3.2.1 Phương pháp thu thập mẫu
Số lượng gà khỏe khảo sát là 24 con, trong đó có 12 gà thịt và 12 gà đẻ.
Mẫu vật thí nghiệm là mẫu phân được lấy từ lỗ huyệt của gà, dùng tăm bông vô trùng đưa vào lỗ huyệt của gà để lấy phân rồi đưa ngay vào ống nghiệm có chứa môi trường chuyên chở cary blair, ghi ký hiệu, bảo quản lạnh rồi đưa về phòng thí nghiệm để phân tích.
3.2.2 Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn E. coli ESBL
Mẫu phân đem về được ria cấy trực tiếp trên môi trường MC có bổ sung ceftazidime 2mg/l, rồi ủ ở 37oC trong 24 giờ để được E. coli giả định. Chọn các khuẩn lạc E. coli
điển hình,to, tròn đều, hơi lồi, màu hồng đậm. Sau đó làm thuần vi khuẩn bằng cách chọn 10 khuẩn lạc điển hình dùng que cấy ria trên môi trường NA đem ủ ở 37oC trong 24 giờ. Tiếp theo, kiểm tra sinh hóa để khẳng định là vi khuẩn E. coli. Các thử nghiệm sinh hóa gồm:
- Môi trường Trypton dùng để kiểm tra tính sinh Indol của vi khuẩn. Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovacs lên bề mặt môi trường rồi quan sát thấy: Phản ứng dương tính thì trên bề mặt môi trường xuất hiện một lớp màu đỏ. Phản ứng âm tính thì bề mặt môi trường không đổi màu.
- Môi trường MR dùng để kiểm tra tính sử dụng đường của vi khuẩn. Nhỏ lên bề mặt môi trường vài giọt thuốc thử Methyl Red, phản ứng dương tính sẽ có vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trường. Phản ứng âm tính thì môi trường vẫn giữ nguyên màu vàng.
- Môi trường VP dùng để kiểm tra tính di động và tính sinh aceton của vi khuẩn. Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm đục môi trường. Trên môi trường VP, sau khi cho thuốc thử VP1, VP2 vào nếu trên bề mặt môi trường có vòng đỏ thì chứng tỏ vi khuẩn
- Môi trường Simmons citrate dùng để kiểm tra khả năng sử dụng citrate thay nguồn carbon của vi khuẩn. Trên môi trường này, vi khuẩn cho kết quả dương tính khi màu của môi trường chuyển từ xanh lục sang xanh dương, nếu không thay đổi màu thì vi khuẩn âm tính.
Mẫu phân (Swab)
Môi trường MC bổ sung Ceftazidime 2mg/l
37oC, 24 giờ
Chọn 10 khuẩn lạc E. coli điển hình cấy thuần lên NA
37oC, 24 giờ
Cấy khuẩn lạc từ NA lên môi trường sinh hóa 37oC, 24 giờ
Kết quả kiểm tra sinh hóa
Citrate (-) VP (-) MR (+) Indol (+)
Khẳng định E. coli
So độ đục với ống
Macfarland 0,5 1x108 CFU/ml
Phương pháp đĩa kết hợp gồm 4 đĩa
Đĩa 1: Ceftazidime (30μg), Đĩa 2: Ceftazidime + clavulanic acid (30/10μg) Đĩa 3: Cefotaxime (30μg), Đĩa 4: Cefotaxime + clavulanic acid (30/10μg)
37oC, 16-18 giờ
Khẳng định E. coli ESBL nếu chênh lệch giữa đường kính đĩa 2 và đĩa 1 ≥ 5mm và, hoặc giữa đường kính đĩa 4 và đĩa 3 ≥ 5mm
Giữ giống.
Sau khi khẳng định E. coli dùng phương pháp đĩa kết hợp để xác định vi khuẩn E. coli ESBL. Theo CLSI (2014) phương pháp đĩa kết hợp sử dụng đồng thời 2 cặp đĩa kháng sinh bao gồm các loại đĩa Đĩa 1: Ceftazidime (30μg), Đĩa 2: Ceftazidime + clavulanic acid (30/10μg), Đĩa 3: Cefotaxime (30μg), Đĩa 4: Cefotaxime + clavulanic acid (30/10μg). Khẳng định E. coli ESBL nếu chênh lệch giữa đường kính đĩa 2 và đĩa 1 ≥ 5mm và, hoặc giữa đường kính đĩa 4 và đĩa 3 ≥ 5mm.
3.2.3 Phương pháp lập kháng sinh đồ
Phương pháp lập kháng sinh đồ được thực hiện theo tiêu chuẩn CLSI (2014).
Bảng 3.1: Tiêu chuẩn đường kính vòng kháng khuẩn một số kháng sinh(CLSI, 2014)
Tên kháng sinh Hàm lượng
kháng sinh
Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn (mm)
Nhạy Trung gian Kháng
Ampicillin 10 μg ≥ 17 14 - 16 ≤ 13 Ceftazidime 30 μg ≥ 21 18 - 20 ≤ 17 Cefuroxime 30 μg ≥ 18 15 - 17 ≤ 14 Cefotaxime 30 μg ≥ 26 23 - 25 ≤ 22 Cefaclor 30 μg ≥ 18 15 - 17 ≤ 14 Gentamicin 10 μg ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 Streptomycin 10 μg ≥ 15 12 - 14 ≤ 11 Kanamycin 30 μg ≥ 18 14 - 17 ≤ 13 Amikacin 30 μg ≥ 17 15 - 16 ≤ 14 Tetracycline 30 μg ≥ 15 12–14 ≤ 11 Doxycycline 30 μg ≥ 14 11–13 ≤ 10 Norfloxacin 10 μg ≥ 17 13 - 16 ≤ 12 Ofloxacin 5 μg ≥ 16 13 - 15 ≤ 12 Fosfomycin 200 μg ≥ 16 13 - 15 ≤ 12 Trimethoprim + 1,25/ ≥ 16 11–15 ≤ 10
Chuẩn bị canh khuẩn: chủng vi khuẩn E. coli ESBL đã được khẳng định bằng phương pháp đĩa kết hợp, được tăng sinh trong môi trường NA khoảng 24 giờ. Sau đó pha canh khuẩn, đem canh khuẩn so độ đục với Mac Farland 0,5 tương đương có chứa vi khuẩn khoảng 108 CFU/ml.
Chuẩn bị môi trường MHA, độ dày thạch khoảng 4mm. Các đĩa kháng sinh bảo quản theo đúng yêu cầu của nhà sản xuất. Không dùng kháng sinh quá hạn, kháng sinh ẩm ướt. Khi lấy từ tủ lạnh ra phải để ra ngoài 1-2 giờ để cho nhiệt độ trong lọ bằng nhiệt độ phòng.
Phương pháp tiến hành: dùng tăm bông vô trùng tẩm canh khuẩn sau đó trải đều lên khắp mặt thạch MHA. Sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt từng khoanh đĩa kháng sinh lên đĩa thạch. Đặt các đĩa kháng sinh lên mặt thạch sao cho đĩa kháng sinh cách mép đĩa thạch 2cm- 2,5cm và 2 đĩa cách nhau 2,5cm – 3,5cm, phải đảm bảo các đĩa kháng sinh tiếp xúc phẳng với mặt thạch. Đem ủ ở 37oC trong 16-18 giờ.
Cách đọc kết quả kháng sinh đồ: việc đọc kết quả kháng sinh đồ được thực hiện bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn, sau đó so sánh với bảng tiêu chuẩn đường kính vòng vô khuẩn của kháng sinh theo CLSI (2014).
3.2.4 Phương pháp phân tích thống kê.
So sánh tỉ lệ dương tính của E. coli ESBL giữa các lứa tuổi gà thịt bằng phương pháp yates test, và giữa gà thịt và gà đẻ bằng phương pháp chi bình phương sử dụng phần mềm Minitab 16.0.
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả tỉ lệ E. coli ESBL dương tính trên gà thịt
Qua nuôi cấy phân lập E. coli ESBL bằng phương pháp đĩa kết hợp từ mẫu phân của 12 gà thịt gồm 6 gà 1 tuần tuổi và 6 gà 1 tháng tuổi từ một số trại gà công nghiệp ở huyện Kế Sách - tỉnh Sóc Trăng, kết quả tỉ lệ vi khuẩn E. coli ESBL dương tính được thể hiện trong bảng 4.1.
Bảng 4.1: Tỉ lệ E. coli ESBL dương tính trên gà thịt
Loại gà Số mẫu khảo
sát Số mẫu dương tính Tỷ lệ dương tính (%) Gà thịt 1 tuần tuổi 6 4 66,7a Gà thịt 1 tháng tuổi 6 5 83,3a Tổng 12 9 75
Các chữ a,b trong cùng một cột khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05)
Kết quả bảng 4.1 cho thấy tỉ lệ vi khuẩn E. coli ESBL dương tính trên phân gà thịt ở trạng thái khỏe mạnh là khá cao (75%), trong đó tỉ lệ vi khuẩn E. coli ESBL dương tính ở gà thịt 1 tuần tuổi là 66,7%, gà thịt 1 tháng tuổi là 83,3%. Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Tỉ lệ gà 1 tuần tuổi dương tính với E. coli
ESBL trên gà thịt cao (66,7%) có thể là do nhiều nguyên nhân như gà con có thể bị nhiễm vi khuẩn ngay từ ngày tuổi đầu tiên do nhiễm mầm bệnh từ môi trường ấp như máy ấp, dụng cụ ấp (Bruce et al., 2008). Theo Hồ Thị Việt Thu (2012) vi khuẩn E. coli có thể hiện diện ở gà từ một ngày tuổi đến nhiều ngày sau khi nở, hầu hết các trường hợp này do trứng bị nhiễm từ phân hoặc nhiễm từ vòi trứng hay ống dẫn trứng, vi khuẩn có thể xuyên qua vỏ trứng và lây nhiễm cho gà con, có khoảng 26,5% trứng nhiễm vi khuẩn E. coli từ gà mẹ. Tỉ lệ gà 1 tháng tuổi dương tính với E. coli ESBL trên gà thịt cao (83,3%) nguyên nhân do trong thời gian thực hiện đề tài cho thấy, hình thức chăn nuôi của trại là nuôi trên nền và lớp độn chuồng là trấu. Trong khi đó, gà một tháng tuổi có thời gian dài thường xuyên tiếp xúc trực tiếp với phân trên nền trấu, mà vi khuẩn E. coli chủ yếu được bài thải qua phân, do đó tỉ lệ gà nhiễm vi khuẩn E.
máy ấp trước khi tiến hành ấp trứng để gà con sau khi nở không bị nhiễm E. coli từ phân mang vi khuẩn. Qua kết quả nghiên cứu cho thấy trên gà thịt có tỉ lệ E. coli
ESBL dương tính tương đối cao do đó nếu không được quan tâm chăm sóc, vệ sinh sát trùng chuồng trại cẩn thẩn thì dịch bệnh dễ xảy ra và hiệu quả điệu trị sẽ thấp. Kết quả tỉ lệ gà dương tính với E. coli ESBL trong đề tài cao hơn so với kết quả nghiên cứu của Lin Li et al. (2010) tại Trung Quốc là 18,5%, Duru Carissa et al. (2013) tại Nigeria là22% và Daniela Costa et al. (2009) tại Bồ Đồ Nha là 42,1%.
4.2 So sánh tỉ lệ E. coli ESBL dương tính trên gà thịt và gà đẻ
Qua khảo sát ta có tỉ lệ vi khuẩn E. coli ESBL dương tính trên gà thịt và gà đẻ được thể hiện trong bảng 4.2.
Bảng 4.2: Kết quả tỉ lệ E. coli ESBL dương tính trên gà thịt và gà đẻ
Loại gà Số mẫu khảo
sát Số mẫu dương tính Tỷ lệ dương tính (%) Gà thịt 12 9 75a Gà đẻ 12 2 16,7b Tổng 24 11 45,8 P=0,004
Các chữ a,b trong cùng một cột khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05)
Theo kết quả bảng 4.2 tỉ lệ dương tính với vi khuẩn E. coli ESBL trên phân gà thịt là 75% cao hơn trên gà đẻ là 16,7%, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (P = 0,004). Tỉ lệ E. coli ESBL dương tính trên gà thịt cao hơn gà đẻ do nguyên nhân vi khuẩn E.coli
hiện diện thường xuyên trong ruột và được thải qua phân với số lượng lớn. Bệnh có thể lây qua đường tiêu hóa, qua vết thương ngoài da, qua niêm mạc bị tổn thương, (Hồ Thị Việt Thu, 2012) do đó gà dễ nhiễm vi khuẩn E. coli từ phân của gà đã bị nhiễm được bài thải ra nền chuồng. Theo thực tế trên địa bàn, gà đẻ được nuôi trong chuồng lồng, nên việc vệ sinh phân và sát trùng chuồng trai được thực hiện tốt hơn, trong khi gà thịt nuôi trên nền chuồng, do đó việc vệ sinh còn hạn chế. Do thường xuyên tiếp xúc với phân nên gà thịt có tỉ lệ dương tính với E. coli ESBL cao hơn gà đẻ.
Để hạn chế tỉ lệ E. coli ESBL dương tính trên gà thịt người chăn nuôi cần quan tâm tới việc chăm sóc và nuôi dưỡng gà đẻ, trứng gà có thể được sử dụng làm sản phẩm cho con người, nếu trứng bị nhiễm khuẩn, sẽ ảnh hương đến sức khỏe người sử dụng gây nên hiện tượng ngộ độc thực phẩm. Ngoài ra trứng gà có thể được sử dụng cho ấp nở tạo ra con giống, vì vậy nếu gà mẹ mang mầm bệnh thì gà con sẽ dể bị nhiễm vi khuẩn ngay sau khi nở. Do đó, để hạn chế tỉ lệ E. coli ESBL dương tính trên gà đẻ cần thực hiện vệ sinh và sát trùng chuồng lồng cẩn thận, thu nhặt trứng thường xuyên, loại bỏ những trứng bị dính phân hoặc những trứng bị nứt để tránh các trứng nhiễm khuẩn bị vỡ ảnh hưởng đến những gà không bị nhiễm trong đàn. Kết quả nghiên cứu tỉ lệ dương tính trên gà đẻ trong bảng 4.2 là 16,7% kết quả này cao hơn so với kết quả của Sunday A Mamza et al. (2010), tại Nigeri là 5,8%.
4.3 Kết quả kiểm tra độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh
Qua kết quả khảo sát tính nhạy cảm của 29 khuẩn lạc E. coli ESBL phân lập từ 11/24 mẫu phân gà khỏe tại huyện Kế Sách tỉnh Sóc Trăng với các loại kháng sinh được trình bày ở bảng 4.3.
Bảng 4.3: Kết quả tính nhạy cảm của E. coli ESBL với kháng sinh
STT Loại kháng sinh
Số khuẩn lạc E. coli ESBL (n=29)
Kháng Nhạy Trung gian
Số khuẩn lạc Tỉ lệ (%) Số khuẩn lạc Tỉ lệ (%) Số khuẩn lạc Tỉ lệ (%) 1 Ampicillin 29 100,0 0 0,0 0 0,0 2 Ceftazidime 14 48,3 6 20,7 9 31,0 3 Cefuroxime 25 86,2 0 0,0 4 13,8 4 Cefotaxime 24 82,8 3 10,3 2 6,9 5 Cefaclor 26 89,7 3 10,3 0 0,0 6 Gentamicin 28 96,6 1 3,4 0 0,0 7 Streptomycin 29 100,0 0 0,0 0 0,0 8 Kanamycin 25 86,2 4 13,8 0 0,0 9 Amikacin 0 0,0 29 100,0 0 0,0 10 Tetracycline 6 20,7 22 75,9 1 3,4 11 Doxycycline 2 6,9 20 69,0 7 24,1 12 Norfloxacin 24 82,8 3 10,3 2 6,9 13 Ofloxacin 20 69,0 3 10,3 6 20,7 14 Fosfomycin 9 31,0 20 69,0 0 0,0 15 Trimethoprim/ sulfamethoxazole 29 100,0 0 0,0 0 0,0
Hình 4.1: Kết quả kháng sinh đồ của các mẫu E. coli ESBL phân lập được Kết quả bảng 4.3 cho thấy vi khuẩn E. coli ESBL phân lập từ huyện Kế Sách tỉnh Sóc Trăng còn nhạy cảm với các kháng sinh như: amikacin (100%), tetracycline (75,9%),
doxycycline và fosfomycin (69%). Tuy nhiên các chủng này kháng hầu hết với các kháng sinh nhóm ß-lactam, trong đó các kháng sinh bị kháng mạnh (100%) như: ampicillin, streptomycin, trimethoprim/sulfamethoxazole, tiếp theo là gentamycin (96,6%), cefaclor (89,7%), cefuroxime và kanamycin (86%), cefotaxime và norfloxacin (82,8%). Theo kết quả này ampicillin bị kháng bởi E. coli ESBL là 100% cao hơn so với kết quả khảo sát tại Nigeria năm 2010 trong đó ampicillin bị kháng là 66,7%. Một nghiên cứu khác tại Nigeria năm 2013 vi khuẩn E. coli ESBL kháng mạnh (100%) với cefotaxime, tuy nhiên kết quả nghiên cứu được cho thấy cefotaxime bị kháng thấp hơn (82,6%). Hiện tượng đề kháng kháng sinh của E. coli ESBL ở gà cao có thể là do trong qui trình nuôi gà thịt người chăn nuôi thường sử dụng nhiều kháng sinh để phòng và trị bệnh, ngoài ra kháng sinh còn được trộn vào thức ăn để kích thích tăng trọng. Theo Phạm Kim Đăng vàctv. (2012) khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh ở một số trại chăn nuôi gà tại tỉnh Hải Phòng, trong số 38 loại kháng sinh được sử dụng tại các trại, kháng sinh nhóm ß-lactam được sử dụng cho phòng bệnh là 32,6% và trị bệnh là 26,7% và có ít nhất 8 loại kháng sinh được sử dụng trộn vào thức ăn để kích thích tăng trọng như: chlortetracycline, oxytetracycline, maduramycin, monensin, salinomycin, bambermycin, bacitracin methylene-disalicylate (BMD) và colistin. Để hạn chế việc đề kháng kháng sinh đòi hỏi người chăn nuôi cần phải có ý thức và quan tâm đến việc sử dụng kháng sinh thật hợp lí, không lạm dụng kháng sinh trong phòng và trị bệnh cũng như trộn vào thúc ăn.
4.3 Tính đa kháng của vi khuẩn E.coli ESBL đối với các loại kháng sinh
Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra tính đa kháng của các chủng E.coli ESBL phân lập Số loại kháng sinh đề kháng Kiểu đa kháng Số chủng (n=29) Số chủng Tỉ lệ (%) 7 1. Am + Sm + Bt + Cz + Cu + Ct + Cr 1 3,45 2. Am + Sm + Bt + Ge + Cz + Kn + Nr 1 3,45 8 2 6,90 1. Am + Sm + Bt + Ge + Cz + Cr + Nr + Of 2 6.90 2. Am + Sm + Bt + Ge + Cu + Ct + Cr + Kn 1 3,45 3. Am + Sm + Bt + Ge + Cz + Cu + Kn + Nr 1 3,45 4. Am + Sm + Bt + Ge + Cz + Kn + Nr + Of 1 3,45 5 17,24 9 1. Am + Sm + Bt + Ge + Cu + Ct + Cr + Kn + Of 1 3,45 2. Am + Sm + Bt + Ge + Cu + Ct + Cr + Kn + Te 1 3,45 2 6,90 10 1. Am + Sm + Bt + Ge + Cz + Cu + Ct + Cr + Kn +Te 1 3,45 2. Am + Sm + Bt + Ge + Cz +Cu + Ct + Cr + Kn + Nr 1 3,45 3. Am + Sm + Bt + Ge + Cu +Ct + Cr + Kn + Nr + Of 3 10,34 4. Am + Sm + Bt + Ge + Cu + Ct + Cr + Kn + Nr + Fo 2 6,90 7 24,13 11 1. Am + Sm + Bt + Ge + Cz + Cu + Ct + Cr + Kn + Nr + Of 2 6,90 2. Am + Sm + Bt + Ge + Cu + Ct + Cr + Kn + Nr + Of + Fo 5 17,24 3. Am + Sm + Bt + Ge + Cz + Cu + Ct + Cr + Kn + Nr + Fo 2 6,90 9 31,04 12 1. Am + Sm + Bt + Ge + Cz + Cu + Ct + Cr + Kn + Te +Nr + Of 2 6,90 2. Am + Sm + Bt + Ge + Cu + Ct + Cr + Kn + Te