Dụng cụ lấy mẫu: Găng tay, tâm bông vô trùng, thùng đựng mẫu, đá khô.
Dụng cụ dùng trong phòng vi sinh: tủ lạnh bảo quản mẫu, tủ sấy, tủ ấm, autoclave, tủ nung, ống nghiệm, đĩa petri vô trùng, tâm bông vô trùng, que cấy, đèn cồn, kẹp, micropipet, eppendorf, máy PCR, máy ly tâm, khuôn gel, lượt, máy điện di, microwave, máy chụp hình gel.
Hóa chất thí nghiệm: Mac Conkey Agar (MC, Merck KgaA Germany), Nutrient Agar (NA, Merck KgaA Germany), Nutrient Broth (NB, Merck KgaA Germany), MHA, Simmon‟s Citrate Agar (Merck KgaA Germany), Tryptone broth, MR-VP broth, ceftazidime (30mg), ceftazidime (30mg) + clavulanic acid (10mg), cefotaxime (30mg), cefotaxime (30mg) + clavulanic acid (10mg).
Glyceril, nước cất, cồn 700, 900, NaCl 0,9%, thuốc thử Kovac‟s, Methyl Red (MR), NaOH 40%, -napthol 5%, agarose gel 1,5%, TAE 1x, Mytaq-mix 2x, Ethidium Bromide, mồi ngược, mồi xuôi cho kiểu gen CTX-M với nồng độ 1µM.
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu
Nghiên cứu được tiến hành khảo sát trên 120 mẫu phân gà khỏe tại tỉnh Trà Vinh, trong đó có 30 mẫu gà thịt 1 tuần tuổi, 30 mẫu gà thịt 1 tháng tuổi và 60 mẫu gà đẻ tại tỉnh Trà Vinh gồm năm huyện: Cầu Kè, Tiểu Cần, Cầu Ngang, Càng Long và TP.Trà Vinh.
Lấy mẫu phân gà: dùng tăm bông vô trùng đưa vào lỗ huyệt của gà để lấy phân rồi đưa ngay vào trong ống nghiệm vô trùng có chứa môi trường chuyên chở, có ghi ký hiệu, mẫu được bảo quản lạnh rồi đưa vào phòng thí nghiệm phân tích.
3.2.2 Phƣơng pháp phân lập E.coli sinh menESBL
Cấy mẫu phân trực tiếp vào môi trường MC có chứa kháng sinh ceftazidime (2mg/l) rồi đem ủ ở 370C trong 24 giờ. Chọn khuẩn lạc to, tròn đều, hơi lồi, màu hồng đậm. Tiếp tục ta chọn 10 khuẩn lạc điển hình như trên cấy vào môi trường NA để làm thuần vi khuẩn, đem ủ ở 370C trong 24 giờ. Tiến hành thử IMViC để khẳng định những vi khuẩn được cấy thuần là E.coli.
Phương pháp kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli
Vi khuẩn E. coli sau khi được tăng sinh trên môi trường NA, tiến hành kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn trên các môi trường Tryptone, MR-VP và Simmon‟s Citrate.
Môi trường Trypton dùng để kiểm tra tính sinh Indole của vi khuẩn. Sau khi nhỏ thuốc thử Kovacs‟ vào môi trường này, nếu trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng đỏ thì phản ứng dương tính, ngược lại nếu vòng đỏ không xuất hiện thì phản ứng âm tính.
Môi trường MR-VP với thuốc thử Methyl Red dùng để kiểm tra tính sử dụng đường của vi khuẩn. Nhỏ một giọt thuốc thử vào môi trường này, nếu vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trường là phản ứng dương tính và ngược lại.
Môi trường MR-VP với thuốc thử VP1 và VP2 dùng để kiểm tra tính di động và kiểm tra tính sinh aceton của vi khuẩn. Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm đục môi trường. Ngược lại. vi khuẩn không có khả năng di động thì chỉ thấy vi khuẩn mọc ở đường que cấy, môi trường xung quanh trong. Trong môi trường này, sau khi cho thuốc thử VP1, VP2 vào nếu trên bề mặt môi trường có vòng đỏ thì chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sinh acetone và ngược lại.
Môi trường Simmon‟s Citrate dùng để kiểm tra khả năng sử dụng Citrate thay nguồn Carbon của vi khuẩn. Trên môi trường này, vi khuẩn cho kết quả dương tính khi màu của môi trường chuyển từ xanh lục sang xanh dương, nếu môi trường vẫn giữ màu xanh lục được gọi là phản ứng âm tính.
Sau khi xác định E. coli bằng phương pháp IMViC, ta pha huyễn dịch vi khuẩn dựa vào ống Mcfarland 0,5 (108 CFU/ml). Tiếp theo, dùng tâm bông vô trùng lấy huyễn dịch và cấy vào đĩa MHA rồi áp dụng phương pháp đĩa kết hợp bằng cách đặt đối diện lần lượt các khoanh giấy kháng sinh ceftazidime và ceftazidime kết hợp
clavulanic acid, cefotaxime và cefotaxime kết hợp clavulanic acid vào môi trường MHA, đem ủ 370
C trong 16 -18 giờ. Sau cùng đo đường kính vô khuẩn, nếu đường kính ức chế ở khoanh kết hợp lớn hơn khoanh còn lại 5mm thì kết luận vi khuẩn ESBL (+).
Quy trình phân lập E. coli sinh men ESBL được thể hiện qua sơ đồ:
Hình 3.1. Quy trình phân lập E.coli sinh men ESBL 370C/24h
Mẫu phân
Cấy trên môi trường MC có kháng sinh ceftazidime
Chọn 10 khuẩn lạc điển hình cho
E.coli cấy thuần trên môi trường NA 370C/24h Xét nghiệm IMViC (++--) Khẳng định E.coli 370C/24h 9ml nước muối sinh lý vô trùng Ống Mcfarland 0,5 (108CFU/ml) So độ đục
Cấy E.coli trên môi trường MHA, đặt kháng sinh ceftazidime và ceftazidime kết
hợp clavulanic acid, cefotaxime và cefotaxime kết hợp clavulanic acid
Đo đường kính vòng vô khuẩn, ceftazidime/ clavulanic acid – ceftazidime hoặc cefotaxime/
clavulanic acid – cefotaxime > = 5mm
Khẳng định E. coli ESBL 370C/16-18h
3.2.3 Phƣơng pháp xác định gen CTX-M mã hóa ESBL
Ly trích DNA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Vi khuẩn E. coli ESBL trong môi trường NB, ta đem chúng tăng sinh trong môi trường NA. Dùng micropipet rút 500 µl nước cất hai lần vô trùng cho vào eppendorf 1.5ml. Tiếp theo ta dùng que cấy tròn lấy vi khuẩn E.coli ESBL tăng sinh trên NA cho vào eppendorf 1.5ml đã có 500 µl nước cất hai lần vô trùng. Đem nung cách thủy ở nhiệt độ 1000C trong 15 phút, sau đó đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút rồi ta rút phần nổi làm DNA khuôn mẫu cho vào ống eppendorf 1.5ml mới và thực hiện phản ứng với máy PCR xác định kiểu gen CTX-M mã hóa ESBL.
Thành phần một phản ứng Bảng 3.1: Thành phần phản ứng PCR Thành phần 1 mẫu (µl) 30 mẫu (µl) Nước khử ion 4.5 135 Mytaq-mix 2x 7.5 225 Mồi xuôi, 100 µM 1 30 Mồi ngược, 100 µM 1 30 Mẫu DNA 1 - Tổng 15 420
Trộn đều thành phần trên (trừ mẫu DNA), chia mỗi tube 14 µl. Cho 1 µl DNA khuôn mẫu vào các tube chứa hỗn dịch PCR. Bảng 3.2: Trình tự các primer được sử dụng trong phản ứng PCR
(Mary Ann et al., 2012)
Primer Trình tự Kích thước sản phẩm
khuếch đại CTX-M Forwarf 5‟CGCTTTGCGATGTGCAG3‟ 550 base pairs CTX-M Reverse 5‟ACCGCGATATCGTTGGT3‟
MR-VP MR-VP
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Bảng 3.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR dùng để xác định gen CTX-M
Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
Tiền biến tính 950C 4 phút 1
Biến tính 940C 1 phút
35
Bắt cặp 420C 1 phút
Kéo dài 720C 1 phút 30 giây
Kéo dài 720C 7 phút 1
(Mary Ann et al., 2012)
Quy trình điện di sản phẩm PCR
Pha gel agarose với nồng độ 1,5%: cân 1,5g agarose cho vào 100ml dung dịch TAE 1X. Lắc đều và đun hòa tan thạch bằng lò vi sóng. Để thạch nguội khoảng 50-550C đổ khuôn tạo gel, chờ thạch đông lại. Gỡ lược ra, để miếng gel vào buồng điện di có dung dịch đệm TAE 1X. Cho 5 µl sản phẩm PCR và 100bp DNA ladder vào các giếng. Điện di ở 50V trong 30 phút. Sau đó nhuộm gel trong dung dịch ethidium bromide trong 10 phút rồi rửa bằng nước cất trong 15 phút. Soi gel dưới tia UV và chụp ảnh.
3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phương pháp Chi Bình Phương (Chi-Square Text), sử dụng phẩn mềm Minitab 16.0.
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ hiện diện E. coli sinh men ESBL trên gà thịt 1 tuần tuổi tuổi
Bảng 4.1: Tỷ lệ hiện diện E. coli sinh men ESBL trên gà thịt 1 tuần tuổi
Địa điểm
Gà thịt 1 tuần tuổi
Số mẫu (con) Số mẫu dƣơng
tính (con) Tỷ lệ (%) Cầu Kè 6 5 83,33a Tiểu Cần 6 5 83,33a TP. Trà Vinh 6 2 33,33ab Cầu Ngang 6 1 16,67b Càng Long 6 4 66,67ab Tổng 30 17 56,67
Các giá trị số mũ trong cùng một cột khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P <0,05)
Kết quả bảng 4.1 cho thấy, tỷ lệ hiện diện E. coli ESBL trên gà thịt 1 tuần tuổi là 56,67%. Trong đó, số mẫu dương tính ở huyện Cầu Kè và huyện Tiểu Cần chiếm tỷ lệ là 83,33%, trong khi huyện Càng Long là 66,67%, TP.Trà Vinh là 33,33% và huyện Cầu Ngang chiếm tỷ lệ là 16,67%. Tỷ lệ hiện diện E.coli ESBL trên gà thịt 1 tuần tuổi ở huyện Cầu Kè và huyện Tiểu Cần cao hơn so với huyện Cầu Ngang, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (P = 0,021). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Theo nghiên cứu của Lưu Hữu Mãnh và ctv. (2010) thì tỷ lệ nhiễm E. coli trên phân gà giai đoạn 0-2 tuần tuổi là 69,05% mà kết quả E. coli ESBL trên phân gà thịt giai đoạn 1 tuần tuổi với tỷ lệ tương đối cao là 56,67%, điều này chứng tỏ rằng sự hiện diện của E. coli có trong phân gà thịt 1 tuần tuổi chiếm tỷ lệ nhiều hơn so với tỷ lệ
E. coli ESBL.
Ở gà giai đoạn 1 tuần tuổi có sự hiện diện E. coli ESBL cao như vậy cho thấy môi trường chuồng trại có sự tồn tại vi khuẩn E. coli ESBL, chúng được bài thải ra môi trường bên ngoài chủ yếu qua phân. Theo Cindy et al. (2013) thì E. coli ESBL ngoài hiện diện trong cơ thể gà, chúng còn có mặt trong môi trường chuồng trại,
chất độn chuồng, thức ăn và nước uống trong chuồng. Vì vậy, nếu không vệ sinh chuồng trại sạch sẽ thường xuyên thì trong chuồng nuôi tất yếu sẽ có sự lưu hành vi khuẩn này và qua đó sẽ lây nhiễm cho những con khỏe khác.
Qua kết quả trên cho thấy việc chăn nuôi gà thả vườn nếu không chú ý đến vấn đề vệ sinh cũng như chăm sóc quản lý chuồng trại tốt thì E. coli ESBL sẽ có cơ hội phát tán vào trong môi trường. Khi sức đề kháng của gà giảm, vi khuẩn có thể gieo rắc mầm bệnh, chúng sẽ trở thành nguồn bệnh nguy hiểm cho gà. Khi đó việc sử dụng kháng sinh có thể gây tốn kém mà không mang lại hiệu quả vì những vi khuẩn này có khả năng tiết men ESBL làm ức chế hiệu quả của kháng sinh, đặc biệt là những kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin.
4.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ hiện diện E. coli sinh men ESBL trên gà thịt 1 tháng tuổi tuổi
Bảng 4.2: Tỷ lệ hiện diện E. coli sinh men ESBL trên gà thịt 1 tháng tuổi
Địa điểm
Gà thịt 1 tháng tuổi
Số mẫu (con) Số mẫu dƣơng
tính (con) Tỷ lệ (%) Cầu Kè 6 2 33,33a Tiểu Cần 6 1 16,67a TP. Trà Vinh 6 3 50a Cầu Ngang 6 4 66,67a Càng Long 6 3 50a Tổng 30 13 43,33
Các giá trị số mũ trong cùng một cột giống nhau thì khác nhau không có ý nghĩa thống kê (P >0,05)
Kết quả bảng 4.2 cho thấy tỷ lệ hiện diện vi khuẩn E. coli ESBL trên gà thịt 1 tháng tuổi là 43,33%, trong đó ở huyện Cầu Ngang chiếm tỷ lệ cao nhất 66,67%, tỷ lệ này ở các huyện Càng Long, TP. Trà Vinh, Cầu Kè lần lượt là 50%, 50%, 33,33% và huyện Tiểu Cần chiếm tỷ lệ thấp nhất là 16,67%. Tuy nhiên qua phân tích thống kê cho thấy, sự khác nhau này không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05).
Đối với gà thịt giai đoạn 1 tháng tuổi với tỷ lệ E. coli ESBL hiện diện trong phân tương đối cao là 43,33%. Do đó gà thịt giai đoạn này đến giai đoạn xuất chuồng sẽ
có sự hiện diện của vi khuần E. coli ESBL với tỷ lệ ngày càng cao trong phân, vì theo Overdevest et al. (2011); Lucianne et al. (2013) và Cindy et al. (2013) thì
E. coli ESBL có thể lây truyền qua plasmid, qua đó các chủng vi khuẩn sẽ trao đổi được các gen đề kháng với nhau . Như vậy người chăn nuôi cũng như cơ sở giết mổ gia cầm cần chú ý vệ sinh không nên để phân gà vấy nhiễm trên thân thịt, nếu không thịt gà có thể là nguồn lây nhiễm E. coli ESBL nguy hiểm cho người. Vì theo Maria et al. (2011) và Felix et al. (2013) thì E. coli ESBL thông qua thực phẩm có thể truyền cho người. Những động vật bị nhiễm các chủng vi khuẩn E. coli ESBL có liên quan trực tiếp với các chủng vi khuẩn E. coli ESBL trên người.
Theo Hiroi et al. (2012) môi trường chăn nuôi vệ sinh là một yếu tố quan trọng trong việc hạn chế sự nhiễm E. coli ESBL ở gà. Chính vì vậy mà người chăn nuôi cần chú ý vệ sinh chuồng trại thường xuyên, thay chất độn chuồng, vệ sinh máng ăn, máng uống sạch sẽ sau mỗi lần cho ăn, tạo không gian thoáng mát, sạch sẽ, góp phần hạn chế tối đa sự hiện diện của vi khuẩn E. coli ESBL này trên gà.
4.3 Kết quả khảo sát tỷ lệ dƣơng tính E. coli sinh men ESBL trên phân gà đẻ
Bảng 4.3: Tỷ lệ hiện diện E. coli sinh men ESBL trên phân gà đẻ
Địa điểm
Gà đẻ
Số mẫu (con) Số mẫu dƣơng
tính (con) Tỷ lệ (%) Cầu Kè 12 7 58,33ab Tiểu Cần 12 11 91,67a TP. Trà Vinh 12 11 91,67a Cầu Ngang 12 6 50b Càng Long 12 9 75ab Tổng 60 44 73,33
Các giá trị số mũ trong cùng một cột khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P <0,05)
Kết quả bảng 4.3 cho thấy, trong tổng số 60 gà đẻ thì có 44 con dương tính với E. coli ESBL, chiếm tỷ lệ tương đối cao là 73,33%. Trong đó, huyện Tiểu Cần và TP. Trà Vinh chiếm tỷ lệ cao nhất 91,67%. Kết quả phân lập E. coli ESBL ở huyện Càng Long là 75%, huyện Cầu Kè là 58,33%, huyện Cầu Ngang chiếm thấp nhất
với tỷ lệ là 50%. Qua phân tích thống kê cho thấy, tỷ lệ hiện diện E. coli ESBL trên phân gà đẻ ở huyện Tiểu Cần, TP. Trà Vinh cao hơn so với huyện Cầu Ngang, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (P = 0,025). Theo Cindy et al. (2013) thì
E. coli sinh men ESBL vẫn có hiện diện trong môi trường chuồng trại, thức ăn, nước uống có trong chuồng. Chính vì vậy rất có thể đây là một trong những nguyên nhân làm cho gà đẻ ở các huyện của tỉnh Trà Vinh với tỷ lệ dương tính rất cao. Đồng thời thì gà đẻ được nuôi lâu dài, với phương thức chăn nuôi bằng nền chuồng nên vấn đề tiếp xúc với phân là việc không tránh khỏi. Do đó, để hạn chế sự lây nhiễm E. coli ESBL trong đàn thì người chăn nuôi cần phải chú trọng đến công tác vệ sinh sát trùng chuồng trại một cách thường xuyên hơn.
Qua kết quả trên cho thấy có sự hiện diện cao E. coli ESBL trên gà đẻ. Theo Hồ Thị Việt Thu và ctv. (2012) thì E. coli có thể lây truyền qua trứng, qua đó trứng sẽ trở thành nguồn lây nhiễm E. coli ESBL cho gà con, hoặc trong quá trình gà mẹ chăm sóc cho gà con, gà con có thể tiếp xúc với phân gà hoặc thức ăn, nước uống có trong chuồng, tạo điều kiện cho E. coli ESBL hiện diện trong cơ thể của gà con, chính vì vậy mà gà giai đoạn còn nhỏ vẫn có sự xuất hiện của E. coli ESBL.
58.33 91.67 91.67 50 75 Cầu Kè Tiểu Cần TP. Trà Vinh Cầu Ngang Càng Long
Hình 4.1. Biểu đồ thể hiện tỷ lệ hiện diện E. coli ESBL trên gà đẻ tại các huyện (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.4 So sánh tỷ lệ hiện diện E. coli sinh men ESBL giữa các loại gà
Bảng 4.4: Kết quả phân lập E. coli sinh men ESBL hiện diện trong phân của các loại gà khỏe
Các giá trị số mũ trong cùng một cột khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P <0,05)
Kết quả bảng 4.4 cho thấy, gà đẻ có tỷ lệ hiện diện E. coli sinh men ESBL cao nhất chiếm 73,33% và gà thịt chiếm tỷ lệ thấp nhất là 50% , trong đó gà thịt 1 tuần tuổi chiếm tỷ lệ là 56,67%, gà thịt 1 tháng tuổi chiếm tỷ lệ là 43,33%. Tỷ lệ hiện diện
E. coli ESBL ở gà đẻ cao hơn gà thịt, sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê (P = 0,009). Nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau này có thể là do gà đẻ với tập quán nuôi lâu dài, lượng phân thải ra nhiều hơn và có thời gian tiếp xúc phân chuồng cũng nhiều hơn so với gà thịt nên E. coli ESBL hiện diện trên phân gà đẻ cao hơn trên phân gà thịt. Như vậy để hạn chế sự lây nhiễm E. coli ESBL trên gà, người chăn nuôi cần đặc biệt chú ý tới việc vệ sinh chuồng trại nhằm hạn chế tối đa sự tiếp xúc với phân gà chứa vi khuẩn E. coli ESBL này.
Kết quả nghiên cứu này cao hơn so với kết quả của Daniela et al. (2009) với tỷ lệ hiện diện của E. coli ESBL trên phân gà khỏe ở Bồ Đào Nha là 42,1 %. Sự khác biệt này có thể do điều kiện địa lý, môi trường nuôi, quy trình chăm sóc, nuôi dưỡng, vệ sinh phòng bệnh khác nhau (Hawkey, 2008).
Đối với gà nuôi theo nông hộ, việc sử dụng kháng sinh thì không phổ biến bằng gà nuôi công nghiệp (Daniela et al., 2009) nhưng tỷ lệ dương tính E. coli ESBL lại cao