Mẫu phân đem về được ria cấy trực tiếp trên môi trường MC có bổ sung ceftazidime 2mg/l, rồi ủ ở 37oC trong 24 giờ để được E. coli giả định. Chọn các khuẩn lạc E. coli
điển hình,to, tròn đều, hơi lồi, màu hồng đậm. Sau đó làm thuần vi khuẩn bằng cách chọn 10 khuẩn lạc điển hình dùng que cấy ria trên môi trường NA đem ủ ở 37oC trong 24 giờ. Tiếp theo, kiểm tra sinh hóa để khẳng định là vi khuẩn E. coli. Các thử nghiệm sinh hóa gồm:
- Môi trường Trypton dùng để kiểm tra tính sinh Indol của vi khuẩn. Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovacs lên bề mặt môi trường rồi quan sát thấy: Phản ứng dương tính thì trên bề mặt môi trường xuất hiện một lớp màu đỏ. Phản ứng âm tính thì bề mặt môi trường không đổi màu.
- Môi trường MR dùng để kiểm tra tính sử dụng đường của vi khuẩn. Nhỏ lên bề mặt môi trường vài giọt thuốc thử Methyl Red, phản ứng dương tính sẽ có vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trường. Phản ứng âm tính thì môi trường vẫn giữ nguyên màu vàng.
- Môi trường VP dùng để kiểm tra tính di động và tính sinh aceton của vi khuẩn. Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm đục môi trường. Trên môi trường VP, sau khi cho thuốc thử VP1, VP2 vào nếu trên bề mặt môi trường có vòng đỏ thì chứng tỏ vi khuẩn
- Môi trường Simmons citrate dùng để kiểm tra khả năng sử dụng citrate thay nguồn carbon của vi khuẩn. Trên môi trường này, vi khuẩn cho kết quả dương tính khi màu của môi trường chuyển từ xanh lục sang xanh dương, nếu không thay đổi màu thì vi khuẩn âm tính.
Mẫu phân (Swab)
Môi trường MC bổ sung Ceftazidime 2mg/l
37oC, 24 giờ
Chọn 10 khuẩn lạc E. coli điển hình cấy thuần lên NA
37oC, 24 giờ
Cấy khuẩn lạc từ NA lên môi trường sinh hóa 37oC, 24 giờ
Kết quả kiểm tra sinh hóa
Citrate (-) VP (-) MR (+) Indol (+)
Khẳng định E. coli
So độ đục với ống
Macfarland 0,5 1x108 CFU/ml
Phương pháp đĩa kết hợp gồm 4 đĩa
Đĩa 1: Ceftazidime (30μg), Đĩa 2: Ceftazidime + clavulanic acid (30/10μg) Đĩa 3: Cefotaxime (30μg), Đĩa 4: Cefotaxime + clavulanic acid (30/10μg)
37oC, 16-18 giờ
Khẳng định E. coli ESBL nếu chênh lệch giữa đường kính đĩa 2 và đĩa 1 ≥ 5mm và, hoặc giữa đường kính đĩa 4 và đĩa 3 ≥ 5mm
Giữ giống.
Sau khi khẳng định E. coli dùng phương pháp đĩa kết hợp để xác định vi khuẩn E. coli ESBL. Theo CLSI (2014) phương pháp đĩa kết hợp sử dụng đồng thời 2 cặp đĩa kháng sinh bao gồm các loại đĩa Đĩa 1: Ceftazidime (30μg), Đĩa 2: Ceftazidime + clavulanic acid (30/10μg), Đĩa 3: Cefotaxime (30μg), Đĩa 4: Cefotaxime + clavulanic acid (30/10μg). Khẳng định E. coli ESBL nếu chênh lệch giữa đường kính đĩa 2 và đĩa 1 ≥ 5mm và, hoặc giữa đường kính đĩa 4 và đĩa 3 ≥ 5mm.