khảo sát sự hiện diện của escherichia coli sinh men ßlactamase phổ rộng trên gà khỏe tại huyện kế sách tỉnh sóc trăng

coli dưới kính hiển vi quang học X=100 http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/labs/microbiology/gram_stain/Gram_stain_images/index_gram_stain_images.html 2.1.2 Đặc tính nuôi cấy Escherich

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

NGUYỄN MINH LUÂN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGÀNH THÚ Y

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA ESCHERICHIA COLI

SINH MEN ß-LACTAMASE PHỔ RỘNG TRÊN

GÀ KHỎE TẠI HUYỆN KẾ SÁCH

TỈNH SÓC TRĂNG

Cần Thơ, 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGÀNH THÚ Y

MSSV: 3103034 Lớp: CN10Y4A1 Khóa 36

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA ESCHERICHIA COLI SINH MEN ß-LACTAMASE PHỔ RỘNG TRÊN

GÀ KHỎE TẠI HUYỆN KẾ SÁCH

TỈNH SÓC TRĂNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài “Khảo sát sự hiện diện của Escherichia coli sinh men β–lactamase phổ

rộng trên gà khỏe tại huyện Kế Sách tỉnh Sóc Trăng” do sinh viên Nguyễn Minh Luân thực hiện tại Bộ môn Thú Y, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ từ tháng 8 năm 2014 đến tháng 12 năm 2014

Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2015 Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2015

ThS Bùi Thị Lê Minh

Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2015 Duyệt Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

LỜI CẢM TẠ



Trong thời gian học tập và rèn luyện dưới mái trường Đại học Cần Thơ, thầy cô đã dành bao tâm huyết để truyền đạt những kiến thức quý báu cho chúng tôi vững bước vào đời Hôm nay ước mơ của tôi đã thành sự thật, với sự phấn đấu của bản thân tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp Trong suốt quá trình học tập cũng như thời gian thực hiện đề tài tôi đã nhận được sự giúp đỡ của rất nhiều người Trong giây phút này đây tôi không biết nói gì hơn ngoài lời cảm ơn chân thành đến những người đã quan tâm, lo lắng và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Xin chân thành cảm ơn:

Cô Bùi Thị Lê Minh – người đã hết lòng lo lắng, chỉ bảo, động viên tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Quý thầy cô Bộ môn Thú Y, Bộ môn Chăn Nuôi đã tận tình truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu, lẫn nhận thức xã hội trong quá trình học tập tại trường Cha mẹ tôi – người đã nuôi nấng, dạy dỗ và luôn đặt niềm tin, hy vọng vào tôi để tôi có được ngày hôm nay

Các anh chị cao học khóa 19, các bạn bè của lớp Dược Thú y Khóa 36, đã động viên, chia sẽ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài

Chân thành cảm ơn!

TÓM LƯỢC

Đề tài “Khảo sát sự hiện diện của Escherichia coli sinh men β–lactamase phổ

rộng trên gà khỏe tại huyện Kế Sách tỉnh Sóc Trăng” được thực hiện từ tháng 08

đến tháng 12 năm 2014 trên 24 mẫu phân gà ở trạng thái khỏe, trong đó gồm có 6 mẫu gà thịt một tuần tuổi, 6 mẫu gà thịt một tháng tuổi và 12 mẫu phân gà đẻ Sau khi lấy mẫu về chúng tôi xác định vi khuẩn E.coli sinh men ß-lactamase bằng phương pháp đĩa kết hợp (CLSI, 2014) và kiểm tra độ nhạy của các chủng E coli ESBL phân lập được đối với kháng sinh Kết quả phân tích cho thấy tỉ lệ E.coli ESBL dương tính trên phân gà là 45,8%, trong đó tỉ lệ trên gà thịt là 75% và trên

gà đẻ là 16,7% Kết quả kháng sinh đồ thu được cho biết vi khuẩn E coli ESBL nhạy cảm với các kháng sinh amikacin (100%), tetracycline (75,9%), doxycycline (69%), fosfomycin (69%) Đề kháng mạnh với các kháng sinh như ampicillin (100%), streptomycin (100%), trimethoprim/sulfamethoxazole (100%) gentamycin (96,6%), cefalor (89,7%), cefuroxime và kanamycin (86%), cefotaxime và norfloxacin (82,8%) Xét về tính đa kháng kháng sinh thì một số vi khuẩn có thể đề kháng cùng lúc từ 7 đến 13 loại kháng sinh khác nhau, trong đó số vi khuẩn đề kháng cùng lúc 11 loại kháng sinh chiếm đến 31,04%, tiếp theo là 10 loại kháng sinh chiếm 24,13%, 8 loại kháng sinh là 17,24%, 12 loại kháng sinh chiếm 10,34%, 7 hoặc 9 loại kháng sinh là 6,9%, và 13 loại kháng sinh chiếm 3,45%

MỤC LỤC

Trang tựa i

Trang duyệt ii

Lời cảm tạ iii

Tóm lược iv

Mục lục v

Danh mục viết tắt vii

Danh mục hình vii

Danh mục bảng ix

CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2: CƠ SỞ LÝ LUẬN 2

2.1 Giới thiệu về vi khuẩn E.coli 2

2.1.1 Đặc điểm hình thái 2

2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy 3

2.1.3 Đặc điểm sinh hóa 4

2.1.4 Sự đề kháng và tính gây bệnh của E coli 4

2.2 Sơ lược về vi khuẩn E coli ESBL 7

2.2.1 Giới thiệu về vi khuẩn sinh men β –lactamase phổ rộng 7

2.2.2 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn E coli ESBL 9

2.2.3 Đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli ESBL 9

2.2.4 Phương pháp phát hiện sự hiện diện E.coli ESBL 10

2.3 Kỹ thuật kháng sinh đồ Kirby- Bauer 11

2.3 Sơ lược một số kháng sinh nghiên cứu trong đề tài 11

2.3.1 Kháng sinh nhóm β -lactam 11

2.3.2 Kháng sinh nhóm aminoglycoside 13

2.3.3 Kháng sinh nhóm tetracyclline 14

2.3.4 Kháng sinh nhóm quinolone 14

3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu 15

3.1.2 Dụng cụ và hóa chất 15

3.2 Phương pháp nghiên cứu 16

3.2.1 Phương pháp thu thập mẫu 16

3.2.2 Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn E coli ESBL 16

3.2.3 Phương pháp lập kháng sinh đồ 18

3.2.4 Phương pháp phân tích thống kê 19

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

4.1 Kết quả Tỉ lệ E coli ESBL dương tính trên gà thịt 20

4.2 So sánh tỉ lệ dương tính E coli ESBL trên gà thịt và gà đẻ 21

4.3 Kết quả kiểm tra độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh 22

4.4 Tính đa kháng của vi khuẩn E.coli ESBL đối với các loại kháng sinh 25

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 27

5.1 Kết luận 27

5.2 Đề nghị 27

TÀI LIỆU THAM KHẢO 8

PHỤ CHƯƠNG 31

DANH MỤC VIẾT TẮT

CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT ĐẦY ĐỦ

CLSI Clinical Laboratory Standard Institute

E coli Escherichia coli

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Vi khuẩn E coli dưới kính hiển vi quang học ……… 3

Hình 2.2: Thể viêm ruột ……… ………… 6

Hình 2.3: Túi lòng đỏ không tiêu……… ……… 6

Hình 2.4: Thể viêm rốn……… …… 6

Hình 2.5: Viêm màng bao tim……… ……… 6

Hình 2.6: Viêm ống dẫn trứng, viêm buồng trứng……… … 7

Hình 2.7: Thể viêm mắt……… 7

Hình 2.8: Sơ đồ cấu trúc dạng vòng của kháng sinh nhóm ß-lactam…… 12

Hình 2.9: Sơ đồ sự tấn công của ß-lactamase vào vòng ß-lactam trong cấu trúc kháng sinh nhóm ß-lactam……… 13

Hình 3.1: Qui trình phân lập vi khuẩn E coli ESBL……… 18

Hình 4.1: Kết quả kháng sinh đồ của các mẫu E coli ESBL phân lập……… 24

Hình 4.2: Kết quả kháng sinh đồ……… 24

Hình 1: Khuẩn lạc E coli trên môi trường MC……… 32

Hình 2: Sinh hóa khẳng định vi khuẩn E coli 32

Hình 3: Đĩa kết hợp khẳng định E coli ESBL……… 32

Hình 4: Khuẩn lạc E coli trên môi trường NA 32

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Tiêu chuẩn đường kính vòng kháng khuẩn một số kháng sinh 19

Bảng 4.1: Tỉ lệ E coli ESBL dương tính trên gà thịt 21

Bảng 4.2: Kết quả tỉ lệ E coli ESBL dương tính trên gà thịt và gà đẻ 22

Bảng 4.3: Kết quả tính nhạy cảm của E coli ESBL với kháng sinh 23

Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra tính đa kháng của các chủng E coli ESBL phân lập 25

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Ở nước ta, chăn nuôi gia cầm là nghề truyền thống lâu đời của người chăn nuôi, nó đóng vai trò quan trọng trong phát triển kinh tế, đáp ứng nguồn thực phẩm dinh dưỡng cho con người và đem lại lợi nhuận khá cao so với một số ngành chăn nuôi khác Hàng năm ngành chăn nuôi gà đã sản xuất một lượng thịt hơi chiếm khoảng 14-

15 % trong tổng lượng thịt hơi các loại, theo thống kê chăn nuôi Việt Nam năm 2013

số lượng thịt gà là 230,9 ngàn tấn và số lượng trứng là 4,3 tỷ quả (http://channuoivietnam.com) Vì vậy, trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi gia cầm đang trên đà phát triển mạnh và đặc biệt là chăn nuôi gà theo mô hình công nghiệp với quy mô lớn Tuy nhiên, việc phát triển nhanh cũng đồng nghĩa sẽ kéo theo nhiều dịch bênh xảy ra, do đó đòi hỏi người chăn nuôi phải sử dụng nhiều kháng sinh

Kim Đăng và ctv., 2012), do được sử dụng rộng rãi nên tỉ lệ vi khuẩn đề kháng các

kháng sinh này rất cao Hiện nay đã xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn gram âm sinh men ß-lactamase phổ rộng đề kháng các kháng sinh nhóm ß-lactam Kết quả nghiên

cứu ở Nigeria cho thấy tỉ lệ E coli ESBL dương tính trên phân gà thịt là 22% (Duru Carissa et al., 2013) Từ năm 2004 – 2007 ở Trung Quốc tỉ lệ phát hiện E coli ESBL trong phân gà là 18,5% (Lin Li et al., 2010) Hiện nay, ở Việt Nam việc nghiên cứu về

E coli ESBL trên động vật nói chung cũng như gà nói riêng còn hạn chế

Xuất phát từ tình hình thực tế trên nên đề tài “Khảo sát sự hiện diện của E coli

sinh men β–lactamase phổ rộng trên gà khỏe tại huyện Kế Sách tỉnh Sóc Trăng”

được thực hiện với mục tiêu sau:

- Xác định tỉ lệ E coli ESBL dương tính trên gà khỏe ở một số trại gà công nghiệp

thuộc huyện Kế Sách tỉnh Sóc Trăng

- Kiểm tra độ nhạy của các chủng E coli ESBL phân lập được đối với kháng sinh

CHƯƠNG 2

CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.1 Giới thiệu về vi khuẩn E coli

Escherichia coli được gọi tên là E coli thuộc họ Enterobacteriaeceae được bác sĩ

người đức Thoedore Escherich phân lập lần đầu tiên và đưa ra đặc điểm của vi khuẩn

vào năm 1885 E coli là loài vi khuẩn quan trọng được tìm thấy trong phân (Nguyễn

Vĩnh Phước, 1970)

Trong các vi khuẩn đường ruột, Escherichia coli là vi khuẩn phổ biến nhất, chúng

chiếm 80% vi khuẩn hiếu khí sống ở ruột (Trần Cẩm Vân, 2001) Vi khuẩn này xuất hiện và sinh sống trong ruột động vật chỉ vài giờ sau khi sinh và tồn tại cho đến khi

con vật chết E coli sinh sống bình thường trong đường ruột của người và động vật,

khi các điều kiện nuôi dưỡng, khẩu phần thức ăn, vệ sinh thú y kém, sức chống đỡ

bệnh tật của con vật yếu thì E coli trở nên cường độc và có khả năng gây bệnh (Đào Trọng Đạt và ctv., 1999)

E coli là vi khuẩn hiếu khí chủ yếu trong hệ tiêu hóa của hầu hết các loài động vật,

thường có 107 – 109 vi khuẩn này trên một gram phân Hệ thống tiêu hóa của con vật

mới sinh sẽ nhanh chóng nhiễm vi khuẩn trong đó có E coli tạo nên hệ vi sinh vật đường ruột Nồng độ vi khuẩn E coli thường thấp ở ruột non, tăng dần và có nồng độ cao nhất ở ruột già Hầu hết E coli là sinh vật sống cộng sinh, chúng sống trong

đường ruột nhưng không có hại cho vật chủ Chỉ một phần nhỏ số chủng có thể sản xuất yếu tố độc lực và gây hại con vật (Gyles and Fairbrother, 2010)

2.1.1 Đặc điểm hình thái

Theo Hồ Thị Việt Thu (2012), E coli là một loại trực khuẩn hình gậy ngắn, kích

thước 2-3 μm x 0,6 μm Trong cơ thể trực khuẩn có hình cầu đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi ngắn Có khi trong môi trường nuôi cấy còn thấy những trực khuẩn dài 4-

8 μm, những loại này thường gặp trong canh khuẩn già Phần lớn E coli di động do có

lông ở xung quanh thân nhưng một số không thấy di động Vi khuẩn không sinh nha bào, bắt màu Gram âm, có thể bắt màu toàn thân hoặc sẫm ở hai đầu khoảng giữa nhạt hơn, có thể hình thành giáp mô khi gặp môi trường dinh dưỡng tốt, nhưng soi tươi có thể không thấy được Nếu cố định bằng axit osmic rồi quan sát dưới kính hiển vi thấy

tế bào E coli có nhân, đó là một khối tối nằm trong nguyên sinh chất màu sáng

Hình 2.1: Vi khuẩn E coli dưới kính hiển vi quang học (X=100)

http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/labs/microbiology/gram_stain/Gram_stain_images/index_gram_stain_images.html

2.1.2 Đặc tính nuôi cấy

Escherichia coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số

chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản nên chúng được chọn làm mẫu để nghiên cứu về sinh vật học

Theo Nguyễn Như Thanh và ctv (1997), E coli phát triển dễ dàng trên các môi

trường nuôi cấy thông thường, là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 5-40oC, thích hợp là 37oC; pH 7,2- 7,4, phát tiển được ở pH 5,5-8 Trên môi trường nước thịt vi khuẩn phát triển tốt, môi trường rất đục, có cặn màu tro nhạt lắng xuống đáy, đôi khi có màng màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường

màu phân thối Trên môi trường Meller Kauffman và môi trường Malasit, E coli không mọc Trên môi trường Endo, E coli có khuẩn lạc màu đỏ, có ánh kim hoặc

không có ánh kim

Theo Nguyễn Ngọc Hải (2012), trên môi trường EMB (Eosin Methylen Blue Agar)

khuẩn lạc E coli có màu tím ánh kim, hơi dẹt, trơn bóng, đường kính khuẩn lạc

khoảng 1-2mm sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC Trên môi trường MC (MacConkey Agar)

vi khuẩn E coli hình thành khuẩn lạc to, tròn đều, màu hồng nhạt, mặt khuẩn lạc hơi

lồi, kích thước 2-3mm

Trên môi trường thạch NA sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2 – 3 mm Nuôi lâu khuẩn lạc gần như nâu nhạt và phát triển rộng ra (Nguyễn Vĩnh Phước, 1970)

2.1.3 Đặc tính sinh hóa

E.coli lên men sinh hơi các loại đường glucoz, mantoz, galactoz, levuloz, lactoz,

fructoz…không sinh H2S, hoàn nguyên nitrat thành nitrit, không sử dụng urea, không

sử dụng citrat làm nguồn cung cấp carbon Tất cả E.coli đều lên men đường lactoz nhanh và sinh hơi, đây là đặc điểm quan trọng để phân biệt E coli và Salmonella

(Nguyễn Như Thanh, 1997)

Theo Nguyễn Ngọc Hải (2012), có thể dùng các phản ứng IMViC như: Indol (Trypton Agar), MR (Methyl Red), VP (Voges – Proskauer), Simmons Citrate, để phân biệt

E.coli với các vi khuẩn đường ruột khác

Phản ứng Indol: Nhiều loài vi sinh vật có enzyme tryptophanase có khả năng phân

giải tryptophan trong môi trường tạo thành indol Indol khi kết hợp với paradimethylamino-benzaldehyd có trong thuốc thử kovacs sẽ tạo thành hợp chất rosindol có màu đỏ

Phản ứng MR (Methyl Red): Các nhóm vi khuẩn đường ruột có khả năng oxy hóa đường glucose thành acid pyruvic, acid pyruvic lại tiếp tục chuyển hóa thành nhiều loại acid hữu cơ khác như: acid acetic, acid lactic, acid succinic, làm cho pH của môi trường nuôi cấy vi khuẩn hạ xuống dưới 4,5 Ở độ pH này chất chỉ thị màu methyl red khi được nhỏ vào sẽ vẫn giữ màu đỏ Như vậy dựa vào màu của methyl red người ta

có thể xác đinh được phản ứng dương tính (màu đỏ) hay âm tính (màu vàng)

Phản ứng VP (Voges - Proskauer): khác với phản ứng MR, một số vi khuẩn có khả năng oxy hóa đường glucose tạo thành acid pyruvic, nhưng lại không chuyển hóa acid pyryvic thành acid hữu cơ mà thành hợp chất acetyl methyl carbinol (acetoine) Acetione trong môi trường kiềm cao sẽ bị oxy hóa thành diacetyl Diacetyl sinh ra sẽ kết hợp với nhóm guanin của arginin có trong pepton tạo thành phức chất có màu đỏ với thuốc thử α-naphtol Đây là cơ sở của việc đánh giá kết quả của phản ứng VP Phản ứng Simmons Citrate: Trong môi trường có chứa hợp chất sodium citrat (Na3C6H5O7), một số vi khuẩn có khả năng sử dụng được citrat và làm thừa ra các gốc

Na+ khiến cho môi trường trở nên kiềm và làm cho màu của chất chỉ thị xanh bromothymol có trong môi trường sẽ chuyển từ xanh lá cây sang màu xanh dương

2.1.4 Sự đề kháng và tính gây bệnh của E coli

Kauffman (1947) người đầu tiên khám phá ra kiểu huyết thanh dưa trên 3 loại kháng

đến nay đã xác định được 174 kháng nguyên O (từ O1 – O181 với các O31, O47, O67, O72, O93, O94, và O122 bị loại bỏ), 80 kháng nguyên K, 53 kháng nguyên H (từ H1 – H56 với H13, H22 và H50 là không xác định) và hơn 20 kháng nguyên F

- Kháng nguyên O: còn được gọi lá kháng nguyên thân, kháng nguyên bề mặt, đây là kháng nguyên của vách tế bào, cấu tạo bởi polysaccharide Nó được tìm thấy trên các khuẩn lạc dạng S và chịu được nhiệt độ 100oC trong 2h, không bị cồn phá hủy

- Kháng nguyên H: còn được gọi là kháng nguyên lông, có tính chịu nhiệt cao, được cấu tạo bởi protein Tuy nhiên khi đung sôi ở nhiệt độ cao trong 2 giờ 30 phút thì tính kháng nguyên, khả năng ngưng kết, kết hợp của kháng nguyên đều bị hủy

- Kháng nguyên K: còn được gọi là kháng nguyên vỏ, kháng nguyên màng tế bào được cấu tạo bởi polysaccharide hoặc protein

E coli có 2 loại độc tố là ngoại độc tố và nội độc tố:

- Ngoại độc tố là một chất không chịu được nhiệt dể bị phá hủy ở 56oC trong vòng 10-30 phút Dưới tác dụng của formol và nhiệt, ngoại độc tố chuyển thành giải độc tố Ngoại độc tố có tính hướng thần kinh và gây hoại tử, khả năng tạo độc tố sẻ mất khi các chủng được giữ lâu dài hoặc cấy chuyền nhiều lần trên môi trường dinh dưỡng

- Nội độc tố là yếu tố gây ngộ độc chủ yếu của vi khuẩn đường ruột, chúng có trong tế bào vi trùng và gắn vào trong tế bào vi trùng để gây bệnh Nội độc tố có thể chiết xuất bằng nhiều phương pháp: phá vỏ tế bào bằng cơ học, chiết xuất bằng phenol hay dưới tác động cua enzyme

E coli cũng như các loại vi khuẩn không sinh nha bào khác đề kháng yếu với nhiệt

độ, ở 550C sẽ bị diệt trong 1 giờ, 600C trong 30 phút, và chết ngay khi đun sôi 1000C Các chất tiêu độc bình thường như phenol, formol, vôi…ở nồng độ thông thường

cũng làm E coli chết rất nhanh Tuy nhiên, ở môi trường bên ngoài, các chủng E coli

độc có thể tồn tại đến 4 tháng (Nguyễn Như Thanh, 1997)

E coli có sẵn trong ruột của động vật nhưng chỉ gây bệnh khi sức đề kháng của con vật suy giảm Bệnh do trực khuẩn E coli có thể xảy ra như một bệnh truyền nhiễm kế

phát trên cơ sở thiếu vitamin và các bệnh vius, kí sinh trùng Theo Trần Cẩm Vân

(2001), trong đường tiêu hóa E coli chiếm tỉ lệ cao nhất trong số vi khuẩn hiếu khí

(khoảng 80%)

Hầu hết các chủng E coli phân lập từ gia cầm chỉ gây bệnh cho gia cầm, ít nguy hại

đến người và các động vật khác như: O1, O2, O35, O78, O18, O81, O115, O116 và

O132 Tuy nhiên loài gia cầm cũng mẫn cảm với chủng E coli O157:H7 là một chủng

sinh độc tố Shiga gây hại cho người (Nguyễn Đức Hiền, 2009)

Theo Hồ Thị Việt Thu (2012), vi khuẩn E coli hiện diện thường xuyên trong ruột và

được thải qua phân với số lượng lớn Bệnh có thể lây qua đường tiêu hóa, qua vết thương ngoài da, qua niêm mạc bị tổn thương, ngoài ra bệnh còn có thể lây qua đường trứng

Triệu chứng và bệnh tích: Tùy vào con đường lây nhiễm khác nhau, vi khuẩn E coli gây bệnh với các thể khác nhau như:

- Trong đường tiêu hóa: chủ yếu xuất hiện thể viêm ruột, tiêu chảy

- Ngoài đường tiêu hóa: với các thể bệnh như: thể viêm túi khí, thể bại huyết, thể viêm vòi trứng, thể chết phôi, thể viêm rốn, thể viêm khớp, thể viêm màng não, thể viêm mắt và thể phù đầu

Hình 2.2: Thể viêm ruột

(Nguyễn Thanh Hiền, 2013)

Hình 2.3: Túi lòng đỏ không tiêu (http://www.thepoutryside.com

Theo Nguyễn văn Hiệp (2000), khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E coli trong môi

trường chăn nuôi gà công nghiệp và sản phẩm chăn nuôi trên địa bàn Thành phố Hồ

Chí Minh cho biết có 131/366 mẫu khảo sát có sự hiện diện của E coli chiếm 35,79%,

trong đó phân nhiễm 46,87%

Theo kết quả nghiên cứu của Duru Carissa et al (2013) có 45/159 mẫu swab phân lập trên gà tại Nigeria nhiễm E coli chiếm tỉ lệ 28,3%

Theo Maryvonne (1999), trong 1 gram phân của gia cầm bình thường có khoảng 104 -

107 vi khuẩn E coli

2.2 Sơ lược về vi khuẩn E coli ESBL

2.2.1 Giới thiệu vi khuẩn sinh men ß –lactamase phổ rộng

Men ß -lactamase phổ rộng (ESBL) được tìm thấy lần đầu tiên năm 1983 tại Đức Kể

từ khi được phát hiện các nghiên cứu về lĩnh vực này vẫn không ngừng thu hút sụ quan tâm của các nhà khoa học bởi sự ảnh hưởng nghiêm trọng của nó gây ra Vì vậy, ESBL được xem như là một vấn đề toàn cầu, dù khi vi khuẩn đề kháng kháng sinh theo cơ chế nào thì luôn có sự thay đổi theo thời gian và vùng địa lí ESBL cũng vậy, vào những thập niên 1980 và 1990 ESBL chủ yếu xuất hiện ở các nước phát triển Tuy nhiên, sau những năm 2000 thì tỉ lệ vi khuẩn sinh ESBL lại tăng cao ở các nước đang phát triển Theo đó khi các chủng vi khuẩn sinh ESBL thì đồng nghĩa với việc chúng kháng lại rất nhiều các kháng sinh, đặc biệt là kháng sinh nhóm ß -lactam do hiện nay kháng sinh nhóm này được sử dụng với tỉ lệ rất cao Đây thực sự là một gánh nặng rất lớn trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do trực khuẩn gram âm

Hình 2.6: Viêm ống dẫn trứng,

viêm buồng trứng

(http://www.thepoultrysite.com)

Hình 2.7: Thể viêm mắt (http://www.thepoultrysite.com)

Theo David L Paterson et al (2005), năm 1961 thế hệ penicillin phổ rộng đầu tiên ra

đời là ampicillin có tác dụng điều trị cả các trực khuẩn gram âm và gram dương Chỉ

vài năm sau, vào năm 1963 tại Athens Hy Lạp người ta phân lập được chủng E Coli

có sinh men ß-lactamase kháng ampicillin và được đặt tên là TEM-1 Năm 1965 cũng

ở nơi đây từ E coli người ta phát hiện ra TEM-2 là do TEM-1 biến đổi một amino

acid Nhờ TEM-1 và TEM-2 làm cho vi khuẩn gram âm kháng lại các kháng sinh penicillin, ampicillin và cephalosporins thế hệ 1 trong một thời gian dài sau đó tại châu Á và nhiều nơi trên thế giới

Cho đến năm 1974 chủng K pneumoniae có gen mã hóa men ß-lactamase trên

plasmide được phát hiện, enzyme có nhiều thay đổi về amino acid so với TEM-1 và TEM-2 nên được đặt tên là SHV-1 (Sulphyryl Variable), như vậy vi khuẩn đã có TEM-1, TEM-2 và SHV-1 nên các penicillin, cephalosporin thế hệ 1 đã bị kháng lại rất nhiều

Đầu những năm 1980 các kháng sinh ß-lactam phổ rộng như cephalosporin thế hệ 2, thế hệ 3 được đưa vào điều trị các vi khuẩn kháng thuốc Sự ra đời các kháng sinh ß-lactam này đặt biệt là cephalosporin thế hệ 3, đã là một thành công lới của khoa học trong công cuộc chiến đấu lâu dài với vi khuẩn gây bệnh có TEM-1, TEM-2 và SHV-

1 Nhưng rồi một loại men ß-lactamase có khả năng phân hủy các cephalosporin thế

hệ thứ 2, thế hệ 3 có nguồn gốc do TEM-1, TEM-2 và SHV-1 thay đổi một số amino acid gọi được là ESBL xuất hiện

Năm 1983 ở Đức phát hiện chủng K ozaenae sinh men ß-lactamase phân hủy

cefotaxime được đặt tên là SHV-2, đây là trường hợp sinh ESBL đầu tiên được ghi

nhận Năm 1984 đến 1987 tại Pháp đã phát hiện chủng K pneumoniae có gen mã hóa

ESBL trên plasmide kháng cefotaxime đặt tên là CTX-1 Cũng vào những năm 1986

ở Nhật Bản và năm 1989 ở Đức phát hiện được E coli sinh ESBL kháng cefotaxime

không phải TEM và SHV nên được đạt tên là CTX-M-1 Đáng ngại là CTX-M-1 có khả năng phân hủy cephalosporin thế hệ 3 và 4

Như vậy, với việc sử dụng các kháng sinh nhóm ß-lactam ngày càng nhiều đặc biệt là các cephalosprin thế hệ 3 và có nhiều ESBL được mã hóa qua plasmide nên ngày càng làm tăng nhiều chủng loại ESBL, điều này cảnh báo nguy cơ gia tăng vi khuẩn

đề kháng kháng sinh và việc hết kháng sinh điều trị trong tương lai gần Ở một số nước phát triển có nền chăn nuôi hiện đại, việc nghiên cứu vấn đề vi khuẩn sinh

như Klebsiella sp và E coli, trong đó đặt biệt là vi khuẩn E coli được phát hiện nhiều

nhất

2.2.2 Tình hình nghiên cứu về E coli ESBL

Một số nghiên cứu ở nước ngoài cho thấy tỉ lệ vi khuẩn E coli ESBL dương tính trên

gà được thể hiện như sau:

Tại các tỉnh phía bắc Bồ Đồ Nha, kết quả khảo sát trên 76 mẫu phân gà thịt tại lò mổ

cho thấy tỉ lệ phát hiện của E coli ESBL là 42,1% (Daniela Costa et al., 2009)

Theo kết quả nghiên cứu của Lin Li et al (2010), khảo sát trên 347 mẫu swab từ lổ

huyệt của cả gà khỏe và gà bệnh tại các tỉnh Liêu Ninh, Hà Bắc, Sơn Đông, Bắc Kinh,

Hà Nam, Giang Tây, Tứ Xuyên và Quảng Đông của Trung Quốc từ năm 2004 – 2007

cho tỉ lệ phát hiện của E coli ESBL là 18,5%

TạiMaiduguri thuộc Nigeria, kết quả nghiên cứu trên 190 mẫu phân gà đẻ khỏe cho tỉ

lệ nhiễm E coli ESBL là 5,8% và trên 73 mẫu phân gà đẻ nhiễm bệnh cho tỉ lệ nhiễm

E coli ESBL là 21,9% ( Sunday A mamza et al., 2010).A

Theo kết quả kháng sinh đồ của 12 chủng vi khuẩn E coli ESBL trên gà ở Nigeria năm 2010 cho thấy vi khuẩn E coli ESBL nhạy cảm tốt với kháng sinh là ampicillin

(16,7%), cephalexin (50%), chloramphenicol (33,3%), cipropfloxacin (50%),

doxycycline (16,7%), tetracycline (16,7%), tylosin (33,3%) Vi khuẩn E coli ESBL

đề kháng lại các kháng sinh là ampicillin (66,7%), cephalexin (50%), chloramphenicol (66,7%), cipropfloxacin (16,7%), doxycycline (50%), lincomycin (100%), penicillin (100%), tetracycline (83,3%), tylosintartrarte (100%), tylosin (66,7%)

Theo kết quả nghiên cứu của Duru Carissa et al (2013), tại tỉnh Owerri Nigeria trên

159 mẫu swab từ lổ huyệt của gà, bao gồm gà thịt, gà tây, và gà thả vườn địa phương,

cho thấy tỉ lệ nhiễm E coli ESBL là 22%

Theo kết quả kháng sinh đồ trên gà tại Nigeria năm 2013 trên 45 chủng vi khuẩn E coli làm kháng sinh đồ cho thấy vi khuẩn E coli nhạy cảm tốt với kháng sinh sau:

imipenem (100%), ofloxacin (80%), cefepime (33,3%), amoxicillin-clavulanic acid

(26,7%) và nalidixic acid (26,7%) Theo kết quả kháng sinh đồ trên 10 chủng E coli

ESBL phân lập được imipenem được xem là kháng sinh có hiệu quả nhất, tiếp theo là

ofloxacin (70%) Tỉ lệ đề kháng của kháng sinh đối với E coli ESBL cao nhất là

ticarcillin (100%), ceftazidime (100%), amoxicillin-clavulanic acid (90%), nalidixic

Hiên nay, tại Việt Nam việc nghiên cứu về vi khuẩn E coli ESBL vẫn còn hạn chế,

chủ yếu là những nghiên cứu sâu và rộng trên người Việc nghiên cứu trên động vật

và gia cầm chưa được quan tâm nhiều và hiện vẫn chưa có số liệu nào cụ thể Nghiên cứu trên người về trực khuẩn đường ruột tiết β-lactamase phổ rộng (ESBL) gây nhiễm

khuẩn phân lập tại bệnh viện Chợ Rẩy Cho thấy tỉ lệ nhiễm E coli ESBL trên phân

bệnh nhân được phân lập là 53,7% (Võ Thị Chi Mai, 2010)

2.2.3 Phương pháp phát hiện sự hiện diện E coli ESBL

Việc phát hiện các vi khuẩn gram âm sinh ESBL nhanh, chính xác của phòng xét nghiệm vi sinh là việc làm hết sức cần thiết, phát hiện được sớm các vi khuẩn sinh men ß-lactam để có biện pháp xử lí kịp thời, góp phần quan trọng trong việc sử dụng kháng sinh để phòng và trị bệnh gia súc gia cầm trên thực tế được hiệu quả nhất Nhiều phương pháp phát hiện ESBL được đề nghi dựa trên nguyên tắt khuyếch tán của Kirby-Bauer Hiện nay các phương pháp được sử dụng rộng rãi như: phương pháp đĩa đôi, phương pháp đĩa kết hợp, phương pháp ChromID ESBL agar, Băng giấy E-test ESBL Trong đề tài này, chúng tôi xác định việc sinh ESBL bằng phương pháp đĩa kết hợp của Jacoby và Hans (1999), đây là phương pháp phổ biến và được sử dụng nhiều nhất hiện nay

Phương pháp đĩa kết hợp: phương pháp này được Jacoby và Hans mô tả lần đầu tiên

năm 1999 Bằng cách sử dụng hai loại đĩa kháng sinh là cephalosporin và cephalosporin tương ứng phối hợp với clavulanic acid Vi khuẩn tiết ESBL khi hiệu

số đường kính vòng vô khuẩn của đĩa cephalosporin phối hợp với clavulanic acid so với đĩa cephalosporin ≥ 5mm Các loại đĩa kháng sinh được sử dụng là cefotaxime (30 μg), cefotaxime clavulanic acid (30/10μg), ceftazidime (30μg), ceftazidime clavulanic acid (30/10μg)

Theo tiêu chuẩn mới của CLSI (2014) yêu cầu phương pháp này cần phải thực hiện trên cả hai hệ thống là: cefotaxime (30μg), cefotaxime clavulanic acid (30/10μg), ceftazidime (30μg), ceftazidime clavulanic acid (30/10μg) Phương pháp này dể thực hiện và ít tốn kém nhưng đòi hỏi phòng thí nghiệm phải có đĩa kháng sinh cefotaxim clavulanic acid và ceftazidime clavulanic acid, một số trường hợp cho kết quả dương tính giả do một số vi khuẩn sinh AmpC cũng xuất hiện sự gia tăng đường kính vòng

vô khuẩn khi có clavulanic acid

cephalosporin và mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa kháng sinh cephalosporin khi đặt gần một đĩa kháng sinh chứa clavulanic acid Vi khuẩn được cấy trên đĩa thạch MHA, đặt đĩa cephalosporin (30μg) với đĩa amoxcillin clavulanic acid (20μg) cách nhau 20- 25mm trên mặt thạch Có cộng hưởng khi có sự mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa cephalosporin ở vùng giao tiếp với đĩa chứa clavulanic acid Ưu điểm của phương pháp này là dể thực hiện, nhưng khuyết điểm là khó lựa chọn được khoảng cách tối ưu giữa hai khoanh giấy của từng vi khuẩn, âm tính giả với các ESBL hoạt tính thấp và

có thể bỏ sót một số chủng vi khuẩn ESBL

2.3 Kỹ thuật kháng sinh đồ Kirby- Bauer

Theo Nguyễn Ngọc Hải (2012), kháng sinh đồ được thực hiện bằng phương pháp Kirby- Bauer dùng để kiểm tra tính nhạy cảm đối với kháng sinh của vi khuẩn dựa trên nguyên tắc, các loại kháng sinh khác nhau được tẩm vào các khoanh giấy tuyệt trùng với hàm lượng nhất định Khi được đặt lên bề mặt thạch và ủ từ 16-18 giờ sẽ khuyết tán ra xung quanh và kiềm hãm sự phát triển của vi khuẩn trên bề mặt thạch, tạo thành vùng ức chế Dựa vào đường kính vùng ức chế để đánh giá mức độ nhạy cảm của kháng sinh tương ứng Đơn vị thước đo đường kính vòng vô khuẩn là mm

Đo đường kính bằng cách áp thước lên mặt sau của đáy đĩa thạch

2.4 Sơ lược một số kháng sinh nghiên cứu trong đề tài

2.4.1 Kháng sinh nhóm β -lactam

Kháng sinh nhóm ß-lactam được biết đến sớm nhất trong lịch sử kháng sinh và có vai trò đặc biệt quan trọng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn Hiện nay nhóm ß-lactam

có số lượng kháng sinh lớn và được sử dụng phổ biến trên thị trường

Kháng sinh nhóm ß-lactam được chia thành 2 phân nhóm penicillin và

cephalosporins

- Phân nhóm penicillin: ampicillin, amoxicillin, sodium hoặc potassium penicillin G, penicillin V, procaine penicillin G, Benzathyl penicillin, methicillin, oxacillin, cloxacillin, dicloxacillin

- Phân nhóm cephalosporin gồm có: Cephalosporin thế hệ 1, thế hệ 2, thế hệ 3 và thế

hệ 4

+ Cephalosporin 1: Cefalotin, cefazolin, cefalexin, efradin, cefadroxil, cephalophin, cephapirin…