Sau khi đã khảo sát hình thái và một số đặc điểm cấu tạo cần thiết, các chủng vi khuẩn cần định danh sẽ được khảo sát các đặc tính sinh hóa. Dựa vào kết quả nhuộm Gram, hình dạng, sự liên kết, kích thước tế bào, các vi khuẩn được chia thành các nhóm nhỏ hơn như hình 4 và 5.
Hình 4. Phân nhóm vi khuẩn hình cầu và hình que Gram dương (Benson, 1997)
Trong quá trình định danh, tùy vào kết quả của từng bước trong hệ thống phân loại Bergey, chỉ các khảo sát sinh hóa cần thiết để xác định vi khuẩn thuộc nhóm nào trong các nhóm nhỏ hơn được thực hiện, từ đó xác định được vi khuẩn cần định danh thuộc chi nào và sau đó là dùng các khảo sát sinh hóa cần thiết để phân biệt vi khuẩn thuộc loài nào của chi. Một số khảo sát sinh hóa thông dụng được trích từ Benson (1997) bao gồm:
a) Khả năng chuyển hóa citrate
Khảo sát khả năng chuyển hóa citrate được sử dụng để xác định vi khuẩn có khả năng sử dụng citrate như là nguồn hydrocarbon duy nhất hay không. Sản phẩm chuyển hóa làm kiềm hóa môi trường và thay đổi màu của chất chỉ thị. Khảo sát này được thực hiện bằng cách cấy vi khuẩn vào môi trường Citrat Simmons, ủ ở 35-37oC trong 24 giờ. Phản ứng dương tính làm môi trường đổi từ màu xanh lá cây sang màu xanh nước biển. Môi trường không đổi màu trong phản ứng âm tính.
b) Hoạt tính men catalase
Khảo sát hoạt tính men catalaseđược sử dụng đểphát hiện men catalase chuyển hóa năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng ở các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tùy ý. Khảo sát này được thực hiện bằng cách dùng que cấy lấy
một ít vi khuẩn và nhúng vào giọt H2O2. Phản ứng dương tính cho thấy có bọt khí xuất hiện. Không có bọt khí xuất hiện trong phản ứng âm tính. Không nên sử dụng vi khuẩn cấy trên thạch máu vì dễ cho kết quả dương tính giả.
c) Hoạt tính men oxidase
Khảo sát hoạt tính men oxidase được sử dụng để phát hiện khả năng sinh enzyme cytochrome C oxidase của vi khuẩn. Pseudomonas aeruginosa , Neisseria gonorrhoeae
và Campylobacter jejuni là những vi khuẩn gây bệnh có oxidase dương tính. Khảo sát này được thực hiện bằng cách lấy một ít vi khuẩn nuôi cấy thuần bôi lên một tờ giấy lọc, nhỏ thuốc thử N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride lên. Phản ứng dương tính có màu tím. Đọc kết quả trong vòng 10 giây đầu.
d) Khả năng phân giải urea
Khảo sát khả năng phân giải urea được sử dụng để phát hiện enzyme urease phân giải urea thành ammonia và carbondioxide. Ammonia sinh ra làm kiềm hóa môi trường, là phản ứng đặc trưng cho các loài Proteus. Khảo sát này được thực hiện bằng cách cấy vi khuẩn vào canh thang ure (urea broth), ủ ở 37oC trong 24-48 giờ. Phản ứng dương tính, môi trường có màu tím đỏ. Môi trường không chuyển màu trong phản ứng âm tính.
e) Khả năng sinh indol
Khảo sát khả năng sinh indol được sử dụng để phát hiện các vi sinh vật có enzyme tryptophanase chuyển hóa tryptophan tạo thành indol. Khảo sát này được thực hiện bằng cách cấy vi khuẩn vào nước trypton, ủ ở 37oC trong 24 giờ. Nhỏ vài giọt thuốc thử kovacs. Phản ứng dương tính có vòng màu đỏ cánh sen nổi lên trên (do indol kết hợp với p-dimethylaminobenzal dehyde trong thuốc thử Kovacs). Không có màu hoặc màu vàng trong phản ứng âm tính. Với các chủng sinh indol chậm, nhỏ thuốc thử kovacs sau 48 giờ ủ ở 37oC.
f) Thử nghiệm methyl red (MR)
Thử nghiệm methyl red được sử dụng để phát hiện các vi khuẩn lên men glucose tạo sản phẩm acid bền. Vi khuẩn có phản ứng MR dương tính, pH môi trường ngày càng giảm. Vi khuẩn có phản ứng MR âm tính, pH môi trường tăng dần (các sản phẩm có tính
thực hiện bằng cách cấy vi khuẩn vào canh thang MR-VP (voges proskauer-methyl red broth). Ủ ở 37oC từ 2-5 ngày. Nhỏ vài giọt đỏ methyl 0,02%, đọc kết quả ngay. Phản ứng dương tính có màu đỏ. Màu vàng trong phản ứng âm tính.
g) Thử nghiệm voges proskauer (VP)
Thử nghiệm voges proskauer được sử dụng để phát hiện các vi khuẩn có hai loại enzyme chuyển hóa 2,3 butanediol thành acetoin khi có oxy và chuyển hóa tiếp acetoin thành diacetyl. Diacetyl kết hợp với guanidin trong peptone tạo phức diacetyl-guanidin có màu đỏ. Thử nghiệm này được thực hiện bằng cách cấy vi khuẩn vào môi trường MR-VP. Ủ ở 37oC trong 24-48 giờ. Nhỏ 6 giọt thuốc thử A (5% α naphtol) và 2 giọt thuốc thử B (KOH 40%). Lắc nhẹ. Đọc kết quả sau 20 phút, chậm nhất là 4 giờ. Phản ứng dương tính có màu đỏ trên mặt môi trường.
h) Khả năng lên men đường
Khảo sát khả năng lên men đường được sử dụng để phát hiện khả năng lên men đường của vi khuẩn. Vi khuẩn lên men đường sẽ làm giảm pH dẫn đến thay đổi màu của môi trường.
* Phương pháp MPN: Định lượng các vi khuẩn có khả năng lên men đường lactose sinh hơi. Phương pháp MPN đươc thực hiện bằng cách cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng chọn lọc có ống Durham. Ủ ở 37oC trong 24-48 giờ. Vi khuẩn lên men đường lactose sinh hơi sẽ làm thay đổi màu môi trường và có bóng hơi trong ống Durham.
* Lên men đường, sinh H2S (TSI): Gồm ba đường: lactose, succrose, glucose. Thực hiện bằng cách cấy hai bước. Đầu tiên cấy trên mặt nghiêng. Sau đó, cấy đâm sâu vào chân thạch. Ủ ở 37oC trong 24 giờ. Nếu chỉ lên men glucose, một lượng nhỏ glucose trong môi trường lên men trong giờ đầu nuôi cấy. Sau đó, vi khuẩn lấy năng lượng trong quá trình oxy hóa peptone, phần thạch nghiêng có màu đỏ (hiện tượng kiềm hóa môi trường). Peptone ở phần chân thạch không được sử dụng vì không có O2, phần chân vẫn giữ nguyên màu vàng. Nếu lên men cả glucose, sucrose và lactose, từ 18-24 giờ, toàn bộ phần chân và mặt nghiêng thạch có màu vàng. Sau 24 giờ, kiềm hóa môi trường do vi khuẩn sử dụng peptone, môi trường chuyển màu đỏ (chỉ ở phần mặt nghiêng vì peptone chuyển hóa
trong điều kiện hiếu khí. Nếu lên men sinh hơi sẽ thấy các bọt khí hoặc nứt thạch. Phân giải sodium thiosulfate thành hydrogen sulfide, phần chân thạch có màu đen (H2S+).
i) Khả năng khử nitrat
Khảo sát khả năng khử nitrat được sử dụng để phát hiện enzyme nitratase xúc tác khử nitrat thành nitrit và nitơ phân tử. Một số vi khuẩn có khả năng khử NO3
-
thành NO2- và sau đó chuyển hóa thành các hợp chất chứa Nitơ khác như amonia (NH3) và khí Nitơ (N2). Khảo sát này được thực hiện bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trong canh thang nitrat (nitrate broth), ủ ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó nhỏ thuốc thử có chứa alpha-napthylamine và acid sulfanilic . Hai hợp chất này kết hợp với nitrit để tạo thành hợp chất có màu đỏ (phản ứng dương tính). Tuy nhiên, nếu sản phẩm phân giải là amoniac và khí nitơ, ống thử nghiệm sẽ không chuyển màu nhưng vẫn được báo cáo là phản ứng nitrat dương tính. Trường hợp này cần tiến hành tiếp bước sau: Cho thêm một ít bột kẽm vào ống thử, kẽm sẽ chuyển hóa nitrat thành nitrit và ống thử sẽ có màu đỏ. Như vậy, kết luận phản ứng âm tính. Nếu ống thử không chuyển màu, phản ứng dương tính (vi khuẩn đã chuyển hóa hết nitrat có trong môi trường).
k) Hoạt tính men gelatinase
Khảo sát hoạt tính men gelatinase được sử dụng để phát hiện vi khuẩn có men gelatinase phân giải và hóa lỏng gelatin, quan sát thấy ngay cả khi nhiệt độ thấp hơn 28oC. Có hai phương pháp xác định sự có mặt của men gelatinase: cấy vi khuẩn vào thạch dinh dưỡng gelatin, ủ nhiệt độ phòng trong 14 ngày hoặc sử dụng phương pháp gelatin Strip. Phương pháp gelatin Strip sử dụng dải màu có phủ gelatin. Nếu phản ứng dương tính, có sự thay đổi màu. Một số chủng có khả năng hóa lỏng gelatin chậm nên giữ lại thử nghiệm trong hai tuần. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});