a) Ly trích DNA
DNA của vi khuẩn được ly trích theo quy trình của Ulrich và Hughes (2001). Đầu tiên, vi khuẩn đối kháng được nuôi trong 6ml môi trường canh thang dinh dưỡng (nutrient broth), để qua đêm trên một máy lắc. Sau đó, chuyển 6 ml dung dịch vi khuẩn sang 3 tube 2,2 ml, mỗi tube chứa 2ml dung dịch vi khuẩn. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ phần trong, giữ phần tủa, gom chung phần tủa của 3 tube lại. Lấy phần tủa đem hòa tan với 500µl 50mM EDTA. Thêm 40 µl lysozyme (50mg/ml), lắc đều nhẹ, ủ ở 37oC trong 1 giờ ở máy ủ nhiệt, khoảng 20 phút lắc nhẹ tube 1 lần. Tiếp theo, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Đổ bỏ dung dịch nước, giữ lại phần tủa. Hòa tan phần tủa với 800
µl dung dịch phân giải DNA vi khuẩn Gram dương. Ngâm tube trong nitơ lỏng trong 1 phút, chuyển tube sang máy ủ nhiệt 80oC trong 2 phút, sau đó chuyển tube sang nitơ lỏng trong 1 phút. Ủ tiếp ở 37oC trong 30 phút ở máy ủ nhiệt, mỗi 5 phút trộn đều tube một lần để trộn đều dung dịch. Thêm 600 µl chloroform:isoamyl alcohol theo tỉ lệ 24:1. Trộn đều và ly tâm ở 13.000 vòng trong 10 phút. Kế tiếp, chuyển phần trong phía trên vào tube mới và thêm 1 ml ethanol 100%, lắc đều giữ ở -20oC trong ít nhất 30 phút. Ly tâm trong 10 phút ở 13.000 vòng/phút. Sau đó rửa 2 lần với 1ml ethanol 70%, ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Cuối cùng, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút ở 45oC trong máy ly tâm chân không, hòa tan DNA với 30 µl TE 0.1X hoặc nước cất, trữ ở -20oC.
b) Đo OD và pha loãng
Sau khi trích DNA của vi khuẩn, tiến hành đo OD, chọn và giữ lại mẫu DNA có tỷ số 260nm/280nm nằm trong khoảng 1,7-2,0 (Manchester, 1995; Manchester, 1996). Dựa vào giá trị OD260nm để tính nồng độ DNA gốc và pha loãng mẫu DNA gốc sao cho mẫu DNA sau pha loãng có nồng độ 40-50 ng/µl.
c) Khuếch đại đoạn gen 16S rRNA
Vùng DNA được chọn khuếch đại để xác định vi khuẩn là đoạn gen 16SrRNA. Đây là đoạn gen được bảo tồn ở các loại vi khuẩn và có nhiều phiên bản trong một tế bào vi khuẩn. Cặp mồi tổng 27F và 1492R (Lane et al., 1985) được sử dụng để khuếch đại đoạn gen 16S rRNA. Mồi xuôi 27F có trình tự 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ và mồi ngược 1492R có trình tự 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’. Thành phần tham gia phản ứng khuếch đại đoạn gen 16S rRNA được thực hiện theo Bảng 2.
Bảng 2. Thành phần phản ứng PCR Thành phần Nồng độ gốc Thể tích (µl) H2O cất khử trùng - 12,25 Buffer (NH4)2SO4 10X 2,50 MgCl2 25 mM 2,00 dNTPs 25 mM 3,00 DMSO 100% 0,50 Mồi 27F 100 pmol/µl 0,25 Mồi 1492R 100 pmol/µl 0,25 Taq-polymerase 5 U/µl 0,25 DNA 40-50 ng/µl 4,00 Tổng 25,00
Chu kỳ nhiệt: Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp phản ứng như Bảng 2, cho hỗn hợp trên vào máy chạy PCR thực hiện phản ứng khuếch đại PCR. Trước tiên là giai đoạn tiền biến tính ở 95oC trong 5 phút, sau đó lặp lại 34 chu kỳ được mở đầu bằng bước biến tính ở 95oC trong 1 phút, sau đó là bước gắn mồi vào khuôn ở 60oC trong 30 giây và cuối cùng là bước kéo dài ở 72oC trong 1 phút 20 giây. Sau 34 chu kỳ, phản ứng được duy trì trì ở 72oC trong 10 phút. Cuối cùng, sản phẩm PCR được giữ ở 10oC cho đến khi được lấy ra. Sản phẩm PCR có thể được trữ ở 4oC để sử dụng lâu dài.
d) Điện di sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được điện di theo phương pháp của Trần Nhân Dũng (2011). Phương pháp này bao gồm các bước chuẩn bị gel agarose 1,5%, bơm mẫu vào giếng của gel, chạy điện di và chụp hình gel.
Để chuẩn bị gel agarose 1,5%, ta đong 20 µl dung dịch TBE 1X cho gel 8 giếng hoặc 40 µl dung dịch TBE 1X cho gel 7 giếng. Tiếp theo, cân 0,3 g agarose cho gel 8 giếng hoặc 0,3 g agarose cho gel 17 giếng. Làm sạch chai chứa gel điện di TBE 1X cũ. Sau đó, cho agarose và dung dịch TBE 1X vào chai. Nấu chai chứa agarose và dịch TBE 1X trong lò vi sóng cho tan hết agarose. Kế tiếp, làm nguội dưới vòi nước máy sao cho nhiệt độ của dịch gel còn 55oC. Thêm vào 0,4 µl ethidium bromide cho gel 8 giếng hoặc
0,4 µl ethidium bromide cho gel 17 giếng. Lắc nhẹ theo hình số 8 và đổ vào khuân gel đã gắn lược, tránh tạo bọt khí.
Bước tiếp theo là bơm mẫu vào giếng của gel, chạy điện di và chụp hình gel. Sau khi đổ gel 30-45 phút, lấy lược ra khỏi khuôn gel. Lấy cẩn thận tránh làm bể giếng. Đặt gel vào khay điện di. Thêm dung dịch điện di TBE 1X vừa đủ để làm ngập gel khoảng 1mm. Làm cẩn thận để không có bọt khí trong giếng. Tiếp theo, trộn 10µl sản phẩm PCR với 2
µl loading buffer 10X và bơm vào giếng bằng micropipet. Sau đó, chạy điện di với hiệu điện thế 50V. Quá trình điện di được quan sát bởi sự di chuyển màu của loading buffer. Tắt nguồn điện khi vạch màu xanh của loading buffer chạy được khoảng 5/6 gel, để thang chuẩn không bị chạy ra ngoài. Cuối cùng, gel được chụp hình bằng máy Bio-Rad UV 2000.
e) Giải trình tự sản phẩm PCR
Các sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được tinh sạch, gắn huỳnh quang, tính sạch sản phẩm PCR có gắn huỳnh quang, biến tính và giải trình tự bằng hệ thống máy giải trình tự tự động ABI 3130 tại phòng Thí nghiệm Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học.
Tinh sạch sản phẩm PCR được thực hiện theo hướng dẫn của Isolate II PCR và Gel Kit. Đầu tiên, trộn sản phẩm PCR với binding buffer CB với tỷ lệ 1:2 (v/v). Đặt Isolate II PCR và cột Gel vào tube 2 ml, cho mẫu đã trộn vào cột. Tiếp theo, ly tâm 10.000 rpm trong 30 giây, bỏ nước. Thêm 600 µl wasti buffer CW vào cột.Ủ ở nhiệt độ phòng 2 phút. Sau đó, ly tâm 10.000 rpm trong 30 giây, bỏ nước. Ly tâm tiếp 10.000 rpm trong 1 phút để loại hết dung dịch. Đặt cột vào tube 1,5 ml. Cho vào 30 µl elution buffer C. Ủ khoảng 2 phút. Kế tiếp, ly tâm 10,000 rpm trong 1 phút. Cuối cùng, bỏ cột, giữ lại phần dịch. Đối với tube bị hỏng nắp thì chuyển phần dịch sang tube 1,5 mới. Đóng nắp tube và trữ mẫu ở -20oC.
Phản ứng gắn huỳnh quang được thực hiện theo Trần Nhân Dũng (2011). Thành phần hóa chất được cho vào tube thực phản ứng gắn huỳnh quang được mô tả ở Bảng 3.
Bảng 3. Thành phần phản ứng gắn huỳnh quang
Hóa chất Nồng độ gốc Thể tích (µl)
H2O cất khử trùng - 5
BigDye Terninator v3,1 Buffer 5X 1
Primer 27F - 1
16S rRNA 10-40 ng/µl 1
BigDye Terninator v3,1 2,5X 2
Tổng thể tích 10
Chu kỳ nhiệt: Trước tiên là giai đoạn tiền biến tính ở 96oC trong 1 phút, sau đó lặp lại 25 chu kỳ với bước mở đầu là biến tính ở 96oC trong 10 giây, sau đó là bước bắt cặp mồi vào khuôn ở 50oC trong 5 giây, cuối cùng là bước kéo dài ở 60oC trong 4 phút. Sau 25 chu kỳ, sản phẩm PCR được giữ ở 4oC cho đến khi được lấy ra.
Tinh sạch sản phẩm PCR có gắn huỳnh quang được thực hiện theo Trần nhân Dũng (2011). Đầu tiên, thêm 2,5 µl EDTA 125 mM. Tiếp theo, thêm 30 µl ethanol tuyệt đối. Lắc nhẹ tube, đảm bảo phần dưới đáy rời ra.Để 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 45 phút. Rút bỏ dịch. Thêm 30 µl ethanol 70%. Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 20 phút. Rút bỏ dịch (thực hiện 2 lần bước này). Cuối cùng, sấy khô chân không sản phẩm PCR ở 30oC khoảng 30 phút. Lưu ý, các bước làm nên hạn chế ánh sáng trực tiếp.
Biến tính sản phẩm và giải trình tự cũng được thực hiện theo phương pháp của Trần Nhân Dũng (2011). Trước hết, thêm vào sản phẩm PCR gắn huỳnh quang vừa tinh sạch 20 µl HiDi formamide. Tiếp theo, biến tính trên máy PCR ABI 9700 ở 95oC trong 7 phút. Để ngay trên đá trong 2 phút. Sau đó, hút mẫu đưa vào giếng của máy giải trình tự ABI 3130. Cuối cùng, thiết lập các thông số và chạy mẫu với máy ABI 3130 và tiến hành giải trình tự.