khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn escherichia coli sinh beta lactamases phổ rộng trên gà khỏe tại huyện long hồ tỉnh vĩnh long

1 CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi gà đang phát triển mạnh mẽ với quy mô lớn, việc phát triển đàn một cách nhanh chóng đã làm tăng nguy cơ lây lan dịch bệnh,

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

NGUYỄN HUỲNH ĐẢM

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN

ESCHERICHIA COLI SINH BETA-LACTAMASES

PHỔ RỘNG TRÊN GÀ KHỎE TẠI HUYỆN

LONG HỒ TỈNH VĨNH LONG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGÀNH THÚ Y

Cần Thơ, 2014

i

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGÀNH THÚ Y

MSSV: 3103014 Lớp: CN10Y4A1 – Khóa 36

Cần Thơ, 2014

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN

ESCHERICHIA COLI SINH BETA-LACTAMASES

PHỔ RỘNG TRÊN GÀ KHỎE TẠI HUYỆN

LONG HỒ TỈNH VĨNH LONG

ii

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài “Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn Escherichia coli sinh beta – lactamases phổ rộng trên gà khỏe tại huyện Long Hồ tỉnh Vĩnh Long” do sinh

viên Nguyễn Huỳnh Đảm thực hiện tại Bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp & Sinh

Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ từ tháng 8 năm 2014 đến tháng 12 năm

2014

Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014 Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014

ThS Bùi Thị Lê Minh

Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014 Duyệt Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

Xin chân thành biết ơn!

Cô Bùi Thị Lê Minh đã dành thời gian quý báo, hết lòng chỉ bảo, giúp đỡ và động viên tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Cô Châu Thị Huyền Trang, cố vấn học tập đã luôn nhắc nhở và động viên tôi trong suốt thời gian học tập ở trường

Quý Thầy, Cô Bộ môn Thú y và Bộ môn Chăn nuôi đã tận tình truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm vô cùng quý báu với tôi trong suốt thời gian qua

lệ hiện diện E coli ESBL (85,5%) cao hơn ở gà đẻ (40%) Sự hiện diện của E coli

ESBL trên mẫu thịt, gan, phổi và phân lần lượt là 13,6%; 7,3%; 19,1% và 62,7%

v

MỤC LỤC

TRANG TỰA i

TRANG DUYỆT ii

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM LƯỢC iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH ix

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 2

2.1 Giới thiệu vi khuẩn E coli 2

2.1.1 Đặc điểm hình thái E coli 3

2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy E coli 3

2.1.3 Đặc tính sinh hóa 4

2.1.4 Cấu trúc kháng nguyên 5

2.1.5 Sức đề kháng 6

2.1.6 Độc tố vi khuẩn 6

2.1.7 Tính gây bệnh 7

2.2 Giới thiệu về vi khuẩn sinh ESBL 7

2.3 Giới thiệu một số phương pháp phát hiện vi khuẩn sinh ESBL 9

2.3.1 Phương pháp ChromID ESBL agar 9

2.3.2 Phương pháp đĩa đôi 9

2.3.3 Băng giấy E-test ESBL 9

2.3.4 Phương pháp đĩa kết hợp 10

vi

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

3.1 Phương tiện nghiên cứu 11

3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu 11

3.1.2 Hóa chất 11

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ 11

3.2 Phương pháp nghiên cứu 11

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu 11

3.2.2 Phương pháp phân lập E coli ESBL 12

3.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 14

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15

4.1 Kết quả khảo sát sự hiện diện của E coli ESBL trên gà thịt khỏe 15

4.2 Kết quả khảo sát sự hiện diện của E coli ESBL trên gà đẻ khỏe 16

4.3 Kết quả khảo sát sự hiện diện của E coli ESBL trên gà công nghiệp 18

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 21

5.1 Kết luận 21

5.2 Đề nghị 21

TÀI LIỆU THAM KHẢO 22

PHỤ CHƯƠNG 24

1 Một số hình ảnh thu thập được trong thời gian nghiên cứu 24

2 Kết quả xử lí thống kê 26

vii

DANH MỤC VIẾT TẮT

EAEC Enteroaggregative E coli

viii

DANH MỤC BẢNG

4.3 Tỷ lệ sự hiện diện của E coli ESBL trên gà thịt và gà đẻ 18

ix

DANH MỤC HÌNH

3.1 Quy trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn E coli ESBL 13 4.1 So sánh sự hiện diện của E coli ESBL trên gà thịt 15 4.2 So sánh sự hiện diện của E coli ESBL trên gà đẻ 17 4.3 So sánh sự hiện diện của E coli ESBL trên gà thịt và gà đẻ 18

1

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi gà đang phát triển mạnh mẽ với quy

mô lớn, việc phát triển đàn một cách nhanh chóng đã làm tăng nguy cơ lây lan dịch bệnh, thậm chí phát sinh nhiều bệnh nguy hiểm gây thiệt hại lớn cho nhà chăn

nuôi, trong đó phải kể đến Colibacillosis do vi khuẩn Escherichia coli trên gà Vi khuẩn E coli là nguyên nhân gây viêm rốn, viêm túi lòng đỏ ở gà con, viêm túi khí, nhiễm trùng huyết và thường kết hợp với Mycoplasma gallisepticum gây viêm

khớp, sưng phù đầu, viêm màng bụng (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012)

Vĩnh Long là một tỉnh có vị thế phát triển mạnh về chăn nuôi đặc biệt là chăn nuôi

gà theo mô hình công nghiệp, do đó sự ảnh hưởng của E coli trên đàn gà là không

thể tránh khỏi Trong những năm gần đây, một số nghiên cứu cho thấy vi khuẩn

E coli sinh men beta – lactamases phổ rộng là một trong những nguyên nhân gây

thất bại trong việc điều trị bệnh nhiễm khuẩn bằng kháng sinh do vi khuẩn tiết ra men beta - lactamases phổ rộng làm bất hoạt kháng sinh nhóm beta – lactam và

một số nhóm kháng sinh khác Vì vậy, việc nghiên cứu về vi khuẩn E coli sinh

men beta – lactamases là rất cần thiết nên đề tài “Khảo sát sự hiện diện của vi

khuẩn Echerichia coli sinh beta – lactamases phổ rộng trên gà khỏe tại huyện

Long Hồ tỉnh Vĩnh Long” được thực hiện nhằm mục tiêu xác định tỷ lệ vi khuẩn

E coli sinh men beta – lactamases dương tính trên gà khỏe nuôi công nghiệp

2

CHƯƠNG 2

CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.1 Giới thiệu vi khuẩn E coli

Vi khuẩn Escherichia coli thuộc họ Enterobacteriaeceae được bác sĩ người Đức là

Theodor Escherich (1858 - 1911) phân lập đầu tiên và đưa ra đặc điểm của vi

khuẩn vào năm 1885 E coli thường xuất hiện rất sớm bên trong đường ruột của

người và động vật sơ sinh (sau đẻ 2 giờ), chúng thường ở phần sau của ruột, ít khi xuất hiện ở dạ dày hay ruột non Trong nhiều trường hợp chúng được tìm thấy ở niêm mạc của nhiều bộ phận khác nhau trong cơ thể (Nguyễn Như Thanh, 1997)

Trong các vi khuẩn đường ruột loài Escherichia coli là loài phổ biến nhất, chúng

sinh sống bình thường trong đường ruột của người và động vật Khi các điều kiện nuôi dưỡng, khẩu phần thức ăn, vệ sinh thú y kém, sức chống đỡ bệnh tật của con

vật yếu, thì E coli trở nên cường độc và có khả năng gây bệnh (Đào Trọng Đạt,

1999)

Theo Nataro and Kaper (1998) có 6 nhóm E coli gây bệnh được biết đến đó là:

Enteropathogenic E coli (EPEC) mang yếu tố bám dính và có khả năng xâm

nhiễm vào ruột non, phá hủy lớp tế bào biểu mô ruột, kèm theo biểu hiện sốt và tiêu chảy Vi khuẩn thuộc nhóm này thường gây bệnh ở người, thỏ, chó, mèo, heo

và có thể ở ngựa

Enterotoxigenic E coli (ETEC) vi khuẩn thuộc nhóm này thường có khả năng

mang yếu tố kháng nguyên bám dính và sinh độc tố đường tiêu hóa Vi khuẩn nhóm này thường gây bệnh tiêu chảy trên người, heo, cừu, gà, bò, chó và ngựa

Enteroinvasive E coli (EIEC) vi khuẩn xâm nhiễm vào biểu mô tế bào ruột, làm

dung giải thể thực bào Vi khuẩn thuộc nhóm này chủ yếu được phân lập ở người

Enterohemorrhagic E coli (EHEC) phân lập được từ người và động vật nhai lại

Nhóm này thường sản sinh yếu tố xâm nhiễm, độc tố Shiga (Stx) Quá trình xâm nhiễm và gây bệnh thường gây nên những bệnh lý tế bào rất nặng

Enteroaggregative E coli (EAEC) có khả năng sản sinh ra yếu tố bám dính và

xâm nhập được xác định là yếu tố liên quan đến bệnh tiêu chảy của heo con sau cai sữa Vi khuẩn nhóm này có thể tìm thấy ở người và ở heo, bò

Diffusely adhering E coli (DAEC) có thể tìm thấy trong ruột non, đặc biệt là ở trẻ

em từ 12 tháng tuổi trở lên Trong một nghiên cứu trên những đứa trẻ ở bệnh viện giữa độ tuổi từ 1 tháng tuổi đến 14 tuổi, đa số những bệnh nhân nhiễm DAEC đều

3

bị ói mửa Một vài nghiên cứu cho thấy DAEC là nguyên nhân của bệnh tiêu chảy DAEC được xem là tác nhân gây bệnh trên những trẻ sơ sinh hơn là những đứa trẻ tập đi và biết đi

2.1.1 Đặc điểm hình thái E coli

Escherichia coli là một loại trực khuẩn hình gậy ngắn, gram âm, kích thước 2 -

3µm x 0,6µm Trực khuẩn có hình cầu, đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi

ngắn Phần lớn E coli di động do có lông ở quanh thân, nhưng một số không thấy

di động Vi khuẩn không sinh nha bào, có khả năng hình thành giáp mô khi gặp môi trường tốt Nếu cố định bằng axit osmic rồi quan sát dưới kính hiển vi thấy tế

bào E coli có nhân đó là một khối tối nằm trong nguyên sinh chất màu sáng

(Nguyễn Như Thanh, 1997)

2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy E coli

E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số còn phát triển ở môi trường đơn giản E coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy

tiện, có thể sống được ở nhiệt độ từ 5 - 40°C, nhiệt độ thích hợp là 37°C, pH thích hợp là 7,2 – 7,4, phát triển được ở pH 5,5 – 8,0

Trên môi trường EMB (Eosin Methyl Blue) khuẩn lạc E coli to, tròn, hơi lồi,

bóng, màu thẫm tím, có ánh kim (Lưu Hữu Mãnh, 2010)

Trên môi trường NA (Nutrient Agar) và môi trường TSA (Trypticase Soy Agar) sau 18 – 24 giờ ủ trong tủ ấm 37°C hình thành những khuẩn lạc tròn, màu trắng nhạt, mặt khuẩn lạc hơi lồi, đường kính 2 – 3 mm (Đào Trọng Đạt, 2001)

Môi trường nước thịt vi khuẩn phát triển tốt, môi trường rất đục, có cặn màu tro nhạt lắng xuống đáy, đôi khi có màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường có

mùi phân thối Trên môi trường Meller Kauffman và môi trường Malasit, E coli không mọc, môi trường Vinson Blai thì E coli bị ức chế (Nguyễn Như Thanh và ctv., 1997)

Trên môi trường thạch máu: sau 24 giờ nuôi cấy ở 37°C, vi khuẩn E coli hình

thành khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu sáng, kích thước từ 1 – 2 mm, có thể có hoặc không có dung huyết tùy thuộc vào chủng

Trên môi trường MC (MacConkey Agar) vi khuẩn E coli hình thành khuẩn lạc

tròn đều màu hồng nhạt, mặt khuẩn lạc hơi lồi, kích thước 2 – 3 mm (Nguyễn Ngọc Hải, 2012)

4

Hình 2.1: Khuẩn lạc E coli trên môi trường MC

(http://www.impe-qn.org.vn)

2.1.3 Đặc tính sinh hóa

Đặc tính lên men các loại đường: Nhóm Escherichia coli gồm những trực khuẩn

di động hoặc không di động, có khả năng lên men sinh hơi các loại đường Glucoza, Fructoza, Galactoza, Lactoza, Maniton, Mannit, Levuloza, Xyloza Lên men không chắc chắn với các loại đường Dulciton, Sacaroza, Lactose trong khi đó

vi khuẩn Salmonella thì không có đặc tính này, đây là đặc điểm quan trọng để phân biệt vi khuẩn E coli và Salmonella (Nguyễn Như Thanh và ctv., 1997)

Vi khuẩn E coli được định danh bằng các phản ứng sinh hóa qua các môi trường

KIA (Kliler Iron Agar), Simmons Citrate, VP (Voges – Proskauer), MR (Methyl Red), LIM (Lysine Indole Motility Medium) (Nguyễn Ngọc Hải, 2012)

Môi trường Trypton dùng để kiểm tra tính sinh Indole của vi khuẩn Trên môi trường này, sau khi nhỏ thuốc thử Kovac’s vào nếu trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng đỏ thì phản ứng dương tính và ngược lại nếu trên bề mặt môi trường không xuất hiện vòng đỏ thì Indole âm tính

Môi trường MR dùng để kiểm tra tính sử dụng đường của vi khuẩn Nhỏ lên bề mặt môi trường vài giọt thuốc thử Methyl Red, phản ứng dương tính sẽ có vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trường và ngược lại

Môi trường VP dùng để kiểm tra tính di động và tính sinh aceton của vi khuẩn Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm đục môi trường Ngược lại, vi khuẩn không có khả năng di động thì chỉ thấy vi khuẩn mọc theo đường que cấy, môi trường xung quanh trong Trên môi trường VP, sau khi cho thuốc thử VP1 (α-napthol), VP2 (KOH) vào nếu trên bề mặt môi trường có vòng đỏ thì chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sinh aceton Ngược lại, nếu trên bề mặt môi trường không xuất hiện vòng

đỏ thì vi khuẩn không có khả năng sinh aceton

5

Môi trường Simmons citrate dùng để kiểm tra khả năng sử dụng citrate thay nguồn carbon của vi khuẩn Trên môi trường này, vi khuẩn cho kết quả dương tính khi màu của môi trường chuyển từ xanh lá cây sang xanh dương Cho phản ứng âm tính khi môi trường vẫn giữ nguyên màu xanh lá

Bảng 2.1: Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E coli (Nguyễn Ngọc Hải, 2012)

Phản ứng sinh hóa Kết quả

Di động Glucose Lactose

H2S Indole Methyl red Voges Proskauer Citrate

Dương tính Dương tính Dương tính

Âm tính Dương tính Dương tính

Âm tính

Âm tính

2.1.4 Cấu trúc kháng nguyên

Cấu trúc kháng nguyên của E coli rất phức tạp, có 3 loại kháng nguyên: kháng

nguyên thân O (Somatic), kháng nguyên H (Flagellar) và kháng nguyên vỏ K (Capsular) Cho đến nay người ta đã xác định được 175 type kháng nguyên O, 80 type kháng nguyên K và 56 type kháng nguyên H

Kháng nguyên O (Somatic – kháng nguyên thân)

Đây là thành phần chính của vi khuẩn và cũng được coi là yếu tố độc lực của vi khuẩn Kháng nguyên O được coi là ngoại độc tố, được tìm thấy màng ngoài vỏ vi khuẩn và thường xuyên phóng thích vào môi trường nuôi cấy Tất cả kháng nguyên O đều cư trú bề mặt, do vậy có thể liên kết trực tiếp với hệ thống miễn dịch Kháng nguyên O khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xãy ra phản ứng ngưng kết gọi là “hiện tượng ngưng kết O” thân vi khuẩn ngưng kết với nhau dưới dạng những hạt khô, rất khó tan khi lắc Kháng nguyên O chịu nhiệt, khi đun ở 100°C trong vòng 2 giờ 30 phút vẫn giữ được tính kháng nguyên, giữ được khả năng ngưng kết và kết tủa Không bị cồn phá hủy, có tính chất của một lipopolysaccharide Đặc tính của kháng nguyên O và kháng nguyên H giống các trực khuẩn đường ruột khác Kháng nguyên O là thành phần gây đáp ứng miễn dịch đối với vật chủ Người ta có thể tách chiết kháng nguyên O của vi khuẩn

E coli bằng các loại dung môi hữu cơ hoặc bằng phương pháp tổ hợp gene để sản

6

xuất vaccine phòng bệnh hoặc gây miễn dịch để chế kháng huyết thanh chẩn đoán (Nguyễn Vĩnh Phước, 1970)

Kháng nguyên H (Flagelar – kháng nguyên lông)

Kháng nguyên H là kháng nguyên kém chịu nhiệt, được cấu tạo bởi protein Ở 100°C trong vòng 2 giờ 30 phút tính kháng nguyên, khả năng ngưng kết của kháng

nguyên đều bị hủy (Đào Trọng Đạt và ctv., 1999) Kháng nguyên H của vi khuẩn

E coli không có vai trò về bám dính, đồng thời không có vai trò đáp ứng miễn

dịch nên ít được quan tâm nghiên cứu, nhưng nó có ý nghĩa lớn trong việc xác định giống, loài của vi khuẩn và bảo vệ vi khuẩn khỏi bị tiêu diệt trong tế bào đại thực bào, giúp vi khuẩn sống lâu và tồn tại trong đại thực bào

Kháng nguyên K (Capsular – kháng nguyên bề mặt)

Kháng nguyên K còn được gọi là kháng nguyên vỏ, kháng nguyên màng tế bào Được cấu tạo bởi polysaccharide hoặc protein Loại này chỉ có ở một số loại vi khuẩn đường ruột Những chủng có kháng nguyên L và B thường không chịu nhiệt

và không tìm thấy giáp mô (Nguyễn Như Thanh và ctv., 1997)

2.1.5 Sức đề kháng

Vi khuẩn có thể bị vô hoạt ở nhiệt độ 60°C trong 30 phút, ở 70°C vi khuẩn bị vô hoạt trong 2 phút, trong điều kiện đông khô vi khuẩn có thể sống lâu Vi khuẩn có khả năng đề kháng với nhiều loại kim loại nặng như: arsenic, đồng, kẽm, thủy ngân và các chất sát trùng như hỗn hợp amonium, oxy già, formadehyde và

chlorhexidine (Hồ Thị Việt Thu và ctv., 2012)

Các chất tiêu độc bình thường như phenol, formol, vôi ở nồng độ thông thường

cũng làm E coli chết rất nhanh Tuy nhiên, ở môi trường bên ngoài các chủng

E coli độc có thể tồn tại đến 4 tháng (Nguyễn Như Thanh và ctv., 1997)

2.1.6 Độc tố vi khuẩn

E coli là trực khuẩn thường trú ở đường ruột của người và loài động vật máu nóng, hầu hết các chủng E coli đều vô hại Tuy nhiên do sự suy giảm miễn dịch hoặc có sự tổn thương niêm mạc ở đường tiêu hóa mà ngay cả chủng E coli thông thường cũng có thể gây bệnh Vi khuẩn E coli tạo ra 2 loại độc tố là: nội độc tố và ngoại độc tố (Lê Văn Tạo và ctv., 2006)

Nội độc tố (Endotoxin): thành phần chính Lypopolysacharid (LSP) và Lipid A cấu tạo nên thành phần tế bào vi khuẩn, khi tế bào vỡ ra thì các chất này được giải phóng và gây độc cho tế bào vật chủ, là độc tố chủ yếu của trực khuẩn đường ruột Nội độc tố có thể chiết xuất bằng nhiều phương pháp phá vỡ tế bào bằng cơ học, chiết xuất bằng axit trichloaxetic hoặc phenol dưới tác dụng của enzyme Nội độc

7

tố có cấu trúc polysaccharide thuộc về kháng nguyên hoàn toàn và có tính đặc hiệu cao đối với các chủng của mỗi serotype

Ngoại độc tố (Exotoxin): do chính tế bào vi khuẩn tiết ra môi trường xung quanh

vi khuẩn trong quá trình sinh trưởng phát triển của chúng Loại độc tố này chỉ có ở

vi khuẩn có độc lực, có khả năng gây bệnh Ngoại độc tố là một chất không chịu nhiệt, dễ bị phá hủy ở 56°C trong vòng 15 – 30 phút Dưới tác động của formol và nhiệt độ, ngoại độc tố thành giải độc tố Ngoại độc tố có hướng ngoại thần kinh và gây hoại tử Hiện nay việc chiết xuất ngoại độc tố chưa thành công mà chỉ có thể phát hiện trong canh trùng của những chủng mới phân lập được

2.1.7 Tính gây bệnh

Vi khuẩn E coli gây bệnh trên gia cầm là nhóm APEC (Avian Pathogenic E coli)

thuộc serotype O1, O2, O78 gây bệnh đường ruột là do kết hợp với nhiều yếu tố

ngoại cảnh và nhân tố mở đường (Lê Hồng Mận, 1999) Bệnh tiêu chảy do E coli

thường xảy ra ở gà 1 – 10 ngày tuổi, kéo dài đến 9 tuần tuổi Trong tự nhiên vi khuẩn tồn tại khắp nơi nền chuồng, máng ăn, nước uống, chuồng trại ẩm thấp chật chội, mật độ nuôi cao, biên độ nhiệt thường xuyên thay đổi, stress có thể là những điều kiện phát sinh mầm bệnh Nguồn lây bệnh chủ yếu là từ gà bệnh và gà khỏe mang trùng bài xuất mầm bệnh ra môi trường nuôi nhốt, ngoài ra nguồn bệnh có thể do các loài gặm nhấm lây truyền sang hoặc có thể từ công nhân mang mầm bệnh từ môi trường ngoài vào (Nguyễn Xuân Bình, 2005)

Vi khuẩn E coli có thể lây qua đường tiêu hóa, qua vết thương ngoài da, qua niêm mạc đường hô hấp bị tổn thương, ngoài ra trứng có thể nhiễm E coli từ buồng trứng hoặc ống dẫn trứng của gà mẹ, có khoảng 26,5% trứng nhiễm E coli từ gà

mẹ bị nhiễm E coli (Hồ Thị Việt Thu và ctv., 2012)

Triệu chứng: ủ rũ, mệt mỏi, tụm lại từng đám, xù lông, tiêu chảy phân có màu vàng nhạt, hậu môn dính bết phân Bệnh tích: viêm màng bao tim, viêm cơ tim, bao tim dầy đục do tích tụ của dịch tiết có fibrin, trường hợp kéo dài màng bao tim dính vào cơ tim Viêm màng gan, gan sưng, sậm, có màu xanh của mật Viêm xoang vùng đầu, làm cho vùng đầu sưng Viêm ruột có nhiều hạt ở manh tràng, tá

tràng, màng treo ruột, gan và không có sự hiện diện ở lách (Hồ Thị Việt Thu và ctv., 2012)

2.2 Giới thiệu về vi khuẩn sinh ESBL

ESBL là viết tắt của từ Extended Spectrum Beta - lactamase, một loại enzyme được sản xuất bởi một số vi khuẩn Men beta - lactamse phổ rộng (ESBL) được tìm thấy lần đầu tiên năm 1983 tại Đức, thường gặp trong các chủng vi khuẩn

đường ruột đặc biệt là Klebsiella sp., E coli… khi các chủng vi khuẩn sinh ESBL

8

thì đồng nghĩa với việc chúng kháng lại rất nhiều kháng sinh, đặc biệt là nhóm cephaslosporin Đây là gánh nặng thực sự trong trong điều trị nhiễm trùng trực khuẩn gram âm Những vi khuẩn sinh ESBL có thể mắc do lây truyền từ người này sang người khác, hoặc do sự chọn lọc do việc dùng kháng sinh (Paterson, 2005)

Một số nghiên cứu E coli ESBL trên gà ở nước ngoài cho thấy:

Theo Li Yuan et al (2009), khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E coli ESBL trên

51 mẫu gan gà thịt bệnh tại 14 trại gà ở tỉnh Hà Nam, Trung Quốc với tỷ lệ dương tính là 60,8%

Kết quả nghiên cứu của Sunday Akidarju Mamza et al (2010), khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E coli ESBL tại Nigeria ở 400 con gà trên các cơ quan phổi,

lách, ổ nhớp, ruột chiếm tỷ lệ lần lượt phổi 16,9%, lách 15,5%, ổ nhớp 4,9% và ruột 9,7%

Theo Leverstein - Van Hall et al (2011), kiểm tra tỷ lệ dương tính E coli ESBL

trên 98 mẫu thịt gà bán lẻ tại 12 cửa hàng ở Utrecht, Hà Lan là 94% Trong đó phát hiện có 39% kiểu gen thuộc các kiểu gen được tìm thấy ở người Nghiên cứu này

cũng cho thấy các gen E coli sinh ESBL có thể truyền từ gia cầm sang người thông qua các thức ăn bị nhiễm E coli ESBL

Kết quả của Ilse Overdevest et al (2011), phân tích 262 mẫu thịt gà ở Hà Lan cho thấy có 209 mẫu E coli ESBL dương tính, chiếm tỷ lệ là 79,8%

Theo Valeria Bortolaia et al (2010), E coli ESBL được sinh ra trên các yếu tố di

truyền di động do đó có thể truyền qua cả chiều dọc và chiều ngang giữa các dòng

vi khuẩn khác nhau

Theo kết quả nghiên cứu của Annemieke Smet (2008), phân tích 498 mẫu phân từ

5 trại gà thịt công nghiệp ở Bỉ, phát hiện 133 mẫu E coli ESBL dương tính, chiếm

tỷ lệ 26,7%

Trong khoảng 10 năm trở lại đây, tại Việt Nam bắt đầu quan tâm đến các vi khuẩn gram âm sinh ESBL, tuy vậy vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về vấn đề này Các nghiên cứu đa phần được thực hiện với đối tượng là người ở các bệnh viện lớn Tỷ

lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL dao động lớn tùy theo từng khu vực, cao nhất là

ở bệnh viện Chợ Rẫy với 61% các chủng Klebsiella và 52,6% các chủng E coli sinh ESBL Ở bệnh viện Việt Đức nghiên cứu cho thấy tỷ lệ E coli ESBL dương

tính là 34,2% (Nguyễn Thị Yến Chi, 2011)

Theo kết quả nghiên cứu của Hồ Thị Kim Hoa và ctv (2012) phát hiện sự hiện

diện của một số vi khuẩn sinh ESBL ở trong chất thải chăn nuôi Phân tích 45 mẫu bằng kỹ thuật PCR phát hiện có 37 mẫu chứa gen TEM, 4 mẫu chứa gen SHV và

9

không có mẫu nào chứa gen CTX-M Từ các mẫu dương tính, 357 chủng được kiểm tra kháng sinh đồ, kết quả có 40,9% chủng vi khuẩn kháng với ít nhất 1 kháng sinh và 52% chủng vi khuẩn kháng từ 2 kháng sinh trở lên

2.3 Giới thiệu một số phương pháp phát hiện vi khuẩn sinh ESBL

2.3.1 Phương pháp ChromID ESBL agar

Môi trường ChromID ESBL do hãng Bio - Merieux (Pháp) sản xuất, đã được nhiều nước trên thế giới sử dụng Đây là môi trường được khuyến cáo dùng để

sàng lọc các vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae sinh ESBL Việc xác định vi

khuẩn sinh ESBL đặc biệt quan trọng trong việc phòng và giám sát dịch tể bệnh nhiễm khuẩn Môi trường chứa kháng sinh cefpodoxime và chất màu Chất màu được thêm vào dễ dàng phát hiện các phản ứng do enzyme của vi khuẩn nếu có trong môi trường Vì vậy có thể đồng thời vừa định danh vi khuẩn vừa phát hiện vi khuẩn đề kháng Nếu vi khuẩn sinh ESBL sẽ kháng với cefpodoxime và có khả năng phát triển trên môi trường ChromID ESBL tạo thành các khuẩn lạc có màu sắc khác nhau, đặc trưng cho một số loài vi khuẩn (Nguyễn Sâm, 2009)

2.3.2 Phương pháp đĩa đôi

Phương pháp đĩa đôi được các nhà nghiên cứu người Pháp tiến hành cuối những năm 1980 Sau đó tác giả người Anh David M Livermore và các cộng sự đã tiếp tục nghiên cứu và đề xuất thêm một số tiêu chuẩn kỹ thuật cho thử nghiệm Các ESBL có khả năng phân hủy các cephalosporin phổ rộng nhưng bị ức chế bởi acid clavulanic và mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa kháng sinh cephalosporin khi đặt

gần một đĩa kháng sinh chứa acid clavulanic (Livermore DM, 2002)

2.3.3 Băng giấy E-test ESBL

Băng giấy E-test là khoanh plastic mỏng, kích thước 5 × 60 mm, một mặt không thấm nước, một mặt được tẩm kháng sinh với các nồng độ khác nhau Băng giấy E-test ESBL là một loại băng E-test đặc biệt, có một phần chứa các nồng độ kháng sinh cephalosporin phổ rộng được pha loãng từ thấp đến cao, tính bằng µg/ml, phần còn lại chứa cephalosporin phổ rộng kết hợp clavulanic acid kết hợp ESBL

bị ức chế bởi clavulanic acid nên E coli và K pneumoniae sinh ESBL sẽ có vùng

ức chế vi khuẩn ở phần chứa kháng sinh kết hợp clavulanic acid, phần còn lại không có chất ức chế dẫn đến kháng sinh bị ESBL phân hủy nên vùng ức chế vi khuẩn nhỏ hơn hoặc không có vùng ức chế do vi khuẩn không bị kháng sinh ức chế hoặc chỉ bị ức chế ở nồng độ kháng sinh cao (Bradford PA, 1994)

10

2.3.4 Phương pháp đĩa kết hợp

Sử dụng một khoanh giấy kết hợp cephalosporin với acid clavulanic 30µg và một khoanh giấy cephalosporin 30µg Nếu đường kính ức chế ở khoanh kết hợp lớn hơn khoanh còn lại 5 mm thì kết luận vi khuẩn sinh ESBL

Tiêu chuẩn CLSI yêu cầu với phương pháp này cần phải thực hiện đồng thời trên

cả hai hệ thống là: ceftazidime 30µg, ceftazidime – acid clavulanic 10µg; cefotaxime 30µg, cefotaxime – acid clavulanic 10µg (Nguyễn Thị Yến Chi, 2011)

11

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu

Thời gian thực hiện: từ tháng 08 năm 2014 đến tháng 12 năm 2014

Địa điểm lấy mẫu: mẫu được lấy tại một số trại gà công nghiệp thuộc địa bàn huyện Long Hồ tỉnh Vĩnh Long

Địa điểm phân tích mẫu: Bộ Môn Thú Y, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ

Đối tượng nghiên cứu: gà thịt và gà đẻ khỏe

3.1.2 Hóa chất

Hóa chất sử dụng: cồn 70o, 90o, nước cất, Natri clorua, thuốc thử VP1 (α-napthol 5%), VP2 (KOH 40%), Kovac’s, BaCl2.2H2O 1%, H2SO4 1% MacConkey Agar (MC), Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB), Simmons Citrate Agar, Voges Proskauer (VP), Methyl Red (MR), Trypton Water (Indol), Glyceryl, Muller - Hilton Agar (MHA)

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ

Máy autoclave, microwave, tủ lạnh, tủ sấy vô trùng, tủ ấm, tủ sấy khô, cân điện tử, máy lắc vortex, đĩa petri, đèn cồn, ống hút, ống đong các loại, bếp đun cách thủy, ống nghiệm, que cấy, que chang, pipet, micropipet các loại, cốc thủy tinh, bình định mức, cân điện tử, kéo, kẹp, tampon vô trùng, đũa thủy tinh, thước đo vòng vô khuẩn, thùng trữ lạnh, túi nylon, khẩu trang, găng tay và một số dụng cụ khác

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu

Số lượng gà thu thập là 110 con gồm 55 gà thịt và 55 gà đẻ từ 20 trại gà công nghiệp tại huyện Long Hồ tỉnh Vĩnh Long

Mỗi con gà thu thập 4 loại mẫu gồm gan, thịt, phổi và phân

Số lượt phân tích mẫu 110 × 4 = 440 lượt