Khảo sát này được thực hiện bằng cách cấy vi

môi trường có màu tím đỏ Môi trường không chuyển màu trong phản ứng âm tính

e) Khả năng sinh indol

Khảo sát khả năng sinh indol được sử dụng để phát hiện các vi sinh vật có enzyme tryptophanase chuyển hóa tryptophan tạo thành indol Khảo sát này được thực hiện bằng cách cấy vi khuẩn vào nước trypton, ủ ở 37oC trong 24 giờ Nhỏ vài giọt thuốc thử kovacs Phản ứng dương tính có vòng màu đỏ cánh sen nổi lên trên (do indol kết hợp với p-dimethylaminobenzal dehyde trong thuốc thử Kovacs) Không có màu hoặc màu vàng trong phản ứng âm tính Với các chủng sinh indol chậm, nhỏ thuốc thử kovacs sau 48 giờ

ủ ở 37oC

f) Thử nghiệm methyl red (MR)

Thử nghiệm methyl red được sử dụng để phát hiện các vi khuẩn lên men glucose tạo sản phẩm acid bền Vi khuẩn có phản ứng MR dương tính, pH môi trường ngày càng giảm Vi khuẩn có phản ứng MR âm tính, pH môi trường tăng dần (các sản phẩm có tính

thực hiện bằng cách cấy vi khuẩn vào canh thang MR-VP (voges proskauer-methyl red

dương tính có màu đỏ Màu vàng trong phản ứng âm tính

g) Thử nghiệm voges proskauer (VP)

Thử nghiệm voges proskauer được sử dụng để phát hiện các vi khuẩn có hai loại enzyme chuyển hóa 2,3 butanediol thành acetoin khi có oxy và chuyển hóa tiếp acetoin thành diacetyl Diacetyl kết hợp với guanidin trong peptone tạo phức diacetyl-guanidin có màu đỏ Thử nghiệm này được thực hiện bằng cách cấy vi khuẩn vào môi trường MR-VP

(KOH 40%) Lắc nhẹ Đọc kết quả sau 20 phút, chậm nhất là 4 giờ Phản ứng dương tính

có màu đỏ trên mặt môi trường

h) Khả năng lên men đường

Khảo sát khả năng lên men đường được sử dụng để phát hiện khả năng lên men đường của vi khuẩn Vi khuẩn lên men đường sẽ làm giảm pH dẫn đến thay đổi màu của môi trường

* Phương pháp MPN: Định lượng các vi khuẩn có khả năng lên men đường lactose sinh hơi Phương pháp MPN đươc thực hiện bằng cách cấy vi khuẩn trong môi trường

sinh hơi sẽ làm thay đổi màu môi trường và có bóng hơi trong ống Durham

hiện bằng cách cấy hai bước Đầu tiên cấy trên mặt nghiêng Sau đó, cấy đâm sâu vào

môi trường lên men trong giờ đầu nuôi cấy Sau đó, vi khuẩn lấy năng lượng trong quá trình oxy hóa peptone, phần thạch nghiêng có màu đỏ (hiện tượng kiềm hóa môi trường) Peptone ở phần chân thạch không được sử dụng vì không có O2, phần chân vẫn giữ nguyên màu vàng Nếu lên men cả glucose, sucrose và lactose, từ 18-24 giờ, toàn bộ phần chân và mặt nghiêng thạch có màu vàng Sau 24 giờ, kiềm hóa môi trường do vi khuẩn sử dụng peptone, môi trường chuyển màu đỏ (chỉ ở phần mặt nghiêng vì peptone chuyển hóa

trong điều kiện hiếu khí Nếu lên men sinh hơi sẽ thấy các bọt khí hoặc nứt thạch Phân

i) Khả năng khử nitrat

Khảo sát khả năng khử nitrat được sử dụng để phát hiện enzyme nitratase xúc tác

(N2) Khảo sát này được thực hiện bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trong canh thang nitrat

và acid sulfanilic Hai hợp chất này kết hợp với nitrit để tạo thành hợp chất có màu đỏ (phản ứng dương tính) Tuy nhiên, nếu sản phẩm phân giải là amoniac và khí nitơ, ống thử nghiệm sẽ không chuyển màu nhưng vẫn được báo cáo là phản ứng nitrat dương tính Trường hợp này cần tiến hành tiếp bước sau: Cho thêm một ít bột kẽm vào ống thử, kẽm

sẽ chuyển hóa nitrat thành nitrit và ống thử sẽ có màu đỏ Như vậy, kết luận phản ứng âm tính Nếu ống thử không chuyển màu, phản ứng dương tính (vi khuẩn đã chuyển hóa hết nitrat có trong môi trường)

k) Hoạt tính men gelatinase

Khảo sát hoạt tính men gelatinase được sử dụng để phát hiện vi khuẩn có men gelatinase phân giải và hóa lỏng gelatin, quan sát thấy ngay cả khi nhiệt độ thấp hơn

dinh dưỡng gelatin, ủ nhiệt độ phòng trong 14 ngày hoặc sử dụng phương pháp gelatin Strip Phương pháp gelatin Strip sử dụng dải màu có phủ gelatin Nếu phản ứng dương tính, có sự thay đổi màu Một số chủng có khả năng hóa lỏng gelatin chậm nên giữ lại thử nghiệm trong hai tuần

2.3.2 Phương pháp hiện đại - Giải trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn

2.3.2.1 Ly trích vật liệu di truyền của vi khuẩn

Theo Trần Thị Xuân Mai (2010), nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là dùng dung dịch phân giải hữu hiệu và kỹ thuật shock nhiệt để phá vỡ lớp vách tế bào dày của vi khuẩn dựa theo quy trình của Ulrich và Hughes (2000)

2.3.2.2 Khuếch đại đoạn gen 16S rRNA của vi khuẩn

Theo Lê Văn Tám (2006), gen 16S rRNA là gen có chức năng cần thiết cho sự sống của vi khuẩn, vừa có vùng bảo tồn và vừa có vùng biến động ở các cấp độ khác nhau, tạo điều kiện thuận lợi cho việc định danh vi khuẩn hay xác định mối quan hệ họ hàng giữa hai hay nhiều loài vi khuẩn Các gen này đã được giải trình tự và lưu trữ trong các cơ sở

dữ liệu sinh học trực tuyến (Lê Văn Tám, 2006) Do đó, cần khuếch đại đoạn gen 16S rRNA của vi khuẩn để tiến hành giải trình tự và sau đó so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA với cơ sở dữ liệu để xác định vi khuẩn cần định danh thuộc loài nào

Theo Trịnh Đình Đạt (2008), PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn DNA với tốc độ nhanh, chính xác cao được thực hiện trong máy chu trình nhiệt (máy PCR) PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống

như E coli hay nấm men Phương pháp này được thực hiện trong ống nghiệm (invitro)

tháo xoắn kết hợp với enzyme DNA polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều nhiệt thích hợp cho từng giai đoạn phản ứng tổng hợp với các đoạn mồi được thiết kế tùy mục tiêu nghiên cứu Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ gồm 3 bước sau:

- Biến tính (Denaturation)

Xử lý nhiệt độ để tách DNA mạch kép thành mạch đơn dùng làm khuôn để tổng hợp

- Gắn mồi (Primer annealing)

gắn vào mạch khuôn theo nguyên tắc bổ sung Sử dụng nhiệt độ không thích hợp trong giai đoạn này sẽ dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào đoạn DNA khuôn hay gắn một cách tùy tiện và không nhận được sản phẩm PCR theo ý muốn

- Kéo dài ( Elongation)

Bốn loại dNTP (A, T, C, G) được lắp ráp vào đoạn DNA khuôn để tạo thành đoạn đơn DNA mới bổ sung với đoạn DNA khuôn bắt đầu từ mồi Nhiệt độ bước này từ 68-

72oC Thời gian kéo dài phụ thuộc vào cả DNA polymerase và chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại Thường thời gian kéo dài 2-5 phút

Theo Võ Thị Thương Lan (2007), số chu kỳ lập lại trong mỗi phản ứng từ 25 đến

50 Tuy nhiên, nếu kéo dài thời gian quá 30 chu kỳ thì khả năng sai sót sẽ tăng theo Số

50, nồng độ dNTP, mồi và hoạt tính của Taq bị suy giảm nghiêm trọng khi nồng độ đoạn

khuôn tăng cao gây ức chế phản ứng PCR

2.3.2.3 Điện di sản phẩm PCR

Sản phẩm khuếch đại đoạn gen 16S rRNA được điện di trên gel agarose Theo Đái Duy Ban (2006), agarose là loại gel thông dụng nhất, thao tác đơn giản thường dùng để phân tách các đoạn có kích thước tương đối lớn trong khoảng 0,5-20 kb Dưới tác động của điện trường, các phân tử DNA (tích điện âm) khác nhau về kích thước, điện tích, mức

độ cuộn xoắn và dạng phân tử (mạch thẳng hay mạch vòng) sẽ di chuyển qua hệ mạng của gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) với tốc độ di chuyển khác nhau Vì vậy, chúng dần dần tách ra trên trường điện di, có thể thu thập và phân tích được từng phân đoạn DNA hoặc các gen riêng Trên điện trường, các phân đoạn DNA có kích thước càng nhỏ có tốc độ di chuyển trên điện trường càng nhanh

Các acid nucleic trong gel agarose xuất hiện dưới tia tử ngoại (UV) dưới dạng những vạch sáng nhờ Ethidium Bromide (EtBr) Tiếp theo, kích thước của acid nucleic được so sánh với kích thước đã biết của marker chuẩn (gồm nhiều đoạn DNA có kích thước đã biết) được điện di trong cùng gel agarose (Đái Duy Ban, 2006)

2.3.2.4 Giải trình tự đoạn gen 16S rRNA

Xác định hay giải trình tự DNA là quá trình xác định trật tự sắp xếp các nucleotide của đoạn DNA đó Hiện nay, hầu hết trình tự DNA điều được xác định bằng máy tự động

dựa trên nền tảng của phương pháp kết thúc chuỗi (chain termination method) được phát

triển bởi Frederick Sanger vào năm 1977 (Trần Nhân Dũng và Nguyễn Vũ Linh, 2011) Theo Trần Nhân Dũng và Nguyễn Vũ Linh, (2011), để giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch DNA đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh

chùm tia sáng laser Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang đọc và hiển thị thành các đỉnh tương ứng với các màu huỳnh quang, cuối cùng được phân tích thành trình tự của đoạn DNA

Với thời gian thực hiện nhanh và tương đối chính xác, việc giải trình tự DNA bằng máy tự động đã giúp biết được cụ thể trình tự của đoạn gen đến từng nucleotide, giúp cho việc định danh sinh vật và phân tích đa dạng di truyền các giống, loài được dễ dàng, thuận lợi hơn (Trần Nhân Dũng và Nguyễn Vũ Linh, 2011)

2.3.2.5 So sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA với cơ sở dữ liệu

Theo Trần Nhân Dũng và Nguyễn Vũ Linh (2011), hai giải thuật tìm kiếm cơ sở dữ liệu phổ biến nhất hiện nay trên thế giới là Blast và Fasta, trong đó giải thuật Blast được đánh giá nhanh hơn và đang sử dụng rộng rãi Blast tìm kiếm những trình tự bắt cặp có điểm số cao giữa chuỗi truy vấn và các chuỗi trong cơ sở dữ liệu Giải thuật Blast được thực hiện qua các chương trình blastp, blastn, blastx, tblastn, tblastx của National Center for Biotechnology Information (NCBI) Có trên 500 cơ sở dữ liệu sinh học, trong đó cơ sở

dữ liệu NCBI của Mỹ là được dùng phổ biến nhất

Theo Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu (2008), hai chuỗi trình tự DNA được xem là tương đồng khi có một phần chung Cách tốt nhất để tìm sự tương đồng là sử dụng chương trình Blast và theo tiêu chuẩn ít nhất 70% tương đồng hoặc giá trị E-value thấp hơn 10-4

2.4 Một số nghiên cứu định danh vi khuẩn gần đây

Trong những năm qua, sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử giúp quá trình định danh vi khuẩn ngày càng nhanh hơn Việc định danh vi khuẩn chuyển dần từ phương pháp truyền thống sử dụng hệ thống phân loại Bergey sang phương pháp hiện đại sử dụng

kỹ thuật PCR để khuếch đại một chuỗi trình tự đặc hiệu của loài hoặc giải trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn Trong đó, xu hướng sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA ngày càng chiếm ưu thế

Trong thời gần đây, các tác giả Lê Bảo Trâm (2011), Nguyễn Văn Ngon (2011), Lê Thị Đan Thanh (2011), Trần Thị Dung (2011), Nguyễn Ngọc Giàu (2011) và Dương

Xuân Đào (2011) đã thực hiện các đề tài có liên quan đến phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn Trong các đề tài nghiên cứu này, quá trình định danh vi khuẩn chỉ ngừng lại ở việc dựa vào mức độ tương đồng cao nhất giữa trình tự gen 16S rRNA của mẫu vi khuẩn và các chuỗi trình tự trên cơ sở dữ liệu NCBI Hai tác giả Bằng Hồng Lam (2011)

và Đỗ Thị Cẩm Hường (2012) cũng phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn dựa kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA Tuy có khảo sát rõ hơn, cụ thể là loài có độ tương đồng cao nhất với trình tự gen 16S rRNA của mẫu vi khuẩn cũng có một số đặc tính phù hợp với các đặc tính của mẫu vi khuẩn đã khảo sát, nhưng các tác giả chưa giải thích cụ thể vì sao không chọn các loài vi khuẩn có cùng tỷ lệ tương đồng với loài được chọn, bởi vì có thể còn có loài khác cũng có một số đặc tính phù hợp với các đặc tính của mẫu vi khuẩn được khảo sát Kết quả định danh của các nghiên cứu này chưa thật sự có sức thuyết phục cao Ngoài ra, một số nghiên cứu khác còn có kết quả định danh chưa hợp lý

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện

Vật liệu thí nghiệm là 2 chủng vi khuẩn NMCM2 và VTTS1 do Võ Thị Phương

Trang (2013) phân lập tại An Giang có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn Xoo trên

đĩa thạch và giúp giảm bệnh cháy bìa lá trong nhà lưới

3.1.4 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

3.1.4.1 Dụng cụ thí nghiệm

Tuýp eppendorf , ống nghiệm, đĩa petri, kim cấy, bình tam giác, cốc thủy tinh, ống thủy tinh, bộ micropipet Gibson, đèn cồn, đầu pipet, lame, lamelle và một số dụng cụ vi sinh khác

3.1.4.2 Thiết bị thí nghiệm

Tủ cấy vi sinh vật, tủ ủ vi sinh vật, kính hiển vi Olympus CHT, máy lắc mẫu, nồi khử trùng nhiệt ướt, pH kế Orion 420A, cân điện tử Sartorius, máy ly tâm Heraeus, máy ủ

Perkin Elmer PE 9700, hệ thống chụp hình gel Bio-Rad UV 2000, bộ điện di một chiều, máy giải trình tự

3.1.5 Hóa chất

Hóa chất để pha môi trường thạch dinh dưỡng (nutrient agar) gồm peptone (5g/l), beef extract (3g/l), agar (15g/l) và NaCl (5g/l) Ngoài ra còn NaOH và HCl để chuẩn pH bằng 6.8 (APHA, 1920)

Hóa chất thực hiện các khảo sát sinh hóa: H2O2, đỏ phenol, ammonium dihydrogen phosphate, dipotassium phosphate, sodium citrate, magnesium sulfate, bromthymol blue,

agar, sodium chloride, peptone, casein peptone, gelatin peptone, glucose, lactose, sucrose,

lysine, bromocresol purple, glyxerin, triphenyltetrazolium clorua, đỏ methyl, crystal violet, ammonium oxalat, potasium iodide, iodine tinh thể, safranin, N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, kovacs

Hóa chất ly trích DNA, PCR và điện di: buffer CTAB, ethanol 100%, ethanol 70%, chloroform, isoamylalcohol, isopropanol, SDS 10%, proteinase K, TE, MgCl2, ethidium

bromide, agarose…

3.2 Phương pháp

3.2.1 Phương pháp truyền thống - Hệ thống phân loại Bergey

3.2.1.1 Khảo sát hình thái và cấu tạo của vi khuẩn

a) Nhuộm Gram

Theo Nguyễn Lân Dũng et al.( 2007), hóa chất nhuộm Gram bao gồm các dung dịch thuốc nhuộm crystal violet, lugol và carbon fuchsin (hoặc safranin), cần được chuẩn bị trước

Để chuẩn dung dịch crystal violet cần chuẩn bị dung dịch A và B Dung dich A được chuẩn bị bằng cách hòa tan 2g crystal violet hòa 20ml ethanol 95% Dung dịch B được chuẩn bị bằng cách hòa tan 0,8g ammonium oxalat trong 80ml nước cất Trộn đều 2 dung dich A và B, lọc qua giấy lọc thô thu được dung dịch crystal violet, giữ ở nhiệt độ phòng trong chai màu nâu

Để chuẩn dung dịch lugol: Hòa tan 1g Iodine tinh thể và 2g Potasium iodide trong 300ml nước cất Nghiền Iodine vào Potassium iodide trong 50 ml nước cất cho hòa tan hoàn toàn Thêm phần nước cất còn lại, giữ ở nhiệt độ phòng trong chai nâu Khi dung dịch mất màu phải pha lại

Để chuẩn dung dịch carbon fuchsin cần chuẩn bị dung dịch A và B Dung dich A được chuẩn bị bằng cách hòa tan 0,3g fuchsin trong 10 ml ethanol 95% Dung dịch B

được chuẩn bị bằng cách cho 5ml phenol nóng chảy vào 95ml nước cất Trộn đều dung dịch A và dung dich B, lọc qua giấy lọc thô thu được dung dịch carbon fuchsin

Để chuẩn dung dịch safranin: Hòa tan 5 g safranin vào 100ml ethanol 95%, khuấy cho tan được dung dịch dịch safranin 5%, sau đó đổ thuốc nhuộm vào lọ thủy tinh màu tối Trước khi dùng, pha safranin 5% với nước cất theo tỷ lệ 1:9 (vol/vol) để có dung dịch safranin 0, 5%

Theo Sharmin và Rahman (2007), nhuộm Gram được thực hiện bằng cách dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 18-24 giờ) hòa vào 1 giọt nước cất

ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí, sau đó cố định tế bào bằng cách hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần, tránh để tiêu bản quá nóng Nhuộm bằng dung dịch crystal violet trong 30 giây, rửa nước 2 giây, rồi nhuộm lại bằng dung dịch Iodine trong 1 phút, rửa nước Tiếp tục nhỏ ethanol 95% để tẩy màu, giữ khoảng 10 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước Nhuộm bổ sung bằng dung dịch safranin trong 1 phút, rửa nước, thấm nước và để khô trong không khí Cuối cùng, soi mẫu nhuộm dưới kính hiển vi

có độ phóng đại 1000 lần Vi khuẩn Gram dương bắt màu xanh tím, Gram âm bắt màu đỏ

b) Khảo sát hình thái, kích thước và sự liên kết tế bào

Hình thái, kích thước và sự liên kết của tế bào vi khuẩn được xác định bằng cách quan sát tiêu bản sống dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần Tiêu bản sống được làm như bằng cách dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch hòa vào

10 µl nước cất vô trùng ở giữa phiến kính với thao tác nhẹ nhàng, đậy lamen lại và quan sát dưới kính hiển vi

c) Khảo sát khả năng di động

Theo Nguyễn Lân Dũng et al (2007), khảo sát khả năng di động được sử dụng để phát hiện khả năng di của vi khuẩn nhờ có roi ở đầu tế bào Khảo sát này được thực hiện bằng cách cấy vi khuẩn sâu trong thạch mềm 0,3-0,6% agar, khoảng 2/3 độ dài thạch Ủ ở

cấy, xoắn ốc hoặc làm đục toàn bộ ống thạch Vi khuẩn chỉ phát triển trên đường cấy trong phản ứng âm tính