khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn e. coli sinh beta lactamase phổ rộng trên gà khỏe tại một số trại gà thuộc huyện trần đề tỉnh sóc trăng

Trần Đề là một trong những huyện thuộc tỉnh Sóc Trăng với nhiều lợi thế về điều kiện tự nhiên, kinh tế phù hợp để phát triển ngành chăn nuôi gà và đang hình thành một số trang trại chăn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

VÕ QUỐC NGUYỄN

Luận văn tốt nghiệp Ngành: BÁC SĨ THÚ Y

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN E coli

SINH BETA LACTAMASE PHỔ RỘNG TRÊN

GÀ KHỎE TẠI MỘT SỐ TRẠI GÀ THUỘC HUYỆN TRẦN ĐỀ TỈNH SÓC TRĂNG

Cần Thơ, 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

Luận văn tốt nghiệp Ngành BÁC SĨ THÚ Y

MSSV: 3102967 Lớp: CN10Y4A1 – K36

Cần Thơ, 2014

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN E coli

SINH BETA LACTAMASE PHỔ RỘNG TRÊN

GÀ KHỎE TẠI MỘT SỐ TRẠI GÀ THUỘC HUYỆN TRẦN ĐỀ TỈNH SÓC TRĂNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài: “Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E coli sinh beta lactamase phổ

rộng trên gà khỏe tại một số trại gà thuộc huyện Trần Đề tỉnh Sóc Trăng”, do

sinh viên Võ Quốc Nguyễn thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Thú Y, khoa

Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ Từ tháng 8 đến

tháng 12 năm 2014

Huỳnh Ngọc Trang

Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014

Duyệt Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn ngoài nổ lực của bản thân, còn có nguồn động viên và dạy bảo tận tình của cha mẹ và thầy cô Tôi xin thành kính dâng lên cha mẹ lòng biết ơn sâu sắc, người đã dành cả cuộc đời cho tôi cất bước đến trường

Xin chân thành cảm ơn cô Bùi Thị Lê Minh và cô Huỳnh Ngọc Trang chỉ bảo, tận tình giúp đỡ trong quá trình thực hiện đề tài Quý thầy cô Bộ môn Thú Y và Bộ môn Chăn Nuôi đã truyền đạt cho tôi những kiến thức, kinh nghiệm quý báu, lẫn nhận

thức xã hội trong quá trình học tập tại trường

Xin chân thành cảm ơn tất cả các anh chị cao học k19, các bạn bè của lớp Dược Thú

y k36 các em thú y k37 đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài

Cuối lời xin chúc quý thầy cô cùng anh, chị, em và các bạn dồi dào sức khỏe và thành đạt trong cuộc sống

Võ Quốc Nguyễn

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ

MỤC LỤC

TRANG BÌA i

TRANG DUYỆT ii

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM LƯỢC iv

DANH MỤCCHỮ VIẾT TẮT v

DANH SÁCH BẢNG viii

DANH SÁCH HÌNH ix

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 2

2.1 Tổng quan về vi khuẩn Escherichia coli 2

2.1.1 Đặc điểm hình thái 2

2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy 2

2.1.3 Đặc điểm sinh hóa 3

2.1.4 Sức đề kháng và tính gây bệnh 4

2.2 Kháng sinh nhóm beta lactam 5

2.2.1 Cấu trúc kháng sinh nhóm beta lactam 5

2.2.2 Phân loại kháng sinh nhóm beta lactam 5

2.2.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh nhóm beta lactam 6

2.3 Đề kháng kháng sinh 6

2.3.1 Hiện tượng đề kháng kháng sinh 6

2.3.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh 7

2.4 Men beta lactamase phổ rộng 7

2.4.1 Tổng quan về ESBL 7

2.4.2 Một số phương pháp phát hiện vi khuẩn sinh ESBL 8

2.5 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 9

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

3.1 Phương tiện nghiên cứu 12

3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tượng 12

3.2 Phương pháp nghiên cứu 12

3.2.1 Phương pháp lấy mẫu 12

3.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn E coli ESBL 13

3.3 Phương pháp làm kháng sinh đồ 14

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 17

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18

4.1 Kết quả sự hiện diện E coli ESBL trên gà khỏe tại huyện Trần Đề tỉnh Sóc Trăng 18

4.2 Kết quả sự hiện diện của vi khuẩn E coli ESBL trên thân thịt và mẫu phân của gà khỏe 19

4.3 Kết quả khảo sát tính nhạy cảm của E coli ESBL với một số kháng sinh 21

4.4 Kết quả tính đa kháng của vi khuẩn E coli ESBL 23

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 25

5.1 Kết luận 25

5.2 Đề nghị 25

TÀI LIỆU THAM KHẢO 26

PHỤ CHƯƠNG 29

DANH SÁCH BẢNG

sinh (CLSI, 2014)

16

4.3 Tỉ lệ dương tính với E coli ESBL của phân, gan, thịt, phổi

DANH SÁCH HÌNH

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, ngành chăn nuôi nước ta đã có những bước phát triển mạnh mẽ cả về số lượng và chất lượng, đặc biệt chăn nuôi gà đang khẳng định một vị trí quan trọng trong việc cung cấp thực phẩm ở đồng bằng song Cửu Long Song song với việc phát triển mạnh mẽ của ngành chăn nuôi cùng với sự thay đổi của môi trường thì việc xuất hiện dịch bệnh là không tránh khỏi Để ứng phó với vấn đề dịch bệnh cũng như là hạn chế sự bùng phát của mầm bệnh thì sử dụng kháng sinh và thuốc thú y trong điều trị ngày càng nhiều, tuy nhiên việc sử dụng rộng rãi kháng sinh tạo

điều kiện để vi khuẩn E coli có khả năng kháng kháng sinh Trong đó bệnh nhiễm khuẩn E coli là bệnh nhiễm khuẩn phổ biến nhất trên gia cầm Vi khuẩn E coli

kháng kháng sinh nhóm beta lactam bằng cách sinh men beta lactamase phổ rộng (ESBL) là một trong những mối nguy hiểm và ngày càng nghiêm trọng gây nhiều

khó khăn trong điều trị Sự hiện diện của gene ESBL trong E coli từ động vật sản

xuất thực phẩm như gà có thể gây nguy hiểm đến sức khỏe con người (Laube, 2013)

Một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn E coli ESBL đã xuất hiện trên gà khỏe, theo nghiên cứu của Delphine Girlich (2007) có E coli

ESBL 10,7% có trong phân manh tràng của gà khỏe ở lò giết mổ tại Pháp Năm

2013, Gundogan and Avci phân lập 66,6% E coli ESBL trong thịt gà tại Thổ Nhĩ

Kỳ Theo kết quả nghiên cứu của Stefan Börjesson et al (2013) có 44% (44/100) các mẫu thịt gà ở Thụy Điển phát hiện E Coli ESBL Tuy nhiên, ở Việt Nam các nghiên cứu về E coli ESBL trên vật nuôi nói chung hay trên gà nói riêng chưa được

nghiên cứu nhiều Trần Đề là một trong những huyện thuộc tỉnh Sóc Trăng với nhiều lợi thế về điều kiện tự nhiên, kinh tế phù hợp để phát triển ngành chăn nuôi gà

và đang hình thành một số trang trại chăn nuôi tập trung, công nghiêp với các mô

hình sản xuất liên doanh, do đó việc nghiên cứu sự hiện diện E coli ESBL là rất cần

thiết Đề tài “Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E coli sinh beta lactamase phổ

rộng trên gà khỏe tại một số trại gà thuộc huyện Trần Đề tỉnh Sóc Trăng” được

thực hiện

Mục tiêu của đề tài:

- Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E coli ESBL trên gà khỏe ở huyện Trần Đề

tỉnh Sóc Trăng

- Thử tính nhạy cảm đối với một số loại kháng sinh của vi khuẩn E coli ESBL

CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.1 Tổng quan về vi khuẩn Escherichia coli

Trực khuẩn ruột già Escherichia coli (E coli) còn có tên là Bacterium coli

commune, Bacillus coli communis được Escherich phân lập năm 1885 từ phân trẻ

em bị tiêu chảy Đây là một trong những loài vi khuẩn sống ký sinh trong đường

ruột của động vật máu nóng (chim và loài hữu nhũ) Vi khuẩn E coli thuộc: lớp

Schgzomycetes, bộ Eubacteriales, họ Enterobacteriaceae, tộc 1 Escherichiae, giống

Escherichia, loài Escherichia coli

Hệ thống tiêu hóa của con vật mới sinh sẽ nhanh chóng nhiễm vi khuẩn trong đó có

E coli tạo nên hệ vi sinh vật đường ruột Nồng độ vi khuẩn E coli thường thấp ở ruột non, tăng dần và có nồng độ cao nhất ở ruột già Hầu hết E coli là sinh vật

sống cộng sinh, chúng sống trong đường ruột nhưng không có hại cho vật chủ Chỉ một phần nhỏ số chủng có thể sản xuất yếu tố độc lực và gây hại con vật (Gyles and Fairbrother, 2010)

2.1.1 Đặc điểm hình thái

E coli là trực khuẩn ngắn, Gram âm, có hình dạng đồng nhất, không có khả năng

hình thành nha bào Vi khuẩn này có thể thay đổi về kích thước và hình dạng ở trong tế bào vi khuẩn có kích thước nhỏ hơn vi khuẩn ở dạng tự do, thường là 2 -3 x

0,6µm Hầu hết các chủng vi khuẩn E coli di động và có lông roi, có thể phát triển

ở điều kiện hiếu khí hoặc yếm khí trong các môi trường dinh dưỡng ở nhiệt độ

18 – 44oC (Hồ Thị Việt Thu, 2012)

Thân E coli được bao phủ bởi những sợi protein có chức năng bám dính và giúp cơ thể di động E coli bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở 2 đầu, khoảng

giữa nhạt Nếu cố định bằng acid osmic rồi quan sát dưới kính hiển vi thấy tế bào

E coli có nhân, đó là một khối nằm trong nguyên sinh chất màu sáng (Nguyễn Như

Thanh, 1997)

2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy

E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số chủng

có thể phát triển được ở các môi trường tổng hợp đơn giản nên người ta đã chọn chúng làm mẫu để nghiên cứu về sinh vật học

E coli là trực khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ

5-40oC, nhiệt độ thích hợp là 37oC, pH thích hợp là 7,2 - 7,4, có thể phát triển được

ở pH từ 5 - 8 (Lưu Hữu Mãnh, 2009)

C hình thành khuẩn lạc tròn, bóng ướt, không trong suốt màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính 1-3 mm Thời gian ủ kéo dài thì khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc lan rộng ra Chúng ta có thể quan sát thấy cả khuẩn lạc khô nhăn và dạng trơn, bóng thường được dùng làm môi trường lưu giữ chủng (Nguyễn Như Thanh, 1997)

Trên môi trường MacConkey vi khuẩn lên men đường lactose và hình thành những khuẩn lạc màu đỏ hồng, tròn, bóng, không nhầy

Môi trường Mueller-Hinton Agar là môi trường trong, dùng cho thử nghiệm tính nhạy cảm của vi sinh vật với kháng sinh Môi trường cũng thường được dùng để thử nghiệm sự thuỷ phân tinh bột

Hình 1 Vi khuẩn E coli dưới kính hiển vi quang học (X=10µm)

http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/labs/microbiology/gram_stain/Gram_stain_images/index_gram_stain_images.html

2.1.3 Đặc điểm sinh hóa

Vi khuẩn E coli lên men sinh hới các loại đường: lactose, fructose, glucose,

levulose, galactose, xylose, ramnose, mannit Không lên men đường andonit và

inozit Tất cả E coli đều lên men đường lactose nhanh và sinh hơi (ở 44 ± 0,5oC),

đó là đặc điểm quan trọng mà người ta dựa vào đó để phân biệt E coli và

Salmonella (Lưu Hữu Mãnh, 2009)

Theo Nguyễn Ngọc Hải (2012) vi khuẩn được định danh bằng phản ứng sinh hóa như khả năng tạo Indol, phản ứng VP, phản ứng MR, khả năng sử dụng Citrate Khả năng tạo Indol nhiều loại vi sinh vật có khả năng phân giải tryptophan trong môi trường tạo thành Indol khi kết hợp với paradimethylamino – benzaldehyd co

trong thuốc thử kowacs sẽ tạo thành hợp chất rosindol có màu đỏ Vi khuẩn E coli

trong môi trường dinh dưỡng Nutrient broth có chứa pepton khi nhỏ thuốc thử kowacs vào nếu trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng đỏ thì phản ứng dương tính

và ngược lại nếu trên bề mặt môi trường không xuất hiện vòng đỏ thì Indole âm tính

Phản ứng Methyl Red nhiều vi khuẩn có khả năng oxy hóa đường glucose tạo thành acid pyruvic Acid pyruvic sinh ra chuyển hóa thành nhiều loại acid hữu cơ nhác nhau làm cho pH môi trường nuôi cấy bi hạ thấp xuống dưới 4,5 Ở độ pH này chất chỉ thị màu methyl red khi được nhỏ vào sẽ vẫn giữ màu đỏ Nhỏ lên bề mặt môi

trường ít giọt thuốc thử Methel Red, phản ứng dương tính sẽ có vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trường và ngược lại

Phản ứng Voges – Proskauer (VP) một số vi sinh vật có khả năng oxy hóa đường glucose tạo thành acid pyruvic, nhưng lại không chuyển hóa acid pyruvic thành các acid hữu cơ mà thành hợp chất acetyl methyl carbinol (actoine) Actoine trong môi trường kiềm cao sẽ bị oxy hóa thành diacetyl Diacetyl sinh ra sẽ kết hợp với nhóm guanine của arginine có trong pepton tạo thành phức chất có màu đỏ với thuốc thử α – naphtol Khi nhỏ thuốc thử VP1, VP2 vào nếu trên bề mặt môi trường có vòng đỏ thì phản ứng dương tính, nếu trên bề mặt môi trường không xuất hiện vòng đỏ thì phản ứng âm tính

Khả năng sử dụng Citrat trong môi trường có chứa hợp chất sodium citrate, một số

vi khuẩn có khả năng sử dụng được citrate và làm thừa ra các gốc Na+ khiến cho môi trường trở nên chuyển từ xanh lá cây sang màu xanh dương Trong môi trường Simmon citrat nguồn cacbon duy nhất là citrat, vi khuẩn sử dụng citrat sẽ kiềm hóa

môi trường làm môi trường đổi từ xanh lục sang xanh lơ E.coli không có khả năng

sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất, môi trường không đổi màu

2.1.4 Sức đề kháng và tính gây bệnh

Vi khuẩn có thể bị vô hoạt ở nhiệt độ 60oC trong 30 phút, ở 70oC vi khuẩn bị vô hoạt trong 2 phút, trong điều kiện khô vi khuẩn có thể sống lâu Vi khuẩn có khả năng đề kháng với nhiều kim loại nặng như: arsenic, đồng, kẽm, thủy ngân và các chất sát trùng như hỗn hợp ammonium, oxy già, formadehyde và chlorhexidine (Hồ Thị Việt Thu, 2012)

Các chất sát trùng như acide phenic, biclorua thủy ngân, formon, hydroperoxid 0,1% diệt vi khuẩn sau 5 phút, nhưng vi khuẩn đề kháng mạnh với sự sấy khô Tuy

nhiên, ở môi trường bên ngoài các chủng E coli độc có thể tồn tại đến 4 tháng

Kháng nguyên H (flagellar antigen-kháng nguyên lông): kháng nguyên H của vi

khuẩn E coli không có vai trò bám dính, không có tính độc và cũng không có ý

nghĩa trong đáp ứng miễn dịch phòng vệ nên ít được quan tâm nghiên cứu, nhưng

có ý nghĩa rất lớn trong xác định giống, loài của vi khuẩn

Kháng nguyên K (capsular antigen-kháng nguyên giáp mô): vai trò của chúng chưa được thống nhất, có người cho rằng nó không có ý nghĩa về độc lực Cũng có ý kiến khác cho rằng kháng nguyên K cũng có ý nghĩa về mặt độc lực vì nó tham gia bảo

vệ vi khuẩn trước các yếu tố của cơ thể

Độc tố

E coli có thể sinh ra 2 loại nội độc tố và ngoại độc tố:

Nội độc tố (endotoxin) là những độc tố do vi khuẩn sản sinh ra nhưng chỉ được bài xuất ra ngoài khi nào vi khuẩn bị dung giải Thành phần hóa học của nó là một hợp chất gồm: glucid, lipid, protid chịu được nhiệt độ cao (Trần Linh Thước, 2003) Ngoại độc tố (exotoxin) là những chất độc do vi khuẩn tiết ra ngoài Ngoại độc tố

có bản chất protein, không chịu nhiệt (60 – 80oC) bị phá hủy bởi các phân hóa tố làm mất tác dụng Ngoại độc tố dễ tan và dễ lan rộng Nó thường gây hại bằng cách tác động vào tổ chức thần kinh hay vào máu làm tang huyết cầu Ngoại độc tố gồm

2 loại: độc tố làm tan huyết và độc tố đường ruột enterotoxin

Tính gây bệnh

E coli có sẵn trong ruột của động vật nhưng chỉ tác động gây bệnh khi sức đề kháng của con vật giảm sút Bệnh do trực khuẩn E coli có thể gây xảy ra như một

bệnh truyền nhiễm kế phát trên cơ sở thiếu vitamin và mắc các bệnh virus và ký

sinh trùng E coli thường gây bênh cho gia súc mới đẻ từ 2- 3 ngày hoặc từ 4 – 8

ngày (Lưu Hữu Mãnh, 2009)

Nguồn lây bệnh E coli chủ yếu là từ gà bệnh và gà khỏe mang trùng bài xuất mầm

bệnh ra môi trường nuôi nhốt, ngoài ra nguồn bệnh có thể do các loài gậm nhấm lây truyền sang hoặc có thể từ công nhân mang mầm bệnh từ môi trường ngoài vào (Nguyễn Xuân Bình, 2005)

2.2 Kháng sinh nhóm beta lactam

2.2.1 Cấu trúc kháng sinh nhóm beta lactam

Tất cả các kháng sinh nhóm B-lactam đều có vòng B-lactam trong cấu trúc phân tử Vòng beta-lactam có cấu trúc không gian hóa học 4 cạnh gồm 3 nguyên tử C và một nguyên tử N (Nguyễn Thị Vinh, 2007)

2.2.2 Phân loại kháng sinh nhóm beta lactam

Theo Hoàng Tích Tuyền (1998) được trích dẫn từ Hà Vũ Minh Trang (2012) kháng sinh nhóm beta lactam gồm có 2 nhóm: peniciliins và cephalosporins

Phân nhóm peniciliins gồm có: benzylpenicillin, phenoxypenicillin, penicillin

kháng penicillinase, aminopenicillin, carboxypenicillin, ureidopenicillin,

carbapenem

Nhóm kết hợp ức chế beta-lactamase: có tác dụng bất hoạt cầu ESBL Ví dụ: Amoxicillin kết hợp clavulanic acid (AMC), ampicillin kết hợp sulbactam (SAM), hay là piperacillin kết hợp tazobactam (TZP)

Phân nhóm cephalosporin gồm có: Cephalosporins thế hệ 1, thế hệ 2, thế hệ 3 và thế

hệ 4 Các Cephalosporins phổ rộng như cefotazidime, ceftriaxone được gọi là oxyimino-beta-lactam Một số kháng sinh về mặt lý thuyết và thử nghiệm trên invitro không bị phân hủy bởi ESBL gọi là cephamycin như: cefoxitin, cefotetan và cefmetazole Cephamycin gồm các cephalosporin có chuỗi bên 7a-methoxy bị ngăn chặn bằng thủy phân do các ESBL và các Beta-lactamase lớp A và lớp D

2.2.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh nhóm beta lactam

Theo Võ Thị Trà An (2012) kháng sinh ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn bằng cách can thiệp vào các enzyme transpeptidase có vai trò trong sự tạo các liên kết của chuổi peptidoglycan Các enzyme này liên kết với 1 nhóm protein nằm ở bên ngoài màng nguyên sinh chất PBP (penicillin – binding protein) Như vậy, điểm tác động của kháng sinh nhóm beta lactam chính là PBP Mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một kháng sinh trong nhóm này tùy thuộc vào mực độ gắn kết vơi PBP, khả năng xâm nhập vào tế bào và khả năng kháng được các enzyme beta lactam Beta- lactam không chỉ ức chế những liên kết nối cuối cùng của peptidoglycan trong tiến trình tổng hợp thành vi khuẩn mà còn gây tiết lipoteichoic acid tạo phản ứng tự

ly giải hay tự sát của vi khuẩn do sự hư hỏng peptidoglycan Beta lactam có tác động sát khuẩn phụ thuộc thời gian, nghĩa là phải đảm bảo rằng trong thời gian trị liệu nồng độ kháng sinh trong huyết tương hoặc mô bào đạt trên MIC Tuy nhiên,

do beta- lactam chỉ tác động lên vi khuẩn trong giai đoạn tăng trưởng (giai đoạn tổng hợp thành), ở nồng độ quá cao trên mức nồng độ sát khuẩn tốt nhất sẽ gây hiệu ứng Eagle (hiệu ứng ngược), nghĩa là giảm khả năng sát khuẩn Đây là một khái niệm quan trọng để tránh sử dụng quá liều kháng sinh nhóm này

2.3 Đề kháng kháng sinh

2.3.1 Hiện tượng đề kháng kháng sinh

Theo Võ Thị Trà An (2012) mặc dù việc sử dụng kháng sinh trong phòng và trị bệnh cho người và thú đem lại nhiều thành công và có hiệu quả kinh tế, việc dùng kháng sinh đã đồng thời tạo nên một áp lực chọn lọc đối với vi khuẩn Việc dùng kháng sinh sẽ luôn tạo ra sự đề kháng với chính nó ở một mức độ nhất định trong quần thể vi khuẩn

Đề kháng kháng sinh được phân loại gồm:

*Kháng tự nhiên

Vi khuẩn đã có tính kháng thuốc từ trước khi tiếp xúc với kháng sinh mỗi loài hoặc mỗi giống được đặc trưng và phát họa phổ hoạt động kháng sinh riêng Các gene đề

kháng là tài sản di truyền của chính vi khuẩn Đề kháng tự nhiên là đặc điểm có ở tất cả các chủng của cùng một loài, và được biết ngay từ lúc đầu khi nghiên cứu xác định hoạt tính của kháng sinh và xác định phổ tác dụng của thuốc kháng sinh

*Kháng mắc phải

Do đột biến: vi khuẩn có chu kỳ phát triển từ vài giây đến vài phút nên chúng rất linh hoạt trong biến đổi để phù hợp với những thay đổi của môi trường, đề kháng do đột biến xảy ra từ từ và là một tiến trình tích lũy (Võ Thị Trà An, 2012) Việc đột biến nhiễm sắc thể liên quan tới nhiều kháng sinh mới Việc xuất hiện các đột biến

có tần suất thay đổi theo vi khuẩn và theo kháng sinh

Do plasmid: nhiều plasmid khác nhau có thể trùng hợp trong cùng một vi khuẩn và phối hợp với một sự đề kháng nội tại dẫn đến đa đề kháng

Do transposon các plasmid đề kháng có thể tiến triển in vitro do tiếp thu hay mất đi lần lượt những đặc tính đề kháng, hệ quả của tính chất chuyển giao được của phần lớn các gene Các transposon là hệ quả của ADN có thể đổi chỗ các replicon lẫn nhau (chuyển vị nội phân tử) hay tại một nơi của cùng một replicon (chuyển vị ngoại phân tử), mặc dù không có sự tương đồng giữa các ADN mà chúng tác dụng Tuy nhiên, đôi khi có những vùng gián tiếp riêng

2.3.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh

Theo Võ Thị Trà An (2012) các vi khuẩn đề kháng có thể sinh ra một enzym phá hủy hoặc làm bất hoạt thuốc Ví dụ: β-lactamase phá vỡ các vòng β-lactam của penicillin và các phân tử tương tự, biến nó thành dạng không hoạt động Các tác nhân gây bệnh đề kháng có thể làm chậm hoặc ngăn ngừa sự xâm nhập của thuốc vào tế bào Cơ chế này thường có liên quan đến những sự thay đổi trong cấu trúc hoặc điện tích của các protein màng tế bào chất tạo nên các kênh hay các lỗ Các protein này nằm trong màng ngoài của vi khuẩn Gram âm gọi là các porin Các protein porin bị thay đổi bắt nguồn từ những thay đổi trong các gene nhiễm sắc thể Các thế bào đề kháng có thể làm thay đổi thụ thể đối với thuốc do vậy nó không thể gắn vào hoặc liên kết một cách hiệu quả tới đích của nó Các tế bào đề kháng có thể làm thay đổi hóa học trao đổi chất của chúng hoặc chúng có thể từ bỏ toàn bộ các bước trao đổi chất mẫn cảm Các tế bào đề kháng có thể bơm thuốc ra khỏi tế bào trước khi thuốc có thể gây tác dụng

2.4 Men beta lactamase phổ mở rộng

trên thế giới với tần suất khác nhau tùy theo mỗi nước, mỗi khu vực Số loại men ESBL mới được phát hiện ngày càng nhiều, các nhà khoa học nhận thấy còn có rất nhiều chủng trực khuẩn Gram âm khác sinh men beta lactam (Trích dẫn của Hà Vũ Minh Trang, 2012)

2.4.2 Một số phương pháp phát hiện vi khuẩn sinh ESBL

Xét nghiệm xác định ESBL dựa vào tìm kiếm sự cộng hưởng giữa oxymino – cephalosporin và clavulanate Vì clavulanate có tác dụng ức chế ESBL Nhiều phương pháp phát hiện ESBL được đề nghị dựa trên nguyên tắc đĩa khuyếch tán của Kirby – Bauer (1966) Hiện nay, các phương pháp cộng hưởng đang được sử dụng rộng rãi là: Phương pháp đĩa đôi, phương pháp đĩa kết hợp và phương pháp E – test

Phương pháp đĩa đôi

Dựa trên nguyên tắc clavulanic acid ức chế ESBL nên làm giảm mức độ đề kháng của cephalosporins và mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa kháng sinh cephalosporins khi đặt gần một đĩa kháng sinh chứa clavulanic acid Vi khuẩn được cấy trên đĩa thạch Mueller – Hinton Đặt đĩa cephalosporin (30µg) với đĩa amoxicillin – clavulanate (20µg) cách nhau 20 – 25mm trên mặt thạch Trước đây, khoảng cách yêu cầu là 30mm, nhưng hiện nay, khoảng cách được giảm xuống để tăng độ nhảy cảm của phương pháp Có cộng hưởng khi có sự mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa cephalosporin ở vùng giao tiếp với đĩa chứa clavulanate

Phương pháp đĩa kết hợp: Sử dụng hai loại đĩa kháng sinh là cephalosporins thế

hệ 3 và cephalosporins thế hệ 3 tương ứng phối hợp với clavulanic acid Vi khuẩn tiết ESBL khi hiệu số đường kính vòng vô khuẩn của đĩa cephalosporins có phối hợp với clavulanic acid so đĩa cephalosporins ≥5mm

Tiêu chuẩn CLSI, 2014 yêu cầu với phương pháp này cần phải thực hiện đồng thời trên cả hai hệ thống là : cefotaxime (30µg)/ cefotaxime – clavulanic acid (30/10µg); ceftazidime (30µg)/ ceftazidime – clavulanic acid (30/10µg)

Phương pháp E – test: Dùng que E – test một đầu là dãy chứa nồng độ của

cephalosporin và đầu kia là dãy nồng độ của cephalosporin/ clavulanic acid ESBL

sẽ có vùng ức chế vi khuẩn ở phần chứa kháng sinh kết hợp clavulanic acid, phần còn lại không có chất ức chế dẫn đến kháng sinh bị ESBL phân hủy nên vùng ức chế vi khuẩn nhỏ hơn hoặc không có vùng ức chế do vi khuẩn không bị kháng sinh

ức chế Vi khuẩn sinh ESBL dương tính sẽ có vùng ức chế hình eclip và nồng độ MIC ở vùng kháng sinh không kết hợp với clavulanic acid tăng gấp 8 lần phần còn lại

Phương pháp ChromID ESBL agar môi trường ChromID ESBL chứa kháng sinh

cefpodoxime và chất màu, nếu vi khuẩn sinh ESBL sẽ kháng với cefpodoxime có

khả năng phát triển trên môi trường ChromID ESBL tạo thành các khuẩn lạc có màu sắc khác nhau, đặc trưng cho một số loài vi khuẩn

Phương pháp Vitek ESBL test phương pháp này dựng card MIC có chứa

cephalosporin nồng độ bắt đầu từ 0,5µg/ml trộn với clavulanic acid nồng độ 4 µg/ml Kết quả nếu vi khuẩn có ESBL sẽ cho MIC cephalosporin >= 8 µg/ml

Phương pháp Micro scan panels tấm panel nhựa có 4 giếng chứa môi trường

kháng sinh cephalosporin và cephalosporin/clavulanic acid, cấy vi khuẩn vào các giếng rồi để vào tủ ấm 18 – 24 giờ đọc kết quả, nếu ESBL dương tính, vi khuẩn sẽ không mọc ở giếng có cephalosporin kết hợp clavulanic acid

Phương pháp máy định danh vi khuẩn và kháng sinh đồ BD Phoenix với 5

hàng giếng có chứa kháng sinh gồm 2 hàng đầu cefodoxime, ceftazidime, và các hàng sau là ceftazidime kết hợp clavulanic acid, cefotaxime kết hợp clavulanic acid, ceftriaxone kết hợp clavulanic acid Nếu vi khuẩn sinh ESBL dương tính, máy sẽ tự động báo kết quả và cho thông tin liên quan

2.5 Tình hình nghiên cứu trên thế thới

Theo Ilse Overdevest et al (2011), khảo sát từ 927 mẫu phân trực tràng trên người

tại 4 bệnh viện phía nam Hà Lan, 89 mẫu thịt gà và 85 mẫu thịt bò và 57 mẫu thịt

heo Kết quả đa phần E coli ESBL dương tính trên thịt gà (68/89) 76,8%, thịt bò

4,7% (4/85), và thịt heo 1,8% (1/57) Có tổng cộng 4,9% (4,5/927) mẫu phân trực

tràng trên người dương tính với E coli ESBL Kết quả giải trình tự gene mã hóa cho

thấy các gene ESBL chiếm ưu thế trong thịt gà và mẫu phân ở người tương đồng nhau Những phát hiện của nghiên cứu cho thấy mối quan hệ sự tương đồng các gene ESBL trên gà và người cùng sự hiện diện phong phú gene ESBL trong thức ăn

có thể có một ảnh hưởng nghiêm trọng trong lựa chọn kháng sinh điều trị cho các

bệnh nhiễm trùng gây ra bởi vi khuẩn E coli

Li Yuan et al (2009) thu thập 51 mẫu gan của gà bệnh chết từ 14 trang trại gà ở Hà Nam Trung Quốc năm 2008 Kết quả 60,8% (31/51) mẫu dương tính với E coli

ESBL Phần lớn các chủng cũng đều kháng với nhóm beta-lactam, và kháng với gentamicin (87,1%), amikacin (80,6%), enrofloxacin (80,6%) và sulfamethox-azole / trimethoprim (90,3%)

Nghiên cứu của Annemieke Smet et al (2008), lấy ngẫu nhiên 498 mẫu phân manh

tràng từ 5 trang trại gà thịt 5 tuần tuổi ngẫu nhiên ở Bỉ Kết quả có 26,7% (133/498)

mẫu dương tính với E coli ESBL Các mẫu đều kháng vơi nhóm beta lactam và

kháng với kanamycin 7,5%, gentamicin 4%, streptomycin 30,2%, tetracycline

48,1%, trimethoprim 64,4% Tỉ lệ đa kháng cho thấy 76% E coli ESBL có khả

năng kháng trên 2 loại kháng sinh, 4% kháng với 8 kháng sinh không thuốc nhóm beta lactam

Nghiên cứu Delphine Girlich et al (2007) phân tích trong 112 mẫu manh tràng gia

cầm khỏe mạnh trong cơ sở giết mổ của bảy huyện ở Pháp vào năm 2005, trong đó

có 10,7% (12/112) mẫu có E coli ESBL các mẫu được cấy trên môi trường thạch

MacConkey chứa ceftazidime (1 ug/ml) hoặc cefotaxime (1 ug/ml)

Laube et al (2013) E coli kháng kháng sinh nhóm beta-lactam do sản xuất ESBL

ngày càng tăng hiện đang là vấn đề làm hạn chế đáng kể sự lựa chọn điều trị trong

cả y học trên con người và thú y Sự hiện diện của gene ESBL trong E coli từ động

vật sản xuất thực phẩm như gà có thể gây nguy hiểm sức khỏe con người Khảo sát

140 mẫu phân manh tràng trên gà ( 20 mẫu của mỗi trang trại ở 3 thời điểm khác nhau) và 20 mẫu phân sàn, 21 mẫu chất đệm chuồng, 21 mẫu swab ủng, 83 swab phân, 21 mẫu rạt bụi (200g phân và 200g rác, khoảng 2 g gộp các mẫu bụi) được thu thập từ ít nhất 10 điểm khác nhau trên mỗi lần lấy mẫu từ 7 trang trại khác nhau

ở Đức 2013 Kết quả tỉ lệ E coli dương tính với ESBL từ mẫu phân manh tràng gà

1-2 ngày tuổi 36,42 % (51/140), gà 14-18 ngày tuổi 53,57% (75/140), gà 26-35 ngày tuổi 54,28% (76/140) Phân sàn 100% (20/20), ổ rơm 95.2% (20/21), swab ủng 90.4% (19/21), swab phân 54.2% (45/83), mẫu bụi 71.4% (15/21)

Theo Cindy Dierikx et al (2012) lấy 25 hoặc 41 bệnh phẩm manh tràng được thu

thập từ gà thịt ở mỗi 26 trang trại và 18 mẫu phân từ 18 nông dân gà thịt được phân tích để xác định sự hiện diện của ESBL Kết quả gà từ tất cả các trại phân lập

E coli ESBL có tỉ lệ ≥80% trong 22/26 trại và 33% (6/18) mẫu phân từ nông dân dương tính với E coli ESBL Nghiên cứu này cho thấy một tỷ lệ cao E coli ESBL

trên gà thịt ở các trang trại Hà Lan và trên nông dân, đây là điều không mong muốn ảnh hưởng đến sức khỏe con người

Valeria Bortolaia et al (2010) thử nghiệm sự nhạy cảm của vi khuẩn E coli ESBL với kháng sinh của 67 E coli ESBL từ 1 trang trại gà giống và 4 trang trại gà thịt

nằm ở Đông Bắc Italy Lấy 18 mẫu thử kháng sinh đồ trong đó trại 1: gà thịt 12 ngày tuổi (n=3), trại 2: gà thịt 35 ngày (n=2), trại 3: gà thịt 70 ngày (n=8), trại 4: (n=1) gà thịt 35 ngày tuổi, trại 5: gà giống (n=4) Kết quả 94% (17/18) phân lập được kháng với tetracycline, và 83% (15/18) phân lập được kháng với nalidixic axit, 44% (8/18) trong số đó đã kháng ciprofloxacin Sulfon-amide kháng hoặc kết hợp với trimethoprim được phát hiện là 22% (4/18) và 55% (10/18) tương ứng Nhạy với amikacin, colistin, và imipenem Đa kháng với 4-5 loại kháng sinh (33,3%), kháng với 6 loại kháng sinh (5,5%), trên 7 loại kháng sinh (39%)

Theo Nghiên cứu của Randall et al ( 2011) về tỷ lệ nhiễm E coli mở rộng phổ

beta-lactamase (CTX-M và TEM-52) từ gà thịt và gà tây trong Vương quốc Anh từ năm 2006 và 2009 Thử kháng sinh đồ từ 23 mẫu gà tây không có mẫu nào trong số các mẫu kháng với amikacin, nhưng kháng với ampicillin 100%, streptomycin 39,1%, sulphonamide 78,3% và trimethoprim/sulfamethoxazole 43,5% Đa kháng

với hơn 4 loại kháng sinh bất kỳ với tỉ lệ 70% (tetracycline, gentamicin, streptomycin, ampicillin) Theo Randall thì sự đề kháng kháng sinh của đàn gà thịt lớn hơn nhiều so với đàn gà giống, đề kháng kháng sinh như ampicillin, streptomycin, sulphonamide, trimethoprim/ sulpho-namides và tetracycline phổ biến

ở cả gà giống và gà thịt

Theo nghiên cứu của Gundogan and Avci, (2013) phân lập từ 15 mẫu thịt gà, kết

quả 66,6% (10/15) mẫu thịt gà nhiễm E coli ESBL E.coli phân lập kháng với

ampicillin (100%), tetracycline (77,8%) và nhạy với gentamicin (93,3%) và

amikacin (95,6%) Ba mươi (66,7%) E coli phân lập kháng với 1 - 2 kháng sinh,

và nhiều khả năng chống nhiều hơn ba loại kháng sinh 37,8%

Theo Stefan Börjesson et al (2013) có 44% (44/100) các mẫu thịt gà ở Thụy Điển phát hiện E Coli ESBL Sự xuất hiện E coli ESBL trong gà ở Thủy Điển là do lây

truyền dọc từ nhập khẩu con giống

Tuy nhiên, ở Việt Nam các nghiên cứu về E coli ESBL trên vật nuôi nói chung hay

trên gà nói riêng chưa được nghiên cứu nhiều