khảo sát tỷ lệ escherichia coli sinh men betalactamase phổ rộng và xác định kiểu gen ctxm từ gà khỏe tại tỉnh trà vinh

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y NGUYỄN THỊ NGUYỆT KHẢO SÁT TỶ LỆ ESCHERICHIA COLI SINH MEN BETA-LACTAMASE PHỔ RỘNG VÀ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CTX-M TỪ GÀ KHỎE TẠI TỈNH TRÀ VINH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y Cần Thơ, 2014 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y KHẢO SÁT TỶ LỆ ESCHERICHIA COLI SINH MEN BETA-LACTAMASE PHỔ RỘNG VÀ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CTX-M TỪ GÀ KHỎE TẠI TỈNH TRÀ VINH Cán hướng dẫn Sinh viên thực Th.S BÙI THỊ LÊ MINH NGUYỄN THỊ NGUYỆT MSSV: 3103042 Lớp: CN10Y4A1 – K36 Cần Thơ, 2014 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y Đề tài “Khảo sát tỷ lệ dƣơng tính E. coli sinh men beta-lactamase phổ rộng xác định kiểu gen CTX-M từ gà khỏe tỉnh Trà Vinh” sinh viên Nguyễn Thị Nguyệt thực phòng thí nghiệm vi sinh, Bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ từ tháng 8/2014 đến tháng 12/2014. Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014 Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014 Duyệt Bộ Môn Cán hƣớng dẫn Th.S Bùi Thị Lê Minh Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014 Duyệt Khoa Nông Nghiệp Sinh Học Ứng Dụng i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học tập rèn luyện mái trường Đại Học Cần Thơ nói chung, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng nói riêng. Thầy cô gắn bó, nhiệt tình dạy bảo dành tâm huyết cho nghiệp trồng người, truyền dạy cho nhiều điều quý báo kinh nghiệm nghề nghiệp để làm hành trang vững bước vào đời. Hôm nay, ước mơ thành thật, với phấn đấu thân với tận tình giúp đỡ thầy cô nguồn động lực cha mẹ, hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Nay nói lời biết ơn thành kính gửi đến người quan tâm lo lắng giúp đỡ thời gian qua. Xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, người có công nuôi dưỡng, dạy dỗ tạo hội cho để có ngày hôm nay. Xin chân thành cám ơn cô Bùi Thị Lê Minh, người hết lòng bảo, quan tâm suốt trình thực hiện đề tài. Quý thầy cô Bộ môn Thú Y Bộ môn Chăn Nuôi tận tình truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báo, lẫn nhận thức xã hội trình học trường. Cùng tất anh chị cao học K19, 20, bạn Thú Y Dược Thú Y K36, bạn lớp Thú Y liên thông K38 cô nuôi gà tỉnh Trà Vinh chia giúp đỡ trình thực đề tài. Cuối lời xin chúc quý thầy cô anh, chị, em bạn dồi sức khỏe thành đạt sống! Nguyễn Thị Nguyệt ii TÓM LƢỢC Qua việc lấy mẫu phân lỗ huyệt gà khỏe kỹ thuật vô trùng năm địa điểm tỉnh Trà Vinh bao gồm huyện Cầu Kè, Tiểu Cần, Cầu Ngang, Càng Long TP. Trà Vinh, tổng số 120 mẫu, đồng thời tiến hành khảo sát tỷ lệ dương tính E. coli sinh men ESBL phương pháp đĩa kết hợp xác định kiểu gen CTX-M kỹ thuật PCR, từ tháng đến tháng 12 năm 2014. Kết ghi nhận gà thịt tuần tuổi huyện Cầu Kè Tiểu Cần có tỷ lệ dương tính E. coli ESBL 83,33% cao so với huyện Cầu Ngang 16,67%. Tương tự tiến hành gà thịt tháng tuổi, tỷ lệ dương tính E. coli ESBL huyện Cầu Kè, Tiểu Cần, Cầu Ngang, Càng Long TP. Trà Vinh 33,33%, 16,67%, 66,67%, 50% 50%, nhiên khác biệt ý nghĩa thống kê. Đối với gà đẻ tỷ lệ gà dương tính E. coli ESBL huyện Tiểu Cần TP. Trà Vinh 91,67% chiếm tỷ lệ cao so với huyện Cầu Ngang với tỷ lệ 50%. Khi so sánh tỷ lệ dương tính E. coli ESBL loại gà gà đẻ chiếm tỷ lệ cao 73,33%, thấp gà thịt chiếm tỷ lệ 50%. Đồng thời tiến hành xác định kiểu gen CTX-M 30 chủng E. coli ESBL phân lập từ loại gà, kết có 24/30 (80%) chủng E. coli mang gen CTX-M mã hóa ESBL. iii Mục lục Trang duyệt i Lời cảm ơn ii Tóm lược iii Mục lục . iv Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục hình vii Danh mục bảng viii CHƢƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƢƠNG 2: CƠ SỞ LÝ LUẬN .2 2.1 Sơ lược vi khuẩn Escherichia coli .2 2.1.1 Đặc điểm hình thái .2 2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy 2.1.3 Đặc tính sinh hóa 2.1.4 Sức đề kháng độc tố E. coli .4 2.2 E. Coli sinh men beta-lactamase phổ rộng .6 2.2.1 Men beta-lactamase phổ rộng 2.2.2 Một số phương pháp phát ESBL 2.3 Tình hình nghiên cứu E. Coli sinh men ESBL gà .9 2.4 Giới thiệu phương pháp PCR .11 2.4.1 Nguyên tắc chung .11 2.4.2 Thành phần phản ứng PCR 12 2.4.3 Các giai đoạn phản ứng PCR .12 2.4.4 Kiểm tra kết PCR 14 2.4.5 Ứng dụng phương pháp PCR 15 CHƢƠNG 3: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 3.1 Phương tiện nghiên cứu 16 3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu 16 iv 3.1.2 Dụng cụ hóa chất thí nghiệm 16 3.2 Phương pháp nghiên cứu .16 3.2.1 Phương pháp lấy mẫu .16 3.2.2 Phương pháp phân lập E. Coli sinh men ESBL .17 3.2.3 Phương pháp xác định gen CTX-M mã hóa ESBL .19 3.3 Phương pháp xử lý số liệu .20 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 4.1 Kết khảo sát tỷ lệ diện E. coli sinh men ESBL gà thịt tuần tuổi .21 4.2 Kết khảo sát tỷ lệ diện E. coli sinh men ESBL gà thịt tháng tuổi .22 4.3 Kết khảo sát tỷ lệ diện E. coli sinh men ESBL gà đẻ .23 4.4 So sánh tỷ lệ diện E. coli sinh men ESBL loại gà 25 4.5 Kết xác định gen CTX-M mã hóa men beta-lactamase phổ rộng .26 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 28 5.1 Kết luận .28 5.2 Đề nghị .28 TÀI LIỆU THAM KHẢO .29 PHỤ CHƢƠNG 33 v DANH MỤC VIẾT TẮT CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT ĐẦY ĐỦ ESBL Extended Spectrum Beta Lactamase ETEC Enterotoxigenic E. coli EPEC Enteropathogenic E. coli EIEC Enteroinvasive E. coli VTEC Vasotoxin E. coli APEC Avian Panthogenic E. coli LT Heat Labile Enterotoxin ST Heat Stable Enterotoxin CRD Chronic Respiratory Disease CLSI Clinical And Laboratory Standards Institute Cz Ceftazidime/ Clavulanic acid Ct Cefotaxime/ Clavulanic acid kb Kilo base bp Base pair Da Dalton TBE Tris-borate-EDTA TAE Tris-acetate-EDTA PCR Polymerase chain reaction DNA Deoxyribo Nucleic Acid TP Thành phố vi DANH MỤC BẢNG Bảng Tựa bảng Trang 2.1 Các thông số điện di DNA agarose gel 15 3.1 Thành phần phản ứng PCR 19 3.2 Trình tự primer sử dụng phản ứng PCR 19 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR dùng để xác định gen CTX-M 20 4.1 Tỷ lệ diện E. coli sinh men ESBL gà thịt tuần tuổi 21 4.2 Tỷ lệ diện E. coli sinh men ESBL gà thịt tháng tuổi 22 4.3 Tỷ lệ diện E. coli sinh men ESBL gà đẻ 23 4.4 Kết phân lập E. coli sinh men ESBL diện phân loại gà khỏe 25 vii DANH MỤC HÌNH Tựa hình Hình Trang 2.1 Vi khuẩn E. Coli kính hiển vi quang học 2.2 Phản ứng PCR – bước biến tính 12 2.3 Phản ứng PCR – bước bắt cặp mồi vào sợi khuôn 13 2.4 Phản ứng PCR – bước kéo dài chuỗi 13 2.5 Phản ứng PCR – sản phẩm DNA sau chu kỳ 13 2.6 Sản phẩm cuối phản ứng PCR 13 3.1 Quy trình phân lập E.coli sinh men ESBL 18 4.1 Biểu đồ thể tỷ lệ diện E. coli ESBL gà đẻ 4.2 huyện 24 Kết PCR gen CTX-M gà thịt tháng tuổi 27 viii 4.4 So sánh tỷ lệ diện E. coli sinh men ESBL loại gà Bảng 4.4: Kết phân lập E. coli sinh men ESBL diện phân loại gà khỏe Loại gà Gà thịt tuần tuổi Số mẫu (con) Số mẫu dƣơng tính (con) Tỷ lệ (%) 30 17 56,67a a Tổng 50a Gà thịt tháng tuổi 30 13 43,33 Gà đẻ 60 44 73,33b 73,33b 120 74 61,67 61,67 Tổng Các giá trị số mũ cột khác khác có ý nghĩa thống kê (P [...]... về E coli sinh men ESBL và kiểu gen CTX-M của chúng là rất cần thiết Với lý do trên và được sự hướng dẫn của Th.S Bùi Thị Lê Minh tôi thực hiện đề tài Khảo sát tỷ lệ Escherichia coli sinh men beta-lactamase phổ rộng và xác định kiểu gen CTX-M từ gà khỏe tại tỉnh Trà Vinh Mục tiêu của đề tài: - Xác định tỷ lệ E coli sinh men ESBL trên gà khỏe tại tỉnh Trà Vinh - Xác định kiểu gen CTX-M mã hóa men ESBL... cho kiểu gen CTX-M với nồng độ 1µM 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu Nghiên cứu được tiến hành khảo sát trên 120 mẫu phân gà khỏe tại tỉnh Trà Vinh, trong đó có 30 mẫu gà thịt 1 tuần tuổi, 30 mẫu gà thịt 1 tháng tuổi và 60 mẫu gà đẻ tại tỉnh Trà Vinh gồm năm huyện: Cầu Kè, Tiểu Cần, Cầu Ngang, Càng Long và TP .Trà Vinh 16 Lấy mẫu phân gà: dùng tăm bông vô trùng đưa vào lỗ huyệt của gà. .. cứu phổ biến nhất, cụ thể là: Một nghiên cứu của Daniela et al (2009) về việc xác định tỷ lệ E coli sinh men ESBL trên mẫu phân gà thịt khỏe tại Bồ Đào Nha, kết quả thu được có 42,1% (32/76mẫu) dương tính với E coli sinh men ESBL Theo Dhanji, Murphy et al (2010) đã phân lập E coli sinh men ESBL trên thịt gà sống nhập khẩu từ Nam Mỹ vào nước Anh Kết quả có 62/210 mẫu dương tính với E coli sinh men ESBL,... được phân lập từ mẫu phân trực tràng của gà ở nước Anh là 54,5% Nghiên cứu của Horton et al (2011) về E coli sinh men ESBL mang gen CTX-M ở trâu bò, gà và heo Kết quả cho thấy tỷ lệ E coli mang gen CTX-M trên gà là 46,88% (15/32 mẫu) Felix et al (2013) với kết quả là 89% (66/74 mẫu) E coli ESBL mang gen loại CTX-M khi nghiên cứu về Enterobacteria sinh men ESBL có trong phân gà khỏe với tỷ lệ là 72,5%... (2013) về Enterobacteria sinh men ESBL có trong phân gà khỏe với tỷ lệ là 72,5% (37/51 mẫu), trong đó vi khuẩn E coli hiện diện nhiều nhất và kiểu gen mã hóa ESBL loại CTX-M chiếm tỷ lệ cao nhất là 89% (66/74 chủng E coli) , với tỷ lệ nhiễm CTX-M trong những năm gần đây cao hơn so với TEM và SHV Như vậy một khi dịch bệnh do E .coli sinh men ESBL gây ra thì việc điều trị kháng sinh tất yếu sẽ không mang... điều kiện cho E coli ESBL hiện diện trong cơ thể của gà con, chính vì vậy mà gà giai đoạn còn nhỏ vẫn có sự xuất hiện của E coli ESBL 58.33 75 Cầu Kè Tiểu Cần TP Trà Vinh Cầu Ngang 50 91.67 Càng Long 91.67 Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện tỷ lệ hiện diện E coli ESBL trên gà đẻ tại các huyện 24 4.4 So sánh tỷ lệ hiện diện E coli sinh men ESBL giữa các loại gà Bảng 4.4: Kết quả phân lập E coli sinh men ESBL hiện... trạng đề kháng kháng sinh với việc sản xuất các men ESBL ở E coli 25 4.5 Kết quả xác định gen CTX-M mã hóa men beta-lactamase phổ rộng Qua kết quả phân lập các chủng vi khuẩn E coli dương tính ESBL trên gà khỏe, dựa vào vòng vô khuẩn theo tiêu chuẩn của CLSI 2012, chọn ngẫu nhiên 30 khuẩn lạc từ sự phân lập trên gà khỏe, mỗi loại gà bao gồm gà thịt 1 tuần tuổi, 1 tháng tuổi và gà đẻ ta chọn ra 10 khuẩn... mã hóa men ESBL trên gà khỏe tại tỉnh Trà Vinh 1 CHƢƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 2.1 Sơ lƣợc về vi khuẩn Escherichia coli Theo Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên (2006), vi khuẩn Escherichia coli thuộc lớp: Schyzomycetes, bộ: Eubacteriales, họ: Enterobacteriaceae, tộc: Escherichiae, giống: Escherichia, loài: Escherichia coli Escherichia coli được gọi tắt là E .coli còn có tên là Bacterium coli commue được ông... chủng E coli Trong số các chủng này có 30% sản sinh nhóm 2 CTX-M ESBLs, 27% sản sinh nhóm 8 CTX-M ESBLs, 42% sản sinh CMY-type AmpC enzymes và 1% sản xuất một nhóm 2 CTX-M cùng với một enzyme CMY; không có E coli nào sản xuất CTX-M-15 ESBL và dòng vô tính ST131 9 Overdevest et al (2011) đã xác định tỷ lệ và những đặc tính các gen beta lactamase phổ rộng của vi khuẩn E coli ở người và thịt gà bán lẻ tại. .. và chụp ảnh 3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phương pháp Chi Bình Phương (Chi-Square Text), sử dụng phẩn mềm Minitab 16.0 20 CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ hiện diện E coli sinh men ESBL trên gà thịt 1 tuần tuổi Bảng 4.1: Tỷ lệ hiện diện E coli sinh men ESBL trên gà thịt 1 tuần tuổi Gà thịt 1 tuần tuổi Địa điểm Số mẫu (con) Số mẫu dƣơng tính (con) Tỷ lệ . tiến hành xác định kiểu gen CTX-M trên 30 chủng E. coli ESBL phân lập từ các loại gà, kết quả có 24/ 30 (80%) chủng E. coli mang gen CTX-M mã hóa ESBL. iv Mục lục. sinh men ESBL 18 4.1 Biểu đồ thể hiện tỷ lệ hiện diện E. coli ESBL trên gà đẻ tại các huyện 24 4.2 Kết quả PCR của gen CTX-M trên gà thịt 1 tháng tuổi 27 1. ướt, màu trắng đục hơi lồi, để lâu có dạng khô rìa hơi nhăn. Môi trường thạch thịt Pepton sau 18 -24 giờ bồi dưỡng trong tủ ấm ở 37 0 C, chúng mọc thành những khuẩn lạc ẩm ướt, ánh màu xám, kích