Trong những năm qua, sự phát triển của các kỹ thuật sinh học phân tử giúp quá trình định danh vi khuẩn ngày càng nhanh hơn. Việc định danh vi khuẩn chuyển dần từ phương pháp truyền thống sử dụng hệ thống phân loại Bergey sang phương pháp hiện đại sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại một chuỗi trình tự đặc hiệu của loài hoặc giải trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn. Trong đó, xu hướng sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA ngày càng chiếm ưu thế.
Trong thời gần đây, các tác giả Lê Bảo Trâm (2011), Nguyễn Văn Ngon (2011), Lê Thị Đan Thanh (2011), Trần Thị Dung (2011), Nguyễn Ngọc Giàu (2011) và Dương
Xuân Đào (2011) đã thực hiện các đề tài có liên quan đến phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn. Trong các đề tài nghiên cứu này, quá trình định danh vi khuẩn chỉ ngừng lại ở việc dựa vào mức độ tương đồng cao nhất giữa trình tự gen 16S rRNA của mẫu vi khuẩn và các chuỗi trình tự trên cơ sở dữ liệu NCBI. Hai tác giả Bằng Hồng Lam (2011) và Đỗ Thị Cẩm Hường (2012) cũng phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn dựa kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA. Tuy có khảo sát rõ hơn, cụ thể là loài có độ tương đồng cao nhất với trình tự gen 16S rRNA của mẫu vi khuẩn cũng có một số đặc tính phù hợp với các đặc tính của mẫu vi khuẩn đã khảo sát, nhưng các tác giả chưa giải thích cụ thể vì sao không chọn các loài vi khuẩn có cùng tỷ lệ tương đồng với loài được chọn, bởi vì có thể còn có loài khác cũng có một số đặc tính phù hợp với các đặc tính của mẫu vi khuẩn được khảo sát. Kết quả định danh của các nghiên cứu này chưa thật sự có sức thuyết phục cao. Ngoài ra, một số nghiên cứu khác còn có kết quả định danh chưa hợp lý.
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Phương tiện
3.1.1. Thời gian
Từ tháng 08/2013 đến 12/2013. 3.1.2. Địa điểm
Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.3. Vật liệu thí nghiệm
Vật liệu thí nghiệm là 2 chủng vi khuẩn NMCM2 và VTTS1 do Võ Thị Phương Trang (2013) phân lập tại An Giang có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn Xoo trên đĩa thạch và giúp giảm bệnh cháy bìa lá trong nhà lưới.
3.1.4. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
3.1.4.1. Dụng cụ thí nghiệm
Tuýp eppendorf , ống nghiệm, đĩa petri, kim cấy, bình tam giác, cốc thủy tinh, ống thủy tinh, bộ micropipet Gibson, đèn cồn, đầu pipet, lame, lamelle và một số dụng cụ vi sinh khác.
3.1.4.2. Thiết bị thí nghiệm
Tủ cấy vi sinh vật, tủ ủ vi sinh vật, kính hiển vi Olympus CHT, máy lắc mẫu, nồi khử trùng nhiệt ướt, pH kế Orion 420A, cân điện tử Sartorius, máy ly tâm Heraeus, máy ủ 65oC, máy OD Beckman DU-600, máy li tâm chân không Concentrator 5301, máy PCR Perkin Elmer PE 9700, hệ thống chụp hình gel Bio-Rad UV 2000, bộ điện di một chiều, máy giải trình tự.
3.1.5. Hóa chất
Hóa chất để pha môi trường thạch dinh dưỡng (nutrient agar) gồm peptone (5g/l), beef extract (3g/l), agar (15g/l) và NaCl (5g/l). Ngoài ra còn NaOH và HCl để chuẩn pH bằng 6.8 (APHA, 1920).
Hóa chất thực hiện các khảo sát sinh hóa: H2O2, đỏ phenol, ammonium dihydrogen phosphate, dipotassium phosphate, sodium citrate, magnesium sulfate, bromthymol blue, agar, sodium chloride, peptone, casein peptone, gelatin peptone, glucose, lactose, sucrose,
p –dimethylaminobenzaldehyde, HCl đặc, ferrous ammonium sulfate, sodium thiosulfate, lysine, bromocresol purple, glyxerin, triphenyltetrazolium clorua, đỏ methyl, crystal violet, ammonium oxalat, potasium iodide, iodine tinh thể, safranin, N,N,N',N'- tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride, kovacs...
Hóa chất ly trích DNA, PCR và điện di: buffer CTAB, ethanol 100%, ethanol 70%, chloroform, isoamylalcohol, isopropanol, SDS 10%, proteinase K, TE, MgCl2, ethidium bromide, agarose…
3.2. Phương pháp
3.2.1. Phương pháp truyền thống - Hệ thống phân loại Bergey
3.2.1.1. Khảo sát hình thái và cấu tạo của vi khuẩn
a) Nhuộm Gram
Theo Nguyễn Lân Dũng et al.( 2007), hóa chất nhuộm Gram bao gồm các dung dịch thuốc nhuộm crystal violet, lugol và carbon fuchsin (hoặc safranin), cần được chuẩn bị trước.
Để chuẩn dung dịch crystal violet cần chuẩn bị dung dịch A và B. Dung dich A được chuẩn bị bằng cách hòa tan 2g crystal violet hòa 20ml ethanol 95%. Dung dịch B được chuẩn bị bằng cách hòa tan 0,8g ammonium oxalat trong 80ml nước cất. Trộn đều 2 dung dich A và B, lọc qua giấy lọc thô thu được dung dịch crystal violet, giữ ở nhiệt độ phòng trong chai màu nâu.
Để chuẩn dung dịch lugol: Hòa tan 1g Iodine tinh thể và 2g Potasium iodide trong 300ml nước cất. Nghiền Iodine vào Potassium iodide trong 50 ml nước cất cho hòa tan hoàn toàn. Thêm phần nước cất còn lại, giữ ở nhiệt độ phòng trong chai nâu. Khi dung dịch mất màu phải pha lại.
Để chuẩn dung dịch carbon fuchsin cần chuẩn bị dung dịch A và B. Dung dich A được chuẩn bị bằng cách hòa tan 0,3g fuchsin trong 10 ml ethanol 95%. Dung dịch B
được chuẩn bị bằng cách cho 5ml phenol nóng chảy vào 95ml nước cất. Trộn đều dung dịch A và dung dich B, lọc qua giấy lọc thô thu được dung dịch carbon fuchsin.
Để chuẩn dung dịch safranin: Hòa tan 5 g safranin vào 100ml ethanol 95%, khuấy cho tan được dung dịch dịch safranin 5%, sau đó đổ thuốc nhuộm vào lọ thủy tinh màu tối. Trước khi dùng, pha safranin 5% với nước cất theo tỷ lệ 1:9 (vol/vol) để có dung dịch safranin 0, 5%.
Theo Sharmin và Rahman (2007), nhuộm Gram được thực hiện bằng cách dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 18-24 giờ) hòa vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí, sau đó cố định tế bào bằng cách hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần, tránh để tiêu bản quá nóng. Nhuộm bằng dung dịch crystal violet trong 30 giây, rửa nước 2 giây, rồi nhuộm lại bằng dung dịch Iodine trong 1 phút, rửa nước. Tiếp tục nhỏ ethanol 95% để tẩy màu, giữ khoảng 10 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước. Nhuộm bổ sung bằng dung dịch safranin trong 1 phút, rửa nước, thấm nước và để khô trong không khí. Cuối cùng, soi mẫu nhuộm dưới kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần. Vi khuẩn Gram dương bắt màu xanh tím, Gram âm bắt màu đỏ.
b) Khảo sát hình thái, kích thước và sự liên kết tế bào (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình thái, kích thước và sự liên kết của tế bào vi khuẩn được xác định bằng cách quan sát tiêu bản sống dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. Tiêu bản sống được làm như bằng cách dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch hòa vào 10 µl nước cất vô trùng ở giữa phiến kính với thao tác nhẹ nhàng, đậy lamen lại và quan sát dưới kính hiển vi.
c) Khảo sát khả năng di động
Theo Nguyễn Lân Dũng et al. (2007), khảo sát khả năng di động được sử dụng để phát hiện khả năng di của vi khuẩn nhờ có roi ở đầu tế bào. Khảo sát này được thực hiện bằng cách cấy vi khuẩn sâu trong thạch mềm 0,3-0,6% agar, khoảng 2/3 độ dài thạch. Ủ ở 37oC từ 18-24 giờ. Nếu phản ứng dương tính, vi khuẩn có thể di động xung quanh đường cấy, xoắn ốc hoặc làm đục toàn bộ ống thạch. Vi khuẩn chỉ phát triển trên đường cấy trong phản ứng âm tính.
d) Nhuộm bào tử
Nhuộm bào tử được thực hiện theo phương pháp của Schaeffer và Fulton (1933): - Chuẩn bị thuốc nhuộm:
+ Dung dịch malachite green 5%: Hòa tan 0,5 g malachite green vào 100ml nước cất, khuấy cho tan, sau đó đổ thuốc nhuộm vào lọ thủy tinh màu tối.
+ Dung dịch safranin O: Hòa tan 2,5 g safranin O vào 100ml ethanol 95%, khuấy cho tan được dung dịch dịch safranin O 2,5%, sau đó đổ thuốc nhuộm vào lọ thủy tinh màu tối. Trước khi dùng, pha safranin O 2,5% với nước cất theo tỷ lệ 1:9 (vol/vol) để có dung dịch safranin O 0,25%.
- Nhuộm bào tử: Vi khuẩn được nhuộm bào tử theo phương pháp Schaeffer-Fulton bằng cách dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (3-7 ngày) hòa vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí, sau đó cố định tế bào bằng cách hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. Đặt giấy thấm lên vết bôi vi khuẩn. Nhỏ thuốc nhuộm Malachite green cho thấm đều giấy thấm. Đặt mẫu nhuộm lên miệng cốc nước đang sôi để hơ nóng trong 5 phút, nếu thấy thuốc nhuộm malachite trên giấy thấm khô thì bổ sung thêm để cho mẫu không bị khô. Rửa nước, sau đó nhuộm lại bằng dung dịch safranine trong 30 giây. Rửa nước, thấm khô. Cuối cùng quan sát dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần. Kết quả bào tử có màu xanh lá, tế bào dinh dưỡng có màu đỏ.
3.2.1.2. Khảo sát các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn.
Không thực hiện hết các khảo sát sinh hóa mà tùy thuộc vào kết quả của từng bước trong hệ thống phân loại Bergey, chỉ các khảo sát sinh hóa cần thiết để xác định vi khuẩn thuộc nhóm nào trong các nhóm nhỏ hơn được thực hiện.
a) Khảo sát hoạt tính men catalase
Theo Benson (1997), khảo sát hoạt tính men catalase cần chuẩn bị dung dịch H2O2 nồng độ 3%, nhỏ một giọt lên phiến kính, dùng đầu que cấy lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hóa (24 giờ) trộn vào giọt H2O2 trên phiến kính. Nếu kết quả thấy sủi bọt là dương
b) Tính mẫn cảm đối với chất kháng sinh
Theo kỹ thuật đĩa giấy tẩm chất kháng khuẩn khuyếch tán của Nguyễn Thanh Hà (1991), trước tiên cần chuẩn bị môi trường thạch dinh dưỡng, đổ đĩa dày khoảng 3-4mm, pha loãng chất kháng khuẩn 2,5 µg/µl, rút 10 µl cho vào đĩa giấy, để khô 30 phút. Tiến hành cấy gạt vi khuẩn lên mặt đĩa thạch và đặt lên mặt thạch hai khoanh giấy có tẩm chất kháng khuẩn. Mẫu thử được nuôi trong tủ ấm 32oC trong 24-48 giờ. Quan sát vòng vô khuẩn tạo thành xung quanh các khoanh giấy chứa chất kháng khuẩn. Vòng vô khuẩn càng lớn thì vi khuẩn càng mẫn cảm.
c) Khảo sát khả năng đồng hóa nguồn carbon myo-inositol
Khảo sát khả năng đồng hóa nguồn carbon myo-inositol được thực hiện theo phương pháp của Nguyễn Lân Dũng et al. (2007). Trước tiên cần chuẩn bị môi trường khoáng cơ bản có bổ sung bromothymol blue và myo-inositol. Cân 2 g/l (NH4)2SO4, 0,2 g/l MgSO4.7H2O, 0,5 g/l NaH2PO4.H2O, 0,1 g/l CaCl2.2H2O, 0,5 g/l K2HPO4, 0,03g/l bromothymol blue và 10 g/l myo-inositol. Cho các hóa chất trên vào 1 lít nước cất, chuẩn pH=7,1. Sau cho đó bổ sung 15 g/l agar. Vi khuẩn được cấy trên đĩa thạch bằng que cấy và ủ ở 32oC trong 3 ngày. Nếu vi khuẩn chuyển hóa được myo-inositol sẽ sinh acid làm biến đổi màu môi trường từ xanh sang vàng. Ngược lại, vi khuẩn không chuyển hóa được myo-inositol màu môi trường không đổi hoặc chuyển sang màu xanh lam.
3.2.2. Phương pháp hiện đại - Giải trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn
3.2.2.1. Kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA
a) Ly trích DNA
DNA của vi khuẩn được ly trích theo quy trình của Ulrich và Hughes (2001). Đầu tiên, vi khuẩn đối kháng được nuôi trong 6ml môi trường canh thang dinh dưỡng (nutrient broth), để qua đêm trên một máy lắc. Sau đó, chuyển 6 ml dung dịch vi khuẩn sang 3 tube 2,2 ml, mỗi tube chứa 2ml dung dịch vi khuẩn. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ phần trong, giữ phần tủa, gom chung phần tủa của 3 tube lại. Lấy phần tủa đem hòa tan với 500µl 50mM EDTA. Thêm 40 µl lysozyme (50mg/ml), lắc đều nhẹ, ủ ở 37oC trong 1 giờ ở máy ủ nhiệt, khoảng 20 phút lắc nhẹ tube 1 lần. Tiếp theo, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Đổ bỏ dung dịch nước, giữ lại phần tủa. Hòa tan phần tủa với 800
µl dung dịch phân giải DNA vi khuẩn Gram dương. Ngâm tube trong nitơ lỏng trong 1 phút, chuyển tube sang máy ủ nhiệt 80oC trong 2 phút, sau đó chuyển tube sang nitơ lỏng trong 1 phút. Ủ tiếp ở 37oC trong 30 phút ở máy ủ nhiệt, mỗi 5 phút trộn đều tube một lần để trộn đều dung dịch. Thêm 600 µl chloroform:isoamyl alcohol theo tỉ lệ 24:1. Trộn đều và ly tâm ở 13.000 vòng trong 10 phút. Kế tiếp, chuyển phần trong phía trên vào tube mới và thêm 1 ml ethanol 100%, lắc đều giữ ở -20oC trong ít nhất 30 phút. Ly tâm trong 10 phút ở 13.000 vòng/phút. Sau đó rửa 2 lần với 1ml ethanol 70%, ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Cuối cùng, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút ở 45oC trong máy ly tâm chân không, hòa tan DNA với 30 µl TE 0.1X hoặc nước cất, trữ ở -20oC.
b) Đo OD và pha loãng
Sau khi trích DNA của vi khuẩn, tiến hành đo OD, chọn và giữ lại mẫu DNA có tỷ số 260nm/280nm nằm trong khoảng 1,7-2,0 (Manchester, 1995; Manchester, 1996). Dựa vào giá trị OD260nm để tính nồng độ DNA gốc và pha loãng mẫu DNA gốc sao cho mẫu DNA sau pha loãng có nồng độ 40-50 ng/µl.
c) Khuếch đại đoạn gen 16S rRNA
Vùng DNA được chọn khuếch đại để xác định vi khuẩn là đoạn gen 16SrRNA. Đây là đoạn gen được bảo tồn ở các loại vi khuẩn và có nhiều phiên bản trong một tế bào vi khuẩn. Cặp mồi tổng 27F và 1492R (Lane et al., 1985) được sử dụng để khuếch đại đoạn gen 16S rRNA. Mồi xuôi 27F có trình tự 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ và mồi ngược 1492R có trình tự 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’. Thành phần tham gia phản ứng khuếch đại đoạn gen 16S rRNA được thực hiện theo Bảng 2.
Bảng 2. Thành phần phản ứng PCR Thành phần Nồng độ gốc Thể tích (µl) H2O cất khử trùng - 12,25 Buffer (NH4)2SO4 10X 2,50 MgCl2 25 mM 2,00 dNTPs 25 mM 3,00 DMSO 100% 0,50 Mồi 27F 100 pmol/µl 0,25 Mồi 1492R 100 pmol/µl 0,25 Taq-polymerase 5 U/µl 0,25 DNA 40-50 ng/µl 4,00 Tổng 25,00
Chu kỳ nhiệt: Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp phản ứng như Bảng 2, cho hỗn hợp trên vào máy chạy PCR thực hiện phản ứng khuếch đại PCR. Trước tiên là giai đoạn tiền biến tính ở 95oC trong 5 phút, sau đó lặp lại 34 chu kỳ được mở đầu bằng bước biến tính ở 95oC trong 1 phút, sau đó là bước gắn mồi vào khuôn ở 60oC trong 30 giây và cuối cùng là bước kéo dài ở 72oC trong 1 phút 20 giây. Sau 34 chu kỳ, phản ứng được duy trì trì ở 72oC trong 10 phút. Cuối cùng, sản phẩm PCR được giữ ở 10oC cho đến khi được lấy ra. Sản phẩm PCR có thể được trữ ở 4oC để sử dụng lâu dài.
d) Điện di sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được điện di theo phương pháp của Trần Nhân Dũng (2011). Phương pháp này bao gồm các bước chuẩn bị gel agarose 1,5%, bơm mẫu vào giếng của gel, chạy điện di và chụp hình gel.
Để chuẩn bị gel agarose 1,5%, ta đong 20 µl dung dịch TBE 1X cho gel 8 giếng hoặc 40 µl dung dịch TBE 1X cho gel 7 giếng. Tiếp theo, cân 0,3 g agarose cho gel 8 giếng hoặc 0,3 g agarose cho gel 17 giếng. Làm sạch chai chứa gel điện di TBE 1X cũ. Sau đó, cho agarose và dung dịch TBE 1X vào chai. Nấu chai chứa agarose và dịch TBE 1X trong lò vi sóng cho tan hết agarose. Kế tiếp, làm nguội dưới vòi nước máy sao cho nhiệt độ của dịch gel còn 55oC. Thêm vào 0,4 µl ethidium bromide cho gel 8 giếng hoặc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
0,4 µl ethidium bromide cho gel 17 giếng. Lắc nhẹ theo hình số 8 và đổ vào khuân gel đã gắn lược, tránh tạo bọt khí.
Bước tiếp theo là bơm mẫu vào giếng của gel, chạy điện di và chụp hình gel. Sau khi đổ gel 30-45 phút, lấy lược ra khỏi khuôn gel. Lấy cẩn thận tránh làm bể giếng. Đặt gel vào khay điện di. Thêm dung dịch điện di TBE 1X vừa đủ để làm ngập gel khoảng 1mm. Làm cẩn thận để không có bọt khí trong giếng. Tiếp theo, trộn 10µl sản phẩm PCR với 2
µl loading buffer 10X và bơm vào giếng bằng micropipet. Sau đó, chạy điện di với hiệu