Khảo sát vi khuẩn escherichia coli sinh beta lactamase phổ rộng trên gà tại một số trại chăn nuôi ở đồng bằng sông cửu long tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Bệnh lý học chữa bệnh vật nuôi Mã ngành: 62 64 01 02 BÙI THỊ LÊ MINH KHẢO SÁT VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI SINH BETA-LACTAMASE PHỔ RỘNG TRÊN GÀ TẠI MỘT SỐ TRẠI CHĂN NUÔI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Cần Thơ, 2018 CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn: PGS.TS Lưu Hữu Mãnh Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: ……………………….……, Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc … … ngày … tháng … năm 2018 Phản biện 1: ……………………………… Phản biện 2: ……………………………… Phản biện 3: ……………………………… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ A Các báo công bố Bùi Thị Lê Minh, Lưu Hữu Mãnh, Nguyễn Nhựt Xuân Dung, 2016 Khảo sát diện Escherichia coli sinh β-lactamase phổ rộng gà khỏe tỉnh Vĩnh Long Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 2: 22-27 Bùi Thị Lê Minh, Lưu Hữu Mãnh, Nguyễn Nhựt Xuân Dung, 2016 Khảo sát diện gen CTX-M, TEM SHV Escherichia coli sinh β-lactamase phổ rộng phân lập từ gà tỉnh Trà Vinh Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, số 42(b): 1-6 Bùi Thị Lê Minh, Lưu Hữu Mãnh, Nguyễn Nhựt Xuân Dung, 2016 Kết khảo sát Escherichia coli sinh β-lactamase phổ rộng gà số sở giết mổ tỉnh Vĩnh Long Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, số chuyên đề tập 2: 1-5 Bùi Thị Lê Minh, Lưu Hữu Mãnh, Nguyễn Nhựt Xuân Dung, 2016 Tình hình nhiễm Escherichia coli sinh β-lactamase phổ rộng gà bệnh tỉnh Vĩnh Long Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, số chuyên đề tập 2: 6-10 Bui Thi Le Minh, Luu Huu Manh, Nguyen Nhut Xuan Dung, 2016 Study of extended spectrum beta-lactamase producing Escherichia coli isolated from sick chickens in Hau Giang province Proceeding of The 19th Federation of Asian Veterinary Associations Congress, September 6-9th 2016, Ho Chi Minh city Vietnam National University-Ho Chi Minh city Press, 148-150 Bui Thi Le Minh, Luu Huu Manh, Nguyen Nhut Xuan Dung, 2016 Occurrence of extended spectrum beta-lactamase producing Escherichia coli in chickens from slaughter houses in the Mekong delta of Vietnam Proceedings international conference on agriculture development in the context of international integration: Opportunities and challenges, December 7-8th 2016, Ha Noi Agriculture University Press, 198-202 Bui Thi Le Minh, Luu Huu Manh, Nguyen Nhut Xuan Dung, 2017 Occurrence of TEM, SHV and CTX-M genes in diarrhea chickens and antibiotic resistance Proceeding of 33th World Veterinary Congress, August 27-31 2017, Incheon-Korea Bùi Thị Lê Minh, Lưu Hữu Mãnh, Nguyễn Nhựt Xuân Dung, 2018 Tình hình nhiễm Escherichia coli sinh beta-lactamase phổ rộng người chăn nuôi gà Đồng sơng Cửu Long Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, số chuyên đề tập 54: 1-5 B Các đề tài nghiên cứu khoa học đƣợc nghiệm thu Bùi Thị Lê Minh (chủ nhiệm đề tài) Khảo sát vi khuẩn Escherichia coli sinh beta-lactamase phổ rộng gà kiểm tra độ nhạy số loại kháng sinh Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường Đại học Cần Thơ, 2015, mã số T2015 -62 Bùi Thị Lê Minh (chủ nhiệm đề tài) Khảo sát gen bla CTX-M, bla TEM bla SHV Escherichia coli sinh beta-lactamase phổ rộng phân lập từ gà bệnh tỉnh Vĩnh Long Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường Đại học Cần Thơ, 2016, mã số T2016 -52 Bùi Thị Lê Minh (chủ nhiệm đề tài) Khảo sát gen TEM, SHV CTX-M Escherichia coli sinh beta-lactamase phổ rộng phân lập từ người chăn nuôi gà Đồng sông Cửu Long Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường Đại học Cần Thơ, 2017, mã số T2017-50 CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết luận án Bệnh E coli bệnh nhiễm khuẩn phổ biến gà thịt gà đẻ nuôi công nghiệp (Raji et al., 2003) Vi khuẩn E coli thường tìm thấy đường tiêu hóa gà thải phân gà bị nhiễm qua phân, nước uống, bụi môi trường bị ô nhiễm Sự nhiễm trùng E coli dẫn đến nhiều thể bệnh cục hệ thống viêm ống dẫn trứng, viêm dịch hồn, viêm túi nỗn hồng, viêm ruột tiêu chảy, viêm màng não, viêm mắt, viêm khớp, viêm đường hô hấp Bệnh E coli xảy gà lứa tuổi, gây bệnh số tử số cao dẫn đến thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi (Barnes et al., 2008) Ngày nay, việc sử dụng kháng sinh thường xuyên thức ăn, nước uống để phòng trị bệnh kích thích tăng trưởng dẫn đến áp lực chọn lọc vi khuẩn, làm xuất chủng E coli đề kháng với nhiều loại kháng sinh làm cho việc điều trị bệnh kháng sinh có hiệu thấp (Linder, 2015) Trong năm gần đây, chủng vi khuẩn kháng thuốc ngày nhiều đề kháng kháng sinh vấn đề quan tâm nghiên cứu sâu rộng giới, đặc biệt vi khuẩn E coli sinh beta-lactamase phổ rộng (E coli sinh ESBL) Bởi vi khuẩn E coli sinh ESBL khơng có khả bất hoạt hầu hết kháng sinh nhóm beta-lactam dùng phổ biến mà đề kháng với nhiều nhóm kháng sinh khác sử dụng phổ biến aminoglycoside, macrolide, chloramphenicol, tetracycline fluoroquinolone (Lee, 2006) Nhiều nghiên cứu E coli sinh ESBL gia súc người thực nhiều nước giới Một số báo cáo công bố Blanc et al (2006) tìm thấy tỉ lệ nhiễm E coli sinh ESBL gà Catalonia, Tây Ban Nha 59,8% Ở Bỉ, Smet et al (2008) xác định diện E coli sinh ESBL gà tuần tuổi khỏe mạnh 45% Nghiên cứu Costa et al (2009) 76 mẫu phân gà thịt sở giết mổ miền Bắc Bồ Đào Nha cho thấy diện E coli sinh ESBL 38,2% Mamza et al (2010) nghiên cứu gà Maiduguri, Nigeria cho thấy tỉ lệ nhiễm E coli gà khỏe 4,3% (25/582), gà bệnh 28,7% (64/223), tỉ lệ nhiễm E coli sinh ESBL gà 11,1% (89/805) Báo cáo Overdevest et al (2011) Hà Lan năm 2009 cho thấy có 79,8% (68/89) mẫu thịt gà cửa hàng dương tính với vi khuẩn E coli sinh ESBL 74,2% (23/31) bệnh nhân điều trị từ bệnh viện dương tính với E coli sinh ESBL Ở Việt Nam, số cơng trình nghiên cứu E coli sinh ESBL động vật, sản phẩm chăn nuôi môi trường công bố: Van Thi Thu Hao et al (2008) khảo sát diện E coli sinh ESBL 30 mẫu thịt gà, 50 mẫu thịt heo thu thập từ chợ siêu thị xung quanh thành phố Hồ Chí Minh, 43 mẫu phân gà tháng tuổi, kết cho thấy tỉ lệ nhiễm vi khuẩn E coli sinh ESBL thịt gà 89,5%, thịt heo 75% phân gà 95% Võ Thành Thìn ctv (2011) nghiên cứu gen đề kháng kháng sinh nhóm beta-lactam chủng E coli phân lập từ heo tiêu chảy Nam Trung Bộ Tây Nguyên cho thấy có 115/184 chủng E coli có khả sinh loại beta-lactamase, chiếm tỉ lệ cao beta-lactamase mã hóa gen TEM (61,96%) SHV (0,54%) Kết nghiên cứu Bùi Thị Ba ctv (2012) E coli phân lập từ trâu bò khỏe mạnh số tỉnh Nam Trung Bộ cho thấy có 64,70% (22/34) chủng E coli có khả sinh loại beta-lactamase, chiếm tỉ lệ cao beta-lactamase có kiểu gen TEM (64,70%) SHV (11,76%) Hồ Thị Kim Hoa ctv (2013) nghiên cứu 45 mẫu chất thải (15 mẫu nước thải tươi, 15 mẫu nước thải biogas 15 mẫu phân gà) cho thấy có 82,22% (37/45) mẫu dương tính với gen mã hóa beta-lactamase phổ rộng TEM, 8,89% (4/45) mẫu dương tính với SHV, khơng phát mẫu dương tính với CTX-M Các kết nghiên cứu giới Việt Nam nêu cho thấy vi khuẩn E coli sinh ESBL không diện gia súc gia cầm mà diện nhiều đối tượng khác có liên quan người chăn nuôi, sản phẩm thịt yếu tố môi trường khác Đồng sơng Cửu Long có chăn nuôi gia cầm phát triển, đứng sau tỉnh miền Đông Nam Bộ, đặc biệt chăn nuôi gà công nghiệp gà thả vườn giống địa phương Cũng vùng chăn nuôi khác nước, vấn đề dịch bệnh gà nói chung bệnh E coli đặc biệt E coli sinh ESBL nói riêng xảy vùng Đồng sông Cửu Long vấn đề quan tâm nhà chăn nuôi nhà khoa học chúng diện nhiều đối tượng đề kháng với nhiều nhóm kháng sinh khác Tuy nhiên, thông tin lưu hành vi khuẩn E coli sinh ESBL hạn chế Vì vậy, để có thêm sở cho việc phòng trị bệnh E coli sinh ESBL gia cầm; phòng tránh vấy nhiễm từ gia cầm sang đối tượng khác đặc biệt người chăn nuôi, luận án tiến hành để nghiên cứu lưu hành E coli sinh ESBL gà yếu tố khác có liên quan thực trạng đề kháng kháng sinh E coli sinh ESBL làm sở khoa học ban đầu cho nghiên cứu giúp cho việc phòng trị bệnh E coli gà có hiệu giảm thiểu lan truyền vi khuẩn đề kháng kháng sinh từ chăn nuôi sang người 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Xác định lưu hành E coli sinh ESBL gà nuôi quy mô trang trại hộ gia đình, yếu tố có liên quan trứng gà, người chăn nuôi gà, thịt gà sở giết mổ yếu tố môi trường khu vực chăn nuôi sở giết mổ số tỉnh Đồng sông Cửu Long - Xác định đặc tính đề kháng kháng sinh E coli sinh ESBL số loại kháng sinh sử dụng phổ biến gà - Đánh giá tương đồng di truyền gen CTX-M TEM E coli sinh ESBL phân lập từ gà, trứng, người chăn nuôi gà môi trường chăn nuôi 1.3 Những điểm luận án - Đã xác định lưu hành E coli sinh ESBL gà quy mô trang trại hộ gia đình với tỉ lệ cao Các yếu tố có liên quan trứng gà, người chăn nuôi gà, thịt gà sở giết mổ yếu tố môi trường khu vực chăn nuôi sở giết mổ gia cầm ghi nhận có diện E coli sinh ESBL - Xác định vi khuẩn E coli sinh ESBL gà nhạy cảm cao với số loại kháng sinh aminkacin, fosformycin colistin - Đã xác định tương đồng di truyền cao gen CTX-M TEM vi khuẩn E coli sinh ESBL phân lập từ gà, trứng, người chăn nuôi gà môi trường chăn nuôi CHƢƠNG 2: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung, thời gian địa điểm nghiên cứu Đề tài thực ba nội dung nghiên cứu sau Nội dung 1: Khảo sát diện E coli sinh ESBL gà nuôi quy mô trang trại hộ gia đình, trứng gà, thịt gà sở giết mổ, người chăn nuôi gà số yếu tố môi trường khu vực chăn nuôi sở giết mổ Mục tiêu xác định tỉ lệ nhiễm E coli sinh ESBL đối tượng nghiên cứu để tìm lưu hành vi khuẩn gà đối tượng có liên quan đến chăn nuôi gà Nội dung 2: Khảo sát đề kháng kháng sinh E coli sinh ESBL số loại kháng sinh bao gồm nhóm beta lactams loại sử dụng phổ biến cho gà Mục tiêu tìm kháng sinh hiệu vi khuẩn E coli sinh ESBL số kháng sinh sử dụng phổ biến chăn ni nhằm phục vụ cho việc phòng trị bệnh E coli có hiệu Nội dung 3: Phân tích trình tự nucleotide số gen mã hóa betalactamase phổ rộng xây dựng phả hệ di truyền Xác định diện gen CTX-M, TEM mã hóa betalactamase phổ rộng, giải trình tự nucleotide gen xây dựng phả hệ di truyền Mục tiêu tìm xem có tương đồng di truyền gen vi khuẩn E coli sinh ESBL phân lập từ gà, trứng, môi trường chăn nuôi người chăn nuôi, giúp ngăn ngừa lây truyền vi khuẩn đề kháng sinh chăn nuôi gà ngăn ngừa lây truyền vi khuẩn đề kháng sinh từ động vật sang người góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng Thời gian nghiên cứu: Từ năm 2014 đến năm 2017 Địa điểm thu thập mẫu: Tại 304 hộ 104 trang trại chăn nuôi gà, 12 sở giết mổ Đồng sông Cửu Long gồm tỉnh Vĩnh Long, Trà Vinh, Sóc Trăng Hậu Giang Địa điểm phân tích mẫu: Phân lập vi khuẩn, khảo sát tính nhạy cảm vi khuẩn với kháng sinh thực phản ứng PCR Trường Đại học Cần Thơ, phân tích trình tự nucleotide gen Cơng ty Macrogen, Hàn Quốc 2.2 Phƣơng tiện nghiên cứu Các thiết bị cần thiết bao gồm tủ đông, máy tiệt trùng ướt, máy tiệt trùng khô, tủ ấm, máy lắc, máy quang phổ UV-VIS, hệ thống PCR Mơi trường hóa chất dùng nuôi cấy, phân lập định danh vi khuẩn E coli Giấy tẩm kháng sinh loại Các loại hóa chất sử dụng cho PCR, giải mã gen 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phƣơng pháp thu thập mẫu Mẫu thí nghiệm thu thập khu vực khu vực chăn nuôi gà sở giết mổ Ở khu vực chăn nuôi, mẫu thu thập theo hai quy mô chăn nuôi chăn nuôi gà quy mơ hộ gia đình (50-180 gà/hộ) trang trại (6.000-14.000 gà/trại) Ở hộ gia đình, hình thức chăn ni gà thịt gà đẻ chuồng Ở trang trại, hình thức chăn ni gà thịt chuồng gà đẻ nuôi chuồng lồng Tổng số 408 hộ/trại (304 hộ gia đình 104 trang trại) khảo sát Để phân tích tương đồng di truyền gen TEM CTX-M, 80 hộ/trại (60 hộ gia đình 20 trang trại) thu thập loại mẫu trứng, gà, người chăn nuôi gà môi trường chăn nuôi (gồm nước sinh hoạt, nước máng uống, thức ăn máng ăn khơng khí chuồng ni) Bên cạnh đó, 12 sở giết mổ tập trung khảo sát sở dây chuyền giết mổ treo 11 sở giết mổ Mỗi tỉnh chọn sở giết mổ với công suất lớn, phân phối thịt gà chủ yếu tỉnh Tại sở giết mổ, mẫu thu thập gồm gà môi trường giết mổ (nước sinh hoạt, nước vặt lông con, nước thải, khơng khí mẫu swab sàn pha lóc thịt) Mẫu thu thập tỉnh Vĩnh Long (thị xã Bình Minh, huyện Bình Tân, Mang Thít, Trà Ơn, Tam Bình, Long Hồ), Trà Vinh (thành phố Trà Vinh, huyện Tiểu Cần, Càng Long, Cầu Kè, Cầu Ngang, Châu Thành), Sóc Trăng (các huyện Kế Sách, Châu Thành, Long Phú, Trần Đề, Ngã Năm, Vĩnh Châu, Long Phú, Mỹ Tú) Hậu Giang (thành phố Vị Thanh, huyện Vị Thủy, Châu Thành, Phụng Hiệp, Ngã Bảy) 2.3.1.1 Số lượng mẫu thu thập hộ gia đình trang trại Mẫu thu thập theo phương pháp điều tra cắt ngang Số lượng gà thu thập tỉnh tính theo cơng thức tính dung lượng mẫu Cannon and Reo (1982) trích dẫn Thrusfield (2005), ước tính tỉ lệ lưu hành E coli sinh ESBL sử dụng phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên đơn giản: n= Z2*P*(1- P)/d2 Trong n: số mẫu cần lấy, P: tỉ lệ lưu hành ước đoán, d: sai số cho phép với tỉ lệ lưu hành ước đoán Với độ tin cậy 95%, P=50% d=5%, số lượng gà thu thập tối thiểu tỉnh 384 gà Tổng số gà khỏe gà có triệu chứng tiêu chảy thu thập tỉnh 2.040 gà, - gà thu thập hộ trại Đối với gà có trạng thái khỏe mạnh, mẫu khảo sát mẫu phân Đối với gà có triệu chứng tiêu chảy, mẫu khảo sát gồm thịt, gan, phổi phân Thông tin Công nghệ Sinh học Mỹ (NCBI: National Center for Biotechnology Information) phương pháp nucleotide Blast Mức độ tương đồng nucleotide amino acid mẫu phân tích phần mềm BioEdit Phần mềm Mega 6.0 sử dụng để xây dựng phả hệ di truyền phương pháp Maximum-likelihood 2.3.6 Các tiêu theo dõi Tỉ lệ lưu hành E coli sinh ESBL gà, trứng, người chăn nuôi, môi trường chăn nuôi môi trường giết mổ Tỉ lệ E coli sinh ESBL phân lập từ gà người chăn nuôi gà nhạy cảm, trung gian, đề kháng với kháng sinh Tỉ lệ E coli sinh ESBL phân lập từ gà người chăn nuôi gà đa kháng với kháng sinh Tỉ lệ lưu hành gen TEM, SHV, CTX-M E coli sinh ESBL phân lập từ gà, trứng, người chăn nuôi gà, môi trường chăn nuôi môi trường giết mổ Xác định tương đồng trình tự nucleotide gen TEM, CTX-M E coli sinh ESBL phân lập từ gà, trứng, người chăn nuôi gà môi trường chăn nuôi Cách tính tỉ lệ (%): R= Số mẫu dương tính * 100/ Số mẫu kiểm tra 2.3.7 Phƣơng pháp phân tích thống kê Sự khác biệt tỉ lệ so sánh phương pháp Chi-Square Test phần mềm Minitab version 16.0 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Sự lƣu hành E coli sinh ESBL hộ gia đình trang trại 3.1.1 Sự lƣu hành E coli sinh ESBL gà theo tỉnh Kết nghiên cứu cho thấy tỉ lệ lưu hành E coli sinh ESBL gà Đồng sông Cửu Long 62,01%, tỉ lệ lưu hành E coli sinh ESBL gà tỉnh Hậu Giang (44,44%) thấp gà tỉnh Vĩnh 10 Long (65,93%), Trà Vinh (68,73%) Sóc Trăng (66,22%) có ý nghĩa thống kê (P = 0,00) Một số kết nghiên cứu giới cho thấy tỉ lệ nhiễm E coli sinh ESBL gà Bỉ 45% (Annemieke Smet et al., 2008), Bồ Đào Nha 38,2% (Daniela Costa et al., 2009), Maiduguri Nigeria 4,3% (Sunday Akidarju Mamza et al., 2010), Nhật 40,43% (Midori Hiroi et al., 2012), Thụy Sĩ 63,4% (Nadine Geser et al., 2012) Bảng 3.1: Tỉ lệ lưu hành E coli sinh ESBL gà theo tỉnh Tỉnh Vĩnh Long Trà Vinh Sóc Trăng Hậu Giang Tổng cộng Số mẫu khảo sát (con) 590 550 450 450 2.040 Số mẫu dương tính (con) 389 378 298 200 1.265 Tỉ lệ (%) 65,93a 68,73a 66,22a 44,44b 62,01 Ghi chú: Các giá trị cột mang chữ mũ a, b khác khác có ý nghĩa thống kê (P