Theo Lê Văn Tám (2006), gen 16S rRNA là gen có chức năng cần thiết cho sự sống của vi khuẩn, vừa có vùng bảo tồn và vừa có vùng biến động ở các cấp độ khác nhau, tạo điều kiện thuận lợi cho việc định danh vi khuẩn hay xác định mối quan hệ họ hàng giữa hai hay nhiều loài vi khuẩn. Các gen này đã được giải trình tự và lưu trữ trong các cơ sở dữ liệu sinh học trực tuyến (Lê Văn Tám, 2006). Do đó, cần khuếch đại đoạn gen 16S rRNA của vi khuẩn để tiến hành giải trình tự và sau đó so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA với cơ sở dữ liệu để xác định vi khuẩn cần định danh thuộc loài nào.
Theo Trịnh Đình Đạt (2008), PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn DNA với tốc độ nhanh, chính xác cao được thực hiện trong máy chu trình nhiệt (máy PCR). PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men. Phương pháp này được thực hiện trong ống nghiệm (invitro)
với sự hiện diện của enzyme DNA polymerase. Kỹ thuật PCR dùng nhiệt độ cao (940C) tháo xoắn kết hợp với enzyme DNA polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều nhiệt thích hợp cho từng giai đoạn phản ứng tổng hợp với các đoạn mồi được thiết kế tùy mục tiêu nghiên cứu. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ gồm 3 bước sau:
- Biến tính (Denaturation)
Xử lý nhiệt độ để tách DNA mạch kép thành mạch đơn dùng làm khuôn để tổng hợp mạch mới. Nhiệt độ thường là 94-95oC, trong thời gian 2-5 phút.
- Gắn mồi (Primer annealing)
Nhiệt độ được hạ xuống 30-65oC trong khoảng 20 giây đến 2 phút. Các đoạn mồi sẽ gắn vào mạch khuôn theo nguyên tắc bổ sung. Sử dụng nhiệt độ không thích hợp trong giai đoạn này sẽ dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào đoạn DNA khuôn hay gắn một cách tùy tiện và không nhận được sản phẩm PCR theo ý muốn.
- Kéo dài ( Elongation)
Bốn loại dNTP (A, T, C, G) được lắp ráp vào đoạn DNA khuôn để tạo thành đoạn đơn DNA mới bổ sung với đoạn DNA khuôn bắt đầu từ mồi. Nhiệt độ bước này từ 68-
72oC. Thời gian kéo dài phụ thuộc vào cả DNA polymerase và chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại. Thường thời gian kéo dài 2-5 phút.
Theo Võ Thị Thương Lan (2007), số chu kỳ lập lại trong mỗi phản ứng từ 25 đến 50. Tuy nhiên, nếu kéo dài thời gian quá 30 chu kỳ thì khả năng sai sót sẽ tăng theo. Số lượng bản sao n chu kỳ sẽ là a x 2n, trong đó a là số đọan khuôn. Khi số chu kỳ lớn hơn 50, nồng độ dNTP, mồi và hoạt tính củaTaq bị suy giảm nghiêm trọng khi nồng độ đoạn khuôn tăng cao gây ức chế phản ứng PCR.