Trong số các vi khuẩn có trình tự gen 16S rRNA có cùng độ tương đồng 94% với trình tự của chủng VTTS1, Vibrio cholerae là vi khuẩn Gram âm, không sinh nội bào tử (Lê Huy Chính, 2010); kích thước của Bacillus subtilis là 0,7-0,8 x 2,0-3,0 μm (Paul et al., 2009) và của Bacillus attitudinis là 0,4-0,5 x 3-4 µm (Vijay et al., 2011); Bacillus stratosphericus và Bacillus aerophilus không thể phát triển ở 50oC (Shivaji et al., 2006);
Bacillus aryabhattai có khuẩn lạc màu hồng đào khi phát triển trên môi trường thạch dinh dưỡng (Shivaji et al., 2009). Trong khi đó, chủng vi khuẩn VTTS1 là vi khuẩn Gram dương, sinh nội bào tử, có kích thước tế bào là 0,5-0,7 x 1,0-1,2 µm, có thể phát triển ở 50oC, khuẩn lạc có màu trắng đục khi phát triển trên môi trường thạch dinh dưỡng. Như vậy, chủng vi khuẩn VTTS1 không thể là một trong các vi khuẩn vừa nêu mà chỉ có thể là
Bacillus safensis hoặc Bacillus pumilus.
Bacillus pumilus có kích thước là 0,6-0,7 x 2-3 μm (Paul et al., 2009), nếu chỉ dựa vào đặc điểm này thì chủng VTTS1 không thể là Bacillus pumilus mà phải là Bacillus safensis. Theo Satomi et al. (2006), Bacillus safensis có quan hệ mặt thiết với Bacillus pumilus. Tuy nhiên, Bacillus safensis có khả năng sử dụng nguồn carbon myo-inositol trong khi vi khuẩn Bacillus pumilus không sử dụng được nguồn carbon này. Để tăng độ tin cậy, khảo sát khả năng sử dụng myo-inositol như nguồn carbon duy nhất được thực hiện. Kết quả khảo sát cho thấy chủng vi khuẩn VTTS1 có khả năng sử dụng nguồn carbon myo-inositol để sinh trưởng và sinh acid làm đổi màu môi trường nuôi cấy từ xanh sang vàng, phù hợp với kết quả dương tính của vi khuẩn Bacillus safensis (Hình 18).
Hình 18. Kết quả dương tính làm đổi màu môi trường từ xanh sang vàng trong khảo sát khả năng sử dụng nguồn carbon carbon myo-inositol của chủng vi khuẩn VTTS1
Kết quả định danh cho thấy chủng NMCM2 là Bacillus stratophericus và chủng VTTS1 là Bacillus safensis. Theo Shi và Du (2012), Bacillus stratophericus có khả năng đối kháng với nấm gây bệnh mốc sương trên cà chua và Bacillus safensis là vi khuẩn có khả năng kháng lại ô nhiễm arsen, boron và muối (Raja and Omine, 2012). Hai vi khuẩn này không thuộc nhóm độc hại đối với con người, động vật và cây trồng. Đến thời điểm này, chưa có báo cáo nào đề cập đến tác hại của 2 vi khuẩn này đối với môi trường. Do đó, 2 vi khuẩn này rất có triển vọng để sản xuất chế phẩm sinh học khi đã thử nghiệm thành công trong điều kiện ngoài đồng.
Từ kết quả định danh hai chủng vi khuẩn NMCM2 và VTTS1 cho thấy cần phải kết hợp linh hoạt hai phương pháp truyền thống (sử dụng hệ thống phân loại của Bergey) và phương pháp hiện đại (giải trình tự gen 16S rRNA). Trên thực tế, một số nghiên cứu chỉ định danh vi khuẩn bằng cách giải trình tự gen 16S rRNA và dựa vào độ tương đồng cao nhất khi so sánh trình tự được giải với cơ sở dữ liệu Genbank của NCBI là chưa đủ cơ sở. Kết quả so sánh trình tự có thể cho nhiều tên vi khuẩn có tỷ lệ tương đồng bằng nhau, không thể chọn 1 tên vi khuẩn và loại bỏ các tên còn lại khi chưa cung cấp đủ căn cứ, đồng thời cũng không thể hoàn toàn loại bỏ các kết quả có độ tương đồng thấp hơn. Kết quả của luận văn này cho thấy chủng vi khuẩn VTTS1 có độ tương đồng với trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn Bacillus safensis là 93%, không phải là độ tương đồng cao nhất khi so sánh trình tự được giải bằng công cụ Blastn. Do đó, cần phải khảo sát thêm một số
đặc điểm hình thái và sinh hóa cụ thể cho từng trường hợp để giúp chọn được kết quả có độ tin cậy cao nhất. Việc lựa chọn các khảo sát hình thái và sinh hóa để thực hiện cũng cần được xem xét cẩn thận, lấy Hệ thống phân loại Bergey làm căn cứ để tiết kiệm chi phí, thời gian và cho kết quả phù hợp.
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Chủng vi khuẩn NMCM2 là Bacillus stratophericus và chủng VTTS1 là Bacillus safensis.
Kết quả của phương pháp truyền thống sử dụng Hệ thống phân loại Bergey cho thấy 2 chủng vi khuẩn NMCM2 và VTTS1 có khuẩn lạc màu trắng, tròn, lài và bìa gợn sóng trên môi trường thạch dinh dưỡng. Cả 2 là vi khuẩn Gram dương, hình que, sinh nội bào tử, sống riêng lẻ, có khả năng di động và kích thước lần lượt là 0,7-0,9 x 1,2-2,7 µm và 0,5-0,7 x 1,0-1,2 µm. Các chủng vi khuẩn này không thuộc nhóm kỵ khí bắt buộc, cho phản ứng catalase dương tính và có khả năng sử dụng nguồn carbon myo-inositol để sinh trưởng. Chủng NMCM2 mẫn cảm với kháng sinh ampicillin.
Kết quả của phương pháp hiện đại sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA của 2 chủng vi khuẩn cho thấy sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rRNA bằng cặp mồi tổng 27F và 1492R hiện băng rõ và không có băng phụ, kích thước khoảng 1500 bp, phù hợp với kết luận của Lane et al. (1985). Số nucleotide được giải trình tự của hai chủng vi khuẩn NMCM2 và VTTS1 lần lượt là 770 và 780, cao hơn so với các kết quả giải trình tự khác (thường chỉ giao động từ 400-500 nucleotide). Sau khi so sánh trình tự với cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI, các trình tự trên cơ sở dữ liệu có độ tương đồng cao nhất với trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng NMCM2 là 92% và của chủng VTTS1 là 94%. Kết quả định danh cho thấy chủng NMCM2 là Bacillus stratophericus với độ tương đồng là 92%, chủng VTTS1 là Bacillus safensis với độ tương đồng là 93%.
Quá trình định danh 2 chủng vi khuẩn NMCM2 và VTTS1 cho thấy cần có sự kết hợp linh hoạt giữa phương pháp truyền thống (sử dụng hệ thống phân loại của Bergey) và phương pháp hiện đại (giải trình tự gen 16S rRNA) để tiết kiệm chi phí, thời gian và cho kết quả đáng tin cậy.
Đến thời điểm này, chưa có báo cáo nào đề cập đến tác hại của 2 vi khuẩn này đối với môi trường, con người, động vật và cây trồng; vì vậy có triển vọng được dùng để sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh cháy bìa lá lúa sau khi thử nghiệm thành công trong điều kiện ngoài đồng.
5.2 Đề nghị
Khi định danh vi khuẩn, cần kết hợp linh hoạt giữa hai phương pháp truyền thống (Hệ thống phân loại Bergey) và hiện đại (giải trình tự gen 16S RNA) để có kết quả tin cậy, đồng thời tiết kiệm được thời gian và chi phí.
Tiếp tục khảo sát hiệu quả giúp giảm bệnh cháy bìa lá của hai vi khuẩn này trong điều kiện ngoài đồng.
Khảo sát hiệu quả kinh tế - xã hội khi sử dụng vi khuẩn đối kháng làm chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh cháy bìa lá.
Tiếp tục phân lập thêm các chủng vi khuẩn đối kháng tại nhiều địa phương khác nhau để chọn lọc các chủng vi khuẩn bản địa, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ứng dụng tại mỗi vùng sinh thái khác nhau của khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
Bằng Hồng Lam. 2011. Phân lập và định danh một số chủng vi khuẩn lactic chịu nhiệt từ thực phẩm lên men truyền thống. Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ, chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, trang 15-39.
Bộ Tài nguyên và Môi trường. 2012. Kịch bản biến đổi khí hậu, nước biển dâng cho Việt
Nam. Nxb. Tài nguyên - Môi trường và Bản đồ Việt Nam, trang 57-58.
Dương Xuân Đào. 2011. Phân lập và nhận diện vi khuẩn hòa tan Lân - Kali từ vật liệu phong hóa ở vùng núi Ba Hòn (Hòn Đất, Hòn Me, Hòn Quéo) Huyện Hòn Đất, Kiên Giang. Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ, chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, trang 19-56.
Đái Duy Ban. 2006. Công nghệ gen. Nxb. Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, trang 153-161. Đào Quốc Luận. 2011. Diễn đàn đảm bảo an ninh lương thực ở Việt Nam 21/9/2011.
Phòng Thương mại và Công nghiệp Việt Nam và Công ty DuPont phối hợp tổ chức. Thành phố Hồ Chí Minh, trang 1-2.
Đỗ Thị Cẩm Hường. 2012. Phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn dạ cỏ bò để thủy phân bã mía trong điều kiện invitro. Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ, chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, trang 15-63.
Lê Bảo Trâm. 2011. Phân lập và nhận diện một số chủng vi khuẩn nội sinh trong cây khóm. Luận văn tốt nghiệp Đại học, chuyên ngành Công nghệ Sinh học Tiên tiến, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, trang 19-34.
Lê Gia Hy. 1994. Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Steptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối cổ rễ phân lập ở Việt Nam. Luận án tiến sĩ, Hà Nội, trang 10-27.
Lê Huy Chính, 2010. Vi sinh y học. Sách đào tạo bác sĩ đa khoa. Bộ y tế. Nhà xuất bản y học. Hà Nội, 229 trang.
Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân. 1999. Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng. Nxb. Giáo Dục, Hà Nội, trang 51-147. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lê Thị Đan Thanh. 2011. Phân lập và nhận diện vi khuẩn hòa tan Lân và Kali từ vật liệu phong hóa ở núi đá vôi - Hà Tiên, Kiên Giang. Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ, chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, trang 19-52.
Lê Văn Tám. 2006. Xây dựng cơ sở dữ liệu hai gen 16S và 23S ở vi khuẩn. Ứng dụng cơ
sở dữ liệu này để phát hiện các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ (Bacterial
Meningitidis). Luận văn tốt nghiệp đại học Cộng nghệ sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh, trang 1-3.
Nguyễn Đắc Khoa, Dương Minh và Phạm Văn Kim. 2010. Sản xuất các sản phẩm sinh
học để quản lí bệnh hại lúa, cây ăn quả và rau màu theo hướng bền vững và không ô nhiễm môi trường. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ năm 2010 (16b): 117-126.
Nguyễn Đình Hải. 2012. Nghiên cứu chủng xạ khuẩn VN08A12 -Streptomyces toxytricini
có tiềm năng ứng dụng trong xử lý bệnh bạc lá lúa và thân thiện với môi trường. Luận văn ThS. ngành: Công nghệ Nano sinh học. Trường Đại học Quốc gia Hà Nội, trang 18-19.
Nguyễn Hồng Anh. 2012. Sàng lọc xạ khuẩn diệt vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa
Xanthomonas oryzae pv. oryzae và kích thích xạ khuẩn sinh kháng sinh. Luận văn tốt nghiệp Đại học ngành Sinh học. Tường Địa học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, trang 1-2.
Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến và Phạm Văn Ty .2007. Vi sinh vật học. Nxb. Giáo Dục, trang 161-217.
Nguyễn Ngọc Giàu. 2011. Phân lập và nhận diện một số chủng vi khuẩn hòa tan Lân và Kali trong vật liệu phong hóa từ đá Granite núi Cấm - An Giang. Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ, chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, trang 21-55.
Nguyễn Thanh Hà, 1991. Phương pháp kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán. Kỹ thuật xét nghiệm vi sinh vật Y học. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội, trang 329-338.
Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu. 2008. Giáo trình tin sinh học, bioinformatics. Nxb. Nông nghiệp, trang 111-112.
Nguyễn Trung Thành. 2011. “Điều tra bệnh cháy bìa lá lúa, biện pháp phòng trừ bằng vôi và thuốc hóa học”. Phòng Dự báo, Chi cục Bảo vệ Thực vật An Giang, trang 1-3.
Nguyễn Văn Ngon. 2011. Nhận diện vi khuẩn phân hủy lignin trong mụn xơ dừa. Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ, chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, trang 22-29.
Nguyễn Vĩnh Phúc và Nguyễn Thị Lang. 2005. Ứng dụng marker phân tử để đánh giá bệnh cháy bìa lá trên cây lúa Oryza sativa L. Tạp chí nông nghiệp và Phát triển
Nông thôn: 28-30.
Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyến và Nguyễn Mạnh Chinh. 2003. Cẩm nang sâu bệnh hại
cây trồng. Nxb. Nông nghiệp, Hà Nội, trang 92-97.
Phạm Văn Kim. 2007. Vi sinh đại cương. Giáo trình giảng dạy trực tuyến, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Đại học Cần Thơ, trang 49-50.
Phạm Văn Kim, Phạm Văn Dư, Hồ Văn Chiến, Lê Hữu Hải, Võ Văn Á, Đỗ Văn Vấn, Huỳnh Minh Châu và T.W. Mew. 1999. Kết quả bước đầu trong nghiên cứu sử dụng vi khuẩn đối kháng để đối phó với bệnh đốm vằn hại lúa (Rhizoctonia solani) tại Đồng bằng Sông Cửu Long. Tuyển tập công trình nghiên cứu khoa học Trường Đại học Cần Thơ năm 1999, trang 70-76.
Phan Hữu Tôn. 2004. Chiến lược chọn tạo giống lúa chống bệnh cháy bìa lá miền Bắc Việt Nam. Tạp chí Nông nghiệp & PTNT. Nxb. Nông nghiệp, số 4/2004: 1191-1194. Trần Quốc Tuấn. Số liệu chưa công bố. Xác định đa dạng quần thể vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh cháy bìa lá tại thành phố Cần Thơ. Luận văn Thạc sĩ ngành Bảo vệ thực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Đại học Cần Thơ, trang 1-20.
Trần Nhân Dũng và Nguyễn Vũ Linh. 2011. Giáo trình tin sinh học. Nxb. Đại học Cần Thơ, trang 3-50.
Trần Nhân Dũng. 2011. Sổ tây thực hành Sinh học Phân tử. NXb Đại học Cần Thơ, trang 10-56.
Trần Thị Dung. 2011. Tuyển chọn và nhận diện một số chủng vi khuẩn khử Đạm phân lập từ nước thải nhà máy sữa và trại chăn nuôi bò sữa. Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ, chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, trang 22-57.
Trần Thị Xuân Mai. 2010. Giáo trình thực tập sinh học phân tử. Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học. Trường Đại học Cần Thơ, trang 19-20.
Trịnh Đình Đạt. 2008. Công nghệ di truyền. Công nghệ sinh học, 4. Nxb. Giáo dục, trang 40-55.
Võ Thanh Hoàng và Nguyễn Thị Nghiêm. 1993. Bệnh cây chuyên khoa (Plant disease). Giáo trình trường Đại học Cần Thơ, trang 65-74. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Võ Thị Phương Trang. 2013. Phân lập, định danh và khảo sát khả năng phòng trừ bệnh
cháy bìa lá lúa của vi khuẩn đối kháng trong đất tỉnh An Giang. Luận văn Thạc Sĩ chuyên ngành Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ, trang 24.
Võ Thị Thương Lan. 2007. Giáo trình sinh học phân tử tế bào và ứng dụng, Nxb. Giáo dục, trang 169-172.
Vũ Triệu Mân. 2003. Chuẩn đoán nhanh bệnh hại thực vật. Nxb. Nông nghiệp, trang 19-23. Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề, Nguyễn Kim Vân, Đỗ Tấn Dũng, Nguyễn Ngọc Châu, Ngô
Thị Xuyên, Nguyễn Văn Viên, Vũ Hữu Yêm và Ngô Bích Hảo. 2007. Bệnh cây đại cương. Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội, trang 30-48.
Vũ Triệu Mân, Ngô Bích Thảo, Lê Lương Tề, Nguyễn Kim Vân, Đỗ Tấn Dũng, Ngô Thị Xuyên, Nguyễn Ngọc Châu. 2007. Giáo trình bệnh cây chuyên khoa. Trường Đại học Nông Nghiệp I-Hà Nội, trang 135-138.
Tiếng Anh
Agrios, G.N. 2005. Plant disease caused prokaryotes bacteria and mollicutes. In plant pathology 5th ed. Academic Press, pp.615-703.
APHA (American Public Health Association). 1920. Standard methods of water analysis, 4th ed. American Public Health Association, Washington, D.C, pp.96-115.
Benson, H.J. 1997. Microbiological Applications: A Laboratory Manual in General Microbiology, Complete Version: 7th Edition. McGraw-Hill Professional Publishing, pp.145-173.
Beríc, T., M. Kojíc, S. Stankovíc, L. Topisirovíc, G. Degrassi, M. Myers, V. Venturi and D. Fira. 2012. Antimicrobial activity of Bacillus sp. Natural isolates and their potential use in the biocontrol of phytopathogenic bacteria. Food Technol. Biotechnol, 50 (1):25-31.
Bokura, U. 1911. Bacterial leaf blight of rice in Japanese. Teikoku Nokaiho, 2:62-66. Cao, L.Y., J.Y. Zuhuang, S.J. Yuan, X.D. Zhan, K.L. Zheng and S.H. Cheng. 2003.
Hybrid rice resistant to bacterial leaf blight developed by maker-assisted selection.
Rice Sci. 11 (1-2):68-70.
Crookshank, E. M. 1886. An introduction to practical bacteriology: Based upon the methods of Koch. J. H. Vail and Co, New York, pp.44-54.
Curtis, L. 1885. The cultivation of bacteria and the cholera bacillus. Proc. Am. Soc. Microscopists, 7:142–150.
Dorner, W. 1926. Un procédé simple pour la colouration des spores. Le Lait, 6:8-12. Exconde, O.R. 1973. Yield losses due to bacterial leaf blight of rice. Philippines
agriculture 57:128-140.
Ezuka, A and H. Kaku. 2000. A historical review of Bacterial Blight of Rice. Bulletin of