Hai chủng vi khuẩn NMCM2 và VTTS1 được ly trích DNA và đo OD ở bước sóng 260 nm và 280 nm để xác định độ tinh sạch và nồng độ của DNA được trích. Sau đó, chọn mẫu DNA có độ tịnh sạch thích hợp. Dựa vào nồng độ, pha loãng mẫu DNA được chọn thành mẫu DNA có nồng độ 40-50 ng/µl (Bảng 5).
Bảng 5. Giá trị OD, nồng độ DNA ban đầu và nồng độ DNA sau pha loãng
Mẫu 260nm 260/280nm Hệ số pha loãng Nồng độ DNA ban đầu Hệ số cần pha loãng Nồng độ DNA
sau pha loãng
NMCM2-1 0,0929 2,0381 10 46 1 46,00 NMCM2-2 0,3363 1,6427 10 168,15 4 42,04 NMCM2-3 0,1972 1,9290 10 98,6 2 49,30 VTTS1-1 0,7324 1,8675 10 366,2 8 45,78 VTTS1-2 0,1834 1,7433 10 91,7 2 45,85 VTTS1-3 0,4237 1,8906 10 211,85 5 42,37
Sau khi pha loãng, mẫu DNA của hai chủng vi khuẩn NMCM2 và VTTS1 khuếch đại bằng kỹ thuật PCR, sử dụng cặp mồi 27F và 1492R. Sản phẩm PCRđược điện di trên gel agarose 1,5% (Hình 11).
Hình 11. Sản phẩm khuếch đại gen 16S rRNA của 2 chủng vi khuẩn NMCM2 và VTTS1.
(1: thang chuẩn 100 bp Plus, 2: VTTS1 và 3: NMCM2)
Sản phẩm PCR hiện băng rõ và không có băng phụ, kích thước sản phẩm khoảng 1500 bp, phù hợp với sản phẩm đoạn gen 16S rRNA mà cặp mồi tổng 27F và 1492R khuếch đại theo Lane et al. (1985). Sản phẩm PCR được giải trình tự và kết quả được so sánh với trình tự của cơ sở dữ liệu GenBank trên NCBI bằng công cụ Blastn.
Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn NMCM2 dài 770 nucleotide (Hình 12) và của chủng vi khuẩn VTTS1 dài 780 nucleotide (Hình 13).
Sau khi so sánh trình tự với cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI, kết quả có hai mức độ tương đồng là 92% và 91% giữa trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng NMCM2 và các trình tự trên cơ sở dữ liệu (Hình 14). Trong đó, trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng NMCM2 tương đồng 92% với trình tự của loài Bacillus stratosphericus, Bacillus pumilus và Bacillus attitudinis, tương đồng 91% với trình tự của loài Bacillus subtilis, và Bacillus aerophilus, Bacillus safensis và Vibrio cholerae.
Hình 14. Kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng với trình tự 16S rRNA của chủng NMCM2
Sau khi so sánh trình tự với cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI, kết quả có hai mức độ tương đồng là 94% và 93% giữa trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng VTTS1 và các trình tự trên cơ sở dữ liệu (Hình 15). Trong đó, trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng VTTS1 tương đồng 94% với trình tự của loài Bacillus stratosphericus, tương đồng 93% với trình tự của loài Bacillus safensis, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, , Bacillus aerophilus, Bacillus altitudinis, Bacillus aryabhattai và Vibrio cholerae.
Hình 15. Kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng với trình tự 16S rRNA của chủng VTTS1 bằng
công cụ Blastn trên NCBI.
Số nucleotide được giải trình tự của hai chủng vi khuẩn NMCM2 và VTTS1 lần lượt là 770 và 780 nucleotide là tương đối cao so với các kết quả giải trình tự khác, thường chỉ
giao động từ 400-500 nucleotide. Trình tự được so sánh càng dài thì độ tin cậy của kết quả sẽ càng cao.
Vì có nhiều đoạn trình tự trên cơ sở dữ liệu Genbank của NCBI có cùng độ tương đồng với trình tự của đoạn gen 16S rRNA của hai chủng vi khuẩn NMCM2 và VTTS1 nên chưa thể khẳng định được hai chủng vi khuẩn cần định danh thuộc loài nào. Cần thực hiện thêm một số khảo sát sinh hóa cụ thể để xác định tên loài của hai chủng vi khuẩn này.