khảo sát ảnh hưởng của môi trường nhân nuôi trên mật số và sức sống của chủng vi khuẩn bacillus amyloliquefaciens

TÓM LƯỢC Đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nhân nuôi trên mật số và sức sống của chủng vi khuẩn Bacillus Amyloliquefaciens” được thực hiện từ 3/2013 đến tháng 3/2014 trong đi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

VÕ HUỲNH PHONG

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI

TRƯỜNG NHÂN NUÔI TRÊN MẬT SỐ VÀ SỨC SỐNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN

BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH: BẢO VỆ THỰC VẬT

Cần Thơ, 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH: BẢO VỆ THỰC VẬT

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA

MÔI TRƯỜNG NHÂN NUÔI TRÊN MẬT SỐ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT

Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Bảo vệ Thực vật với đề tài

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA

MÔI TRƯỜNG NHÂN NUÔI TRÊN MẬT SỐ

VÀ SỨC SỐNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN

BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS

Do sinh viên Võ Huỳnh Phong thực hiện

Kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2014 Cán bộ hướng dẫn

TS Trần Vũ Phến

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn tốt nghiệp kỹ Bảo Vệ Thực Vật với tên:

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA

MÔI TRƯỜNG NHÂN NUÔI TRÊN MẬT SỐ

VÀ SỨC SỐNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN

BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS

Do sinh viên Võ Huỳnh Phong thực hiện và bảo vệ trước hội đồng

Ý kiến của hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp:

Luận văn tốt nghiệp hội đồng đánh giá ở mức:

DUYỆT KHOA Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2014

Chủ tịch Hội đồng

i

LƯỢC SỬ CÁ NHÂN

Họ và tên: Võ Huỳnh Phong

Năm sinh: 30-04-1992

Nơi sinh: thị trấn Nhà Bàng, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang

Họ tên cha: Võ Văn Dũng

Họ tên mẹ: Phan Thị Măng

Quê quán: thị trấn Tịnh Biên, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang

ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây

Tác giả luận văn

Võ Huỳnh Phong

Chân thành biết ơn,

Anh Huỳnh Văn Nghi và các anh chị trong nhà lưới của bộ môn Bảo vệ Thực vật đã đóng góp ý kiến quý báu và tạo điều kiện cho em hoàn thành tốt thí nghiệm

Thành thật cảm ơn,

Các bạn lớp Bảo vệ Thực vật K36 đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài Chúc các bạn hạnh phúc, sức khỏe và thành đạt trong tương lai

Trân trọng !

Võ Huỳnh Phong

iv

Võ Huỳnh Phong 2014 “Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nhân nuôi

trên mật số và sức sống của chủng vi khuẩn Bacillus Amyloliquefaciens”

Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Đại học Cần Thơ, Cán bộ hướng dẫn TS Trần Vũ Phến

TÓM LƯỢC

Đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nhân nuôi trên mật số và sức

sống của chủng vi khuẩn Bacillus Amyloliquefaciens” được thực hiện từ

3/2013 đến tháng 3/2014 trong điều kiện phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng Đề tài được thực hiện với

mục tiêu khảo sát loại môi trường thích hợp để nhân nuôi vi khuẩn Bacillus

amyloliquefaciens đạt tối ưu về mật số và sự tạo nội bào tử phục vụ cho sản

xuất chế phẩm sinh học và tồn trữ chế phẩm ở các thí nghiệm tiếp theo

Thí nghiệm được thực hiện với chủng vi khuẩn Bacillus

amyloliquefaciens được cung cấp bới phòng thí nghiệm Phòng trừ sinh học,

Bộ môn Bảo vệ Thực vật

Thí nghiệm 1 được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lặp lại với 8 nghiệm thức là các loại môi trường khác nhau như: dịch trích khoai tây, dịch trích khoai mì, dịch trích khoai lang, dịch trích bã đậu nành, khoai tây, khoai mì, khoai lang và môi trường King’s B làm đối chứng Kết quả cho thấy môi trường khoai mì đạt được mật số vi khuẩn cao nhất so với các nghiệm thức còn lại sau 6 ngày khảo sát với mật số 3,37 x109 CFU/ml Tỷ lệ nội bào

tử cao nhất kể từ ngày đầu tiên thí nghiệm là 11,30% và đến ngày thứ 6 thì đạt 100%

Thí nghiệm 2, khảo sát hiệu quả đối kháng đối với nấm Fusarium

oxysporum, nấm Sclerotium rolfsii và vi khuẩn Ralstonia solanacearum của 3

nghiệm thức là các chế phẩm Bacillus amyloliquefaciens ở các tỷ lệ nội bào tử

khác nhau (5%, 50%, 100%), thí nghiệm được lặp lại 4 lần Kết quả ghi nhận,

vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens duy trì được sức sống trong chế phẩm

dạng bột sau 3 tháng tồn trữ, chế phẩm với tỷ lệ nội bào tử 100% có mật số và

hiệu quả đối kháng đối với nấm F oxysporum, nấm S rolfsii và vi khuẩn R

solanacearum vẫn được duy trì khá ổn định

MỤC LỤC

LƯỢC SỬ CÁ NHÂN i

LỜI CAM ĐOAN ii

LỜI CẢM TẠ iii

TÓM LƯỢC iv

GIỚI THIỆU 1

CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

1.1 Một số đặc điểm của vi khuẩn thuộc chi Bacillus 2

1.1.Nghiên cứu việc sử dụng Bacillus sp trong phòng trừ sinh học bệnh cây 4

1.3.1 Bệnh héo rủ gốc mốc trắng (Sclerotium rolfsii Sacc.) 6

1.3.2 Bệnh héo xanh vi khuẩn hại cà chua, khoai tây 7

1.3.3 Bệnh héo vàng do Fusarium sp 8

1.4 Dinh dưỡng và môi trường nuôi cấy vi khuẩn 9

1.4.1 Thành phần tế bào vi khuẩn 9

1.4.2 Nhu cầu dinh dưỡng và môi trường nuôi cấy vi khuẩn 9

1.5 Sinh trưởng của vi khuẩn 13

1.5.1 Yếu tố sinh trưởng 13

1.5.2 Sự tăng trưởng của vi khuẩn 14

1.5.3 Điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng đến sinh trưởng vi khuẩn 15

1.6 Sự thành lập và “nảy mầm” của nội bào tử vi khuẩn 18

1.7 Một số hợp chất trong công thức tồn trữ vi khuẩn 20

1.8 Một số kết quả nghiên cứu về môi trường nhân nuôi vi khuẩn và tồn trữ vi khuẩn 21

1.8.1 Những kết quả nghiên cứu về môi trường nhân nuôi vi khuẩn 21

1.8.2 Những kết quả nghiên cứu về tồn trữ vi khuẩn 22

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 24

2.1 PHƯƠNG TIỆN 24

2.2 PHƯƠNG PHÁP 24

2.2.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng nhân mật số và tạo nội bào tử của chủng vi khuẩn PGPR1 trong các loại môi trường khác nhau 24

2.2.1.1 Chuẩn bị 24

2.2.1.2 Tiến hành 27

2.2.1.3 Chỉ tiêu theo dõi 27

2.2.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi lên thời gian lưu tồn trong chế phẩm dạng bột của chủng vi khuẩn PGPR1 28

2.2.2.1 Thí nghiệm 2.1: Đánh giá ảnh hưởng của thời gian tồn trữ trên sức sống của chủng vi khuẩn PGPR1 trong chế phẩm 28

2.2.2.1.1 Chuẩn bị 28

2.2.2.1.2 Tiến hành 28

2.2.2.1.3 Chỉ tiêu theo dõi 29

2.2.2.2 Thí nghiệm 2.2: Khảo sát hiệu quả đối kháng của chế phẩm đối với nấm F oxysporum, nấm S rolfsii và vi khuẩn R solanacearum 29

2.2.2.2.1 Khảo sát hiệu quả đối khángcủa chế phẩm đối với nấm Fusarium oxysporum và nấm Sclerotium rolfsii 29

2.2.2.2.2 Khảo sát hiệu quả đối kháng của chế phẩm đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum 30

2.2.2.2.3 Chỉ tiêu theo dõi 31

2.2.3 Phân tích số liệu 32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy khác nhau lên sự phát triển mật số và hình thành nội bào tử của chủng vi khuẩn PGPR1 34

3.1.1 Sự tăng trưởng của chủng vi khuẩn PGPR1 ở các nghiệm thức môi trường nuôi cấy khác nhau qua thời điểm quan sát 34

3.1.2 Tỉ lệ nội bào tử/tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn PGPR1 diễn biến theo thời gian 37

3.2 Hiệu quả đối kháng của chế phẩm đối với nấm F oxysporum, S rolfsii

và vi khuẩn R solanacearum 42

3.2.1 Hiệu quả đối kháng của chế phẩm đối với nấm F oxysporum 42

3.2.2 Hiệu quả đối kháng của các loại chế phẩm sinh học đối với nấm Sclerotium rolfsii 45

3.3 Khảo sát khả năng sinh trường của chủng vi khuẩn PGPR1 trong các loại chế phẩm sau 3 tháng tồn trữ 49

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 52

4.1 KẾT LUẬN 52

4.2 ĐỀ XUẤT 52

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

CFU/ml Mật số vi khuẩn sống trên 1 ml

PGPR Vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng

DANH SÁCH BẢNG

3.1 Mật số vi khuẩn PGPR1 ở các nghiệm thức môi trường nuôi cấy

3.2 Mật số vi khuẩn PGPR1 theo thời điểm khảo sát ở từng nghiệm

3.3 Tỉ lệ nội bào tử/tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn PGPR1 ở các

nghiệm thức môi trường nuôi cấy khác nhau qua thời điểm quan

3.4 Tỉ lệ nội bào tử/tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn PGPR1 ở các

nghiệm thức môi trường nuôi cấy khác nhau qua thời điểm quan

3.5 Bán kính nấm Fusarium oxysporum bị ức chế bởi bởi các chế

phẩm chứa tỷ lệ nội bào tử khác nhau theo thời gian tồn trữ 43 3.6 Hiệu suất đối kháng của các chế phẩm chứa tỷ lệ nội bào tử khác

nhau đối với nấm Fusarium oxysporum theo thời gian tồn trữ 44 3.7 Bán kính vùng nấm Sclerotium rolfsii bị ức chế bởi bởi các chế

phẩm chứa tỷ lệ nội bào tử khác nhau theo thời gian tồn trữ 46 3.8 Hiệu suất đối kháng của các chế phẩm chứa tỷ lệ nội bào tử khác

nhau đối với nấm Sclerotium rolfsii theo thời gian tồn trữ 47 3.9 Bán kính vành khăn vùng vi khuẩn R solanacearum bị ức chế

bởi bởi các chế phẩm có tỷ lệ nội bào tử khác nhau theo thời

3.10 Mật số vi khuẩn PGPR1 ở các nghiệm thức có tỷ lệ nội bào tử

3.11 Biến động của mật số vi khuẩn PGPR1 trong từng dạng chế

phẩm có tỷ lệ NBT khác nhau theo thời gian tồn trữ 50

2.3 Sơ đồ thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm đối với nấm Sclerotium

2.4 Sơ đồ thử nghiệm hiệu quả của các loại chế phẩm đối với vi

3.1 Nghiệm thức dịch trích khoai tây (A), dịch trích bã đậu nành (B),

dịch trích khoai lang (C), dịch trích khoai mì (D) 33

3.2 Nội bào tử (A) và mật số vi khuẩn của vi khuẩn PGPR1(B) ở tỷ lệ

nội bào tử 100% của môi trường khoai mì vào thời điểm 6 NSTN 39 3.3 Tủ sấy chế phẩm trước (A) và sau (B) khi đưa chế phẩm vào sấy 41

3.6 Chế phẩm PGPR1 với các tỷ lệ nội bào tử 5% (A), 50% (B),

GIỚI THIỆU

Việc phòng trị những bệnh do các tác nhân Fusarium spp và vi khuẩn

Ralstonia solanacearum trên cây trồng này thường rất khó khăn do chúng lưu

tồn rất hữu hiệu trong đất (Đỗ Tấn Dũng, 2001) Sử dụng thuốc hóa học trong phòng trị có thể để lại dư lượng thuốc bảo vệ thưc vật cho cây trồng hoặc ảnh hưởng đến sức khỏe người nông dân và người tiêu dùng, còn biện pháp canh tác thì tốn nhiều công, chi phí, thời gian và khó áp dụng cho các vùng chuyên canh (Lê Thị Thủy, 2000; Ngô Quang Vinh, 2004)

Chủng vi khuẩn vùng rễ Bacillus amyloliquefaciens (PGPR1) (Trần Vũ Phến và ctv., 2010), có khả năng kiểm soát bệnh do nấm Fusarium spp và vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên nhiều loại cây trồng như cà chua, ớt,

gừng…(Trần Vũ Phến và ctv., 2010; Trần Văn Nhã, 2011; Trần Thị Thúy Ái, 2011) và nhiều loại nấm, vi khuẩn gây bệnh trên nhiều loại cây trồng khác đang được nghiên cứu

Tuy nhiên việc ứng dụng vi khuẩn trong phòng trừ bệnh như một tác nhân sinh học chưa được áp dụng rộng rãi vì chưa có dạng chế phẩm phù hợp đáp ứng được nhu cầu sử dụng của thực tế Bên cạnh đó, thời gian tồn trữ của

các chế phẩm vẫn chưa đủ lâu để thương mại hóa (Vidhyasekaran et al., 1997; Bora et al., 2004; Dương Thị Nguyễn Quyên và ctv., 2007) Một trong các yêu

cầu đối với chế phẩm vi sinh khi thường mại hóa là thời gian sử dụng dài mà không giảm hiệu lực, có thể chống chịu với điều kiện ngoại cảnh (thời tiết, các hóa chất), an toàn, dễ sử dụng và giá thành sản phẩm thấp (Nelson, 2004) Cho nên việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến mật số và khả năng tạo nội bào

tử cao để góp phần vào quy trình sản xuất chế phẩm sinh họclà rất cần thiết

Từ đó, đề tài: “Ảnh hưởng của điều kiện nuôi nhân lên sự sinh trưởng

và sự hình thành nội bào tử của vi khuẩn PGPR1” được thực hiện nhằm tìm ra loại môi trường nuôi cấy phù hợp nhất để nhân nuôi vi khuẩn PGPR1 đạt tối

ưu về mật số và sự tạo nội bào tử phục vụ cho tồn trữ và sản xuất chế phẩm sinh học

CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU1.1 Một số đặc điểm của vi khuẩn thuộc chi Bacillus

Bacillus thường có dạng hình que với kích thước 1,0-1,2 x 3,0-5,0 µm,

gram dương, không có lớp capsule, hiếu khí Vi khuẩn nội bào tử có kích thước 1,0 x 1,5 µm (Cook and Baker, 1989) Khuẩn lạc của các vi khuẩn thuộc

chi Bacillus thường có màu hoặc không màu, mặt khuẩn lạc nhăn Trong môi

trường lỏng chúng tạo thành lớp nhăn, đục và lắng cặn (Dương Văn Điệu, 1989)

Bacillus amyloliquefaciens là vi khuẩn gram dương có dạng hình roi,

kích thước 0,7-0,9 x 1,83-3 µm, các tế bào thường kết thành chuỗi, các chiên mao được đính ở trung tâm hoặc hơi lệch tâm, nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng là 30 – 400C Tăng trưởng không xảy ra dưới 150C hoặc trên 500C

(Priest et al, 1987)

Đặc điểm sinh thái

Bacillus có những nét đặc trưng riêng biệt, phân bố rộng rãi trong đất, có

khả năng chịu đựng ở nhiệt độ cao, có thể phát triển nhanh trong môi trường lỏng và hình thành nội bào tử trong môi trường khắc nghiệt Vi khuẩn này được đánh giá hội tụ những tính năng căn bản trong việc ức chế bệnh cây trồng Chúng được xem như là những tác nhân sinh học an toàn và có tiềm

năng cao trong phòng trừ sinh học (Silo-suh et al., 1994)

pH của môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong sản xuất chitinase, phần lớn các vi khuẩn sản xuất chitinase mức tối đa ở mức trung

tính hoặc hơi acid (Ulhoa and Peberdy, 1991; Sharaf, 2005) Ngược lại, B

laterosporus mmL2270 sản xuất chitinase cao nhất ở pH 8.0 và không sản

xuất chitinase ở pH 4.0 tương tự như pH 9.0 ở mức tối ưu cho sản xuất

chitinase B pabuli K1 đã được báo cáo (Frandberg and Schnurer, 1994)

Đặc tính sinh sản và khả năng lưu tồn

Một số vi khuẩn ở cuối giai đoạn sinh trưởng, khi chất dinh dưỡng ở môi trường cạn kiệt và chất qua trao đổi độc hại quá nhiều, hoặc do có sự thay đổi đột ngột các điều kiện sinh trưởng có khả năng hình thành bào tử ở bên trong tế bào, được gọi là nội bào tử (endospores) Mỗi tế bào vi khuẩn chỉ tạo một nội bào tử nên loại bào tử này không phải là bào tử sinh sản, khác với các loại đính bào tử (conidiospores), bào tử túi (ascospores) hay bào tử đảm (basidiospores) ở nhiều loài nấm, chúng là những bào tử sinh sản vô tính hay hữu tính (Biền Văn Minh và ctv., 2006)

Chu trình sống của nhiều vi khuẩn thuộc chi Bacillus có khả năng hình

thành nội bào tử thường tồn tại dưới 2 dạng, tế bào sinh dưỡng để sinh sản nhân mật số và dạng nội bào tử để sống sót khi gặp điều kiện môi trường bất lợi Nội bào tử có thể tồn tại dưới tác động của các tác nhân diệt khuẩn bao gồm nhiệt độ cao (thậm chí 1000C), khô, bức xạ ion hóa, tia cực tím, hóa chất (chất khử trùng, kháng sinh), chất tẩy rửa và enzyme (Errington, 2003) Ở nhiệt độ 1000C nội bào tử của một loài Bacillus có thể chịu được từ 2,5 – 1200

phút (20 giờ) Những tế bào này rất bền vững với những chất sát trùng hoặc trạng thái khô Nội bào tử có thể tồn tại trong một thời gian dài cho đến khi điều kiện môi trường thuận lợi cho sự tăng trưởng (Phạm Văn Kim, 2000; Nguyễn Như Hiền, 2005)

Nội bào tử có khả năng chịu nhiệt do thành phần cấu tạo có hàm lượng calcium và dipicolinic acid cao, tạo thành calcium dipicolinate làm tế bào mất kiệt nước và không còn hoạt động biến dưỡng nữa; lớp vỏ ngoài và vỏ trong dầy, không thấm nước bảo vệ nội bào tử trước tác động của bức xạ và hóa chất (Cowan, 2013)

Vai trò của vi khuẩn Bacillus trong hệ sinh thái nông nghiệp

Vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên và đa dạng

về sinh thái Các loài thuộc chi Bacillus đã và đang trở thành những vi sinh vật

quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng (Ngô Tự Thành và ctv., 2009) Vi

khuẩn thuộc chi Bacillus có khả năng tiết các enzyme ngoại bào, trong đó có nhiều enzyme có khả năng thủy phân các phân tử hữu cơ, chính vì thế Bacillus

có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau (Gupta et al., 2002)

Vi khuẩn thuộc chi Bacillus được đánh giá hội tụ những tính năng căn bản cho việc ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp Trước hết, một số

Bacillus, như B subtilis, thuộc nhóm những vi sinh vật đã được nghiên cứu

và hiểu biết nhiều và được xác nhận tính an toàn, không gây bệnh, nói chung khi dùng làm tác nhân phòng trừ sinh học của chúng Mặc khác, các Bacillus

có khả năng tạo nội bào tử trong điều kiện môi trường không thuận lợi, nhờ đó

Bacillus có khả năng sống sót với các điều kiện khác nghiệt của môi trường, như nhiệt độ cao, pH ngoài khoảng thông thường, thiếu dưỡng chất hay

nước, (Cawoy et al., 2011)

Trong nuôi nhân công nghiệp, nội bào tử thường hình thành vào cuối giai đoạn nuôi nhân, do đó thuận lợi cho việc gia công các chế phẩm dạng bột

có tỷ lệ nội bào tử cao (Lolloo et al., 2010) Chế phẩm sinh học có tác nhân là

vi khuẩn tạo nội bào tử thường có thời gian hiệu quả qua tồn trữ lâu hơn so với các dạng sống khác Ngoài cơ chế sống sót dựa trên việc tạo nội bào tử, một số

Bacillus, còn có khả năng sống hiếm khí tùy ý, nên có thể sống sót trong điều

kiện oxy thấp, khi môi trường có thay đổi Bên cạnh đó, nhờ có roi nên các

Bacillus có thể di chuyển chủ động đến và định vị ở vùng rễ cây và phát huy

hiệu quả bảo vệ cây ở đây Với khả năng tác động trong phòng trừ sinh học và kích thích sinh trưởng thực vật theo nhiều cơ chế khác nhau, nhiều chủng

Bacillus được xem như là những tác nhân sinh học an toàn và có tiềm năng

cao trong phòng trừ sinh học (Silo-suh et al., 1998; Cawoy et al., 2011)

Một số loài thuộc chi Bacillus, trong đó B subtilis và B

amyloliquefaciens là hai loài được xem là có hiệu quả phòng trừ sinh học đối

với nhiều bệnh cây trồng có nguồn gốc từ đất (Leclere et al., 2005) hoặc các tác nhân gây bệnh sau thu hoạch (Kotan et al., 2009)

1.2.Nghiên cứu việc sử dụng Bacillus sp trong phòng trừ sinh học

bệnh cây

Bacillus spp đã được thử nghiệm trên một loạt các loại cây trồng khác

nhau và được xác định có triển vọng về khả năng phòng trừ sinh học bởi vì khả năng sản xuất nội bào tử giúp chúng có thể tồn tại được trong điều kiện

nhiệt và khô hạn Nghiên cứu của Broadbent et al., (1977) nhận thấy B

subtilis A13 có khả năng kiểm soát đối với Sclerotium rolfsii Khi thử nghiệm

B subtilis A13 trong điều kiện in vitro có khả năng ức chế một số tác nhân

gây bệnh và cải thiện sự phát triển của nhiều loài thực vật (Broadbent et

al.,1977) Khi sử dụng B subtilis A13 để xử lý hạt giống, nhận thấy nó làm

tăng năng suất của cà rốt 48%, yến mạch 33% (Merriman et al.,1974 trích dẫn bởi Weller, 1988) và đậu phộng lên đến 37% B subtilis A13 được sử dụng để

cải thiện sự phát triển của cây trồng như sản xuất auxin tạo điều kiện thuận lợi cho sự tăng trưởng và phát triển của đậu tương (Figueiredo, 2011), và ức chế các tác nhân gây bệnh có thể cũng bằng cách kích thích tăng trưởng thực vật

(Weller, 1988) Kết quả nghiên cứu của Monteiro et al.,(2005) cho thấy vi khuẩn Bacillus có khả năng sản xuất lipopeptide hoạt động chống lại

Xanthomonas campestris pv campestris

Ở Thái Lan, các nhà nghiên cứu đã thành công trong việc sử dụng vi

khuẩn đối kháng với nấm Rhizoctonia solani tác nhân gây bệnh đốm vằn trên lúa Ruộng lúa được phun vi khuẩn đối kháng (Pseudomonas sp và Bacillus

sp.) 3 lần trong mỗi vụ Vi khuẩn đối kháng này ức chế sự sinh sản ra hạch

nấm của R solani, sau 5 vụ phun vi khuẩn đối kháng liên tục, bệnh đốm vằn

đã giảm một cách đáng kể và giúp tăng năng suất so với đối chứng (Phạm Văn Kim, 2000)

Bacillus amyloliquefaciens

Đây là một trong những loài vi khuẩn có hiệu quả phòng trừ sinh học đối với nhiều loại bệnh cây trồng từ đất hoặc các tác nhân gây bệnh sau thu hoạch

(Kotan et al., 2009)

Bacillus amyloliquefaciens chủng RC-2 sản xuất ra các hợp chất kháng

nấm và ức chế sự phát triển của nấm Colletotrichum dematium gây bệnh thán thư trên dâu tằm, khi phun lên lá trước khi lây bệnh với C dematium sẽ ức chế

sự phát triển của vết bệnh (Yoshida et al., 2002)

Theo Park et al (2006) thì B amyloliquefaciens có tác dụng ức chế bệnh héo xanh vi khuẩn R solanacearum trên cà chua trong 4 tuần sau xử lý Trong

thí nghiệm này, vi khuẩn gây bệnh được chủng vào rễ cây cà chua 20 ngày tuổi và vi khuẩn được chủng trước đó 7 ngày, kết quả cho thấy vi khuẩn không chỉ ức chế bệnh héo xanh mà còn giúp gia tăng chiều cao cây

Nghiên cứu của Luz (2003), chứng minh vi khuẩn B amyloliquefaciens

cho kết quả cao với việc giúp cây lúa mì ở Brazil tăng năng suất từ 459 đến

594 kg/ha và có liên quan đến kích kháng, hạn chế sự gây hại của những vi sinh vật gây bệnh từ 17,3 đến 22,4%

Jetiyanon et al (2003) ghi nhận hổn hợp hai dòng vi khuẩn B

amyloliquefaciens IN937a và B pumilus IN937b, qua cơ chế kích kháng lưu

dẫn bảo vệ cây chống laị các bệnh trên cà chua do nấm Sclerotium rolfsii,

Colletotrichum gloeosporioides, và cả bệnh khảm do CMV Dòng B amyloliquefaciens EXTN-1 giúp kiểm soát bệnh thán thư do nấm

Colletotrichum orbiculare trên dưa leo (Park et al., 2001)

Còn ở Việt Nam, tại Trường Đại học Cần Thơ đã phân lập được 214 dòng vi khuẩn có bán kính vòng vô khuẩn từ 1 mm trở lên và trong 214 dòng này có 2 dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng đáng kể là

Pseudomonascepacia TG17, Bacillus sp TG19 với bán kính vòng vô khuẩn

theo thứ tự là 16,5 mm và 14,5 mm Và khi sử dụng hai nguồn vi khuẩn này kết hợp với ¼ liều Validacin phun 3 lần, lần đầu vào 45 ngày sau khi gieo, lần phun sau cách lần phun trước 5 hoặc 7 ngày thì có hiệu quả hạn chế bệnh đốm vằn tốt tương đương với nghiệm thức phun Validacin đủ liều (Phạm Văn Kim,

2000) Nguyễn Văn Chương (2007) đã thử nghiệm khả năng đối kháng đối với

nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von, ghi nhận dòng Bacillus sp TG19 có hiệu quả ức chế sự phát triển khuẩn ty của 41 dòng nấm Fusarium

moniliforme thu thập tại Đồng bằng sông Cửu Long Theo Trần Vũ Phến và

ctv (2008) cho thấy có thể dùng các chủng vi khuẩn vùng rễ thuộc chi

Bacillus để kiểm soát các bệnh héo xanh do vi khuẩn R solanacerum và bệnh

héo rủ do F oxysporum trên cà chua và ớt Các chủng vi khuẩn Bacillus

amilyliquefaciens và Brevibacillus brevis có khả năng kiểm soát bệnh héo

xanh do vi khuẩn R solanacerum và bệnh héo vàng do nấm Fusarium spp cả trong nhà lưới và ngoài đồng (Trần Vũ Phến và ctv tài liệu chưa công bố)

1.3 Sơ lược các loại nấm Fusarium sp., Sclerotium rolfsii và vi khuẩn Ralstonia solanacearum

1.3.1 Bệnh héo rủ gốc mốc trắng (Sclerotium rolfsii Sacc.)

Theo Vũ Triệu Mân (2007), cây bệnh héo rủ, xanh hoặc héo vàng Cổ rễ

và đoạn thân ngầm bị bệnh có vết màu nâu, thối mục, khô xác, nhổ cây dễ bị đứt gốc, trên gốc thân cây bệnh mọc lớp nấm trắng đâm tia lan rộng ra mặt đất, hình thành nhiều hạch nấm hình tròn như hạt cải màu trắng, về sau có màu

nâu hạt chè Theo khảo sát thấy ở Bắc bộ và Nghệ An do nấm Sclerotium

rolfsii Sacc gây ra

Ngoài ra, hiện tượng héo rủ, thối gốc lở cổ rễ trên đồng ruộng với nhiều

màu sắc khó phân biệt còn có thể do nấm Rhizoctonia đôi lúc còn gặp cả bệnh

do nấm Fusarium solani, F oxysporium hại ở gốc thân, cây héo rủ, lá vàng

(gọi là bệnh héo vàng)

Loại héo rủ gốc mốc trắng do Sclerotium rolfsii Sacc có sợi nấm trắng,

hạch non màu trắng, hạch già có màu nâu, tương đối tròn đồng đều, đường

kính 1 - 2 mm Nấm Sclerotium rolfsii là loài nấm đa thực, phạm vi ký chủ rất

rộng, phá hại ở trên nhiều loài cây khác nhau như thuốc lá, khoai tây, cà, đậu

đỗ, đay

Sợi nấm Sclerotium trực tiếp xâm nhập qua biểu bì, qua vết thương mà

phát triển thành đám sợi trắng ở cổ rễ, gốc thân làm mô bệnh thối mục, cây khô chết Trên đồng ruộng những loại nấm trên đều nhờ nước tưới, mưa gió

mà lan truyền

Bệnh phát sinh, phát triển trong điều kiện nhiệt độ tương đối cao, ẩm uớt, cây sinh trưởng kém Trên đất trồng độc canh, đất cát thô bệnh tương đối nặng hơn Riêng loại héo rủ gốc mốc đen, mốc trắng còn phát triển mạnh trên đất có nhiều chất hữu cơ, tàn dư cây chưa hoai mục

Bệnh xuất hiện trong suốt quá trình sinh trưởng của cây nhưng ở mỗi giai đoạn sinh trưởng mức độ bệnh khác nhau, các loại bệnh héo rủ phá hại cũng khác nhau Ở giai đoạn cây con phân cành phần lớn bị bệnh héo rủ gốc mốc đen và lở cổ rễ nhưng đến giai đoạn chớm hoa, củ non thì bị bệnh héo rủ nặng hơn nhiều, phần lớn là héo rủ gốc mốc trắng, nhất là đối với lạc xuân và lạc vụ thu, kể cả bệnh gây hại trên một số cây trồng khác như khoai tây, cà chua vụ thu đông và vụ xuân muộn

1.3.2 Bệnh héo xanh vi khuẩn hại cà chua, khoai tây

Ralstonia solanacearum

= Pseudomonas solanacearum (Smith) E.F Smith

= Burkholderia solanacearủm (E.F Smith) Yabuuchi

Theo Vũ Triệu Mân (2007), bệnh héo xanh vi khuẩn do P solanacearum

được Erwin Smith phát hiện đầu tiên trên cây họ cà ở Mỹ vào năm 1896 Cho đến nay, bệnh phổ biến rất rộng ở hầu hết các châu Á, Phi, Mỹ, Úc, bệnh bắt đầu xuất hiện ở châu Âu (Bỉ, Thụy Điển…) gây hại nghiêm trọng chủ yếu ở các nuớc vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới có khí hậu nóng, ẩm Bệnh gây hại trên

278 loài cây thuộc trên 44 họ thực vật khác nhau, trong đó đáng chú ý nhất là các cây có ý nghĩa kinh tế cao như cà chua, khoai tây, thuốc lá, ớt, cà, lạc, vừng, hồ tiêu, đậu tương, dâu tằm, chuối…

Bệnh gây thiệt hại kinh tế lớn, giảm năng suất từ 5 - 100% tuỳ theo loài cây, giống cây, vùng địa lý và nhiều yếu tố khác

Bệnh xuất hiện trên cây con và cây lớn ra hoa đến thu hoạch Khi cây còn non (khoai tây, lạc…) toàn bộ lá héo rủ nhanh chóng đột ngột, lá tái xanh

và cây khô chết Trên cây đã lớn thường dễ phát hiện trên đồng ruộng với các triệu chứng rõ rệt: một hai cành, nhánh có lá bị héo rủ xuống, tái xanh, sau 2 -

5 ngày toàn cây héo xanh, trên thân vỏ vẫn còn xanh hoặc xuất hiện những sọc nâu, vỏ thân phía gốc xù xì, thân vẫn rắn đặc Cắt ngang thân, cành nhìn rõ vòng bó mạch dẫn, mô xylem có màu nâu sẫm, bên trong bó mạch chứa đầy dịch nhờn vi khuẩn, ấn nhẹ vào đoạn cắt hoặc ngâm đoạn cắt thân có mạch dẫn màu nâu vào cốc nước có thể thấy dịch vi khuẩn ở trong chảy qua miệng cắt ra ngoài Đặc điểm này được coi là một cách chẩn đoán nhanh bệnh héo do

vi khuẩn Khi cây đã héo, nhổ lên thấy rễ bị thâm đen, thối hỏngđối với khoai tây, củ cũng nhiễm bệnh ở ngoài đồng cho tới kho bảo quản

Cắt đôi củ bệnh thấy các vòng mạch dẫn nâu đen có giọt dịch vi khuẩn màu trắng đục tiết ra trên bề mặt lát cắt bó mạch Đây là loại bệnh thuộc kiểu hại bó mạch xylem, tắc mạch dẫn gây hiện tuợng chết héo cây, dễ nhầm lẫn

với các bệnh héo do nấm hoặc các nguyên nhân khác gây ra song vẫn có thể phân biệt đuợc

Bệnh truyền lan từ cây này sang cây khác trên đồng ruộng nhờ nước tưới, nước mưa, gió bụi, đất bám dính ở các dụng cụ dùng để vun xới, chăm

sóc cây Vai trò của tuyến trùng bứu rễ Meloidogyne incognita và các loài

tuyến trùng khác hoạt động ở trong đất, tạo vết thương cho vi khuẩn lan truyền, lây bệnh hỗn hợp rất đáng chú ý để ngăn ngừa

Bệnh phát triển mạnh và nhanh trong điều kiện nhiệt độ cao, mưa gió, nhất là ở trên đất cát pha, thịt nhẹ hoặc đất đã nhiễm vi khuẩn, trồng các giống mẫn cảm với bệnh từ trủớc Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phát sinh phát triển của bệnh Nhiệt độ thích hợp nhất là lớn hơn 300C Triệu chứng xuất hiện rõ trên cây khi mà nhiệt độ ít nhất phải trên 200C và nhiệt độ đất phải > 140C, ẩm độ cao, tưới nhiều, tưới ngập rãnh đều là điều kiện tốt cho bệnh xâm nhiễm phát triển mạnh, truyền lan dễ dàng Đất khô ải hoặc ngâm nước dài ngày (luân canh lúa nước), bón phân đạm hữu cơ, phân hoai mục với lượng cao (thâm canh) đều có khả năng làm giảm bệnh

Nguồn bệnh vi khuẩn đầu tiên lưu truyền qua đất, tàn dư cây bệnh và củ giống (khoai tây…) Ở trong đất vi khuẩn có thể bảo tồn sức sống lâu dài tới 5

- 6 năm hoặc 6 - 7 tháng tuỳ thuộc vào ảnh huởng của nhiệt độ, độ ẩm, loại đất, các yếu tố sinh vật và các yếu tố khác

1.3.3 Bệnh héo vàng do Fusarium sp.

Theo Vũ Triệu Mân (2007), bệnh héo vàng do nấm Fusarium sp đuợc

mô tả đầu tiên bởi Masse G.E ở Anh vào năm 1895

Bệnh có khắp trên thế giới nhưng chủ yếu ở vùng nhiệt đới đặc biệt là ở Việt Nam

Cây con bị bệnh còi cọc, kém phát triển, sau bị chết Cây trưởng thành bị bệnh các lá phía dưới gốc thường biến vàng, ban đầu từ một lá chét của một bên cây, sau đó lan ra toàn cây; lá héo rủ, màu vàng, không bị rụng Vết bệnh

ở trên thân sát mặt đất hoặc cổ rễ màu nâu, vết bệnh lớn dần làm khô tóp cả đoạn thân sát mặt đất, bộ rễ phát triển kém, rễ bị thối dần Khi trời ẩm, trên mặt vết bệnh có lớp nấm màu hồng nhạt, chẻ dọc thân thấy bó mạch libe có màu nâu Cây bị bệnh ban ngày héo, ban đêm phục hồi, cây sinh trưởng kém Sau 1 tuần đến 1 tháng cây sẽ chết hoàn toàn

Nấm có 3 chủng sinh lý Chủng 1 phân bố rộng khắp thế giới; chủng 2 được tìm thấyở bang Ohio (1940), Florida (Mỹ), Australia, Brazil, Anh,

Mehico (1961); chủng 3 có ở Brazil, California và Florida (Mỹ), Bowen (Australia)

Bệnh phát triển ở nơi có thời tiết ấm, trên đất cát và đất chua Nấm tồn tại trong đất vài năm, nhiệt độ thích hợp là 280C Bệnh phát sinh phát triển mạnh vào tháng 4, 5 hại cà chua vụ đông xuân và xuân hè; bệnh xuất hiện ở tháng 9, 10 gây hại cà chua vụ đông sớm

Phân bón có ảnh huởng đến tính độc của nấm: tính độc của nấm tăng khi bón phân vi lượng, phân lân, đạm amôn; tính độc của nấm giảm khi bón đạm nitrat (Jones , 1993) Nấm truyền lan qua hạt giống, cây con bị nhiễm trước khi trồng hoặc do gió, nước, công cụ làm đất, v.v… Nấm có thể tồn tại trong

đất nhiều năm (Dhesi et al.,1968)

1.4 Dinh dưỡng và môi trường nuôi cấy vi khuẩn

tế bào Nước liên kết mất khả năng hoà tan và lưu động Muối khoáng chiếm khoảng 2 - 5 % khối lượng khô của tế bào Chúng thường tồn tại dưới các dạng muối sulfate, phosphate, carbonate, chloride Trong tế bào chúng thường

ở dạng các ion Các ion trong tế bào vi sinh vật luôn luôn tồn tại ở những tỷ lệ nhất định, nhằm duy trì độ pH và áp suất thẩm thấu thích hợp cho từng loại vi sinh vật

1.4.2 Nhu cầu dinh dưỡng và môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Thành phần hoá học của tế bào vi sinh vật quyết định nhu cầu dinh dưỡng của chúng Thành phần hoá học của các chất dinh dưỡng được cấu tạo

từ các nguyên tố C, H, O, N, các nguyên tố khoáng đa vi lượng Theo

Madigan et al., (1997), vai trò của các nhóm chất dinh dưỡng như sau:

- Nhóm nguyên tố đa lượng

Carbon, nitrogen, oxygen và hydrogen là các nguyên tố đa lượng vi khuẩn đòi hỏi với lượng lớn Carbon chiếm 50% trọng lượng khô của tế bào,

là nguyên tố chính cấu tạo nên các đại phân tử Nitrogen là nguyên tố quan

trọng thứ hai sau carbon trong tế bào vi khuẩn, nitrogen chiếm khoảng 12% trọng lượng khô Nitrogen là thành phần chính của protein, nucleic acid … Phần lớn vi khuẩn thích sử dụng đạm NH3 và cũng có thể sử dụng NO3-, còn

N2 chỉ sử dụng được bởi vi khuẩn cố định đạm Theo Biền Văn Minh và ctv.,

(2006) thì các hợp chất hữu cơ chứa cả C và N (pepton, nước thịt, nước chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch, nước chiết giá đậu, ) có thể

sử dụng vừa làm nguồn C vừa làm nguồn N đối với vi sinh vật Trong công nghiệp lên men, rỉ đường là nguồn carbon rẻ tiền và rất thích hợp cho sự phát triển của nhiều loại vi sinh vật khác nhau Oxygen và hydro được vi sinh vật lấy từ nước, các hợp chất vô cơ và hữu cơ có hydro và oxygen

Ngoài 4 nguyên tố C, H, O, N, các nguyên tố đa lượng khác cũng rất cần cho sự tăng trưởng của vi khuẩn như P, S, K,… P cần cho vi khuẩn để tổng hợp nucleic acid và phospholipids S giữ vai trò quan trọng trong cấu trúc amino acid, cystein, biotine, lipoic acid và cả coenzyme A K rất cần thiết cho tất cả vi sinh vật vì K cần thiết cho hầu hết các enzyme đặc biệt là các enzyme

có liên quan trong quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn Mg giữ chức năng

ổn định ribosome, màng tế bào, nucleic acid và cần cho hoạt động của enzyme Ca không cần thiết nhiều cho sự phát triển của vi sinh vật Ca giúp ổn định vách tế bào và đóng vai trò ổn định nhiệt của endospore của tế bào vi khuẩn Na cần thiết cho một số vi khuẩn và nhu cầu về Na thường liên quan với sự thích nghi của vi sinh vật đó trong môi trường sống, như trong môi trường nước biển, hàm lượng Na cao nên các vi sinh vật biển thường đòi hỏi cho sự phát triển, trong khi ở môi trường nước ngọt các loài vi sinh vật vẫn có thể phát triển trong sự vắng mặt của Na Fe tuy được xem là nguyên tố vi lượng nhưng sắt được yêu cầu nhiều hơn các nguyên tố kim loại khác bởi vi sinh vật Fe có vai trò chính trong hô hấp của tế bào, là thành phần nồng cốt của các sắc tố và các protein liên kết với lưu huỳnh có liên quan trong quá trình vận chuyển điện tử Tuy nhiên phần lớn các sắt vô cơ trong tự nhiên thường ít hòa tan nên vi sinh vật lấy sắt bằng cách tiết ra các gốc thích sắt (siderophores) có tác dụng hòa tan các muối sắt và vận chuyển vào trong tế bào Những gốc thích sắt này là dẫn xuất của các phức chất màu và có sự ái lực cao đối với sắt

- Nhóm nguyên tố vi lượng

Các nguyên tố vi lượng là các kim loại như Cr, Co, Cu, Mn, Mo, Ni, Se,

Zn, … Tuy vi sinh vật chỉ yêu cầu các nguyên tố này với số lượng nhỏ nhưng các nguyên tố này giữ vai trò rất quan trọng như các nguyên tố đa lượng Nhiều loại đóng vai trò trong cấu trúc của nhiều loại enzyme Do yêu cầu của

vi sinh vật thấp nên trong nuôi cấy vi sinh vật không cần thiết bổ sung thêm

các nguyên tố vi lượng vào trong môi trường, ngoại trừ trường hợp nước cất

và hóa chất sử dụng quá tinh khiết không chứa khoáng

- Các chất hổ trợ tăng trưởng

Các chất hổ trợ tăng trưởng là những phức hợp hữu cơ như vitamin, amino acid, purine và pyrimidine,… Giống như các nguyên tố vi lượng, vi khuẩn yêu cầu chúng với lượng rất thấp Mặc dù hầu hết vi sinh vật có thể tổng hợp tất cả các phức chất này, tuy nhiên một số loài vi sinh vật vẫn cần được bổ sung nhân tố này từ bên ngoài

- Môi trường nuôi cấy

Trong nuôi cấy vi sinh vật có hai loại môi trường chính: loại môi trường

có thành phần hóa học xác định và loại môi trường có thành phần hóa học không xác định, mỗi loại đều có những ưu khuyết điểm Ở môi trường có hàm lượng hóa chất xác định có ưu điểm là giúp xác định được các thành phần dinh dưỡng mà vi sinh vật cần cũng như biết được hóa chất ức chế sự phát triển của chúng, tuy nhiên môi trường này thường đắt tiền Còn ở môi trường có thành phần hóa chất không xác định như môi trường sữa, thịt bò, đậu nành,… có thuận lợi là dễ thực hiện vì nguồn nguyên liệu dễ tìm trong tự nhiên, rẻ tiền, tuy nhiên do không có thành phần hóa chất xác định nên khó khăn trong các nghiên cứu sâu về yêu cầu dinh dưỡng chi tiết của vi sinh vật

Ở mỗi loại vi sinh vật khác nhau có sự khác biệt nhau về yêu cầu dinh dưỡng rất lớn, một môi trường nuôi cấy nào đó thích hợp cho sự phát triển của

vi sinh vật này nhưng lại không thích hợp cho vi sinh vật khác Nên việc tìm

ra môi trường nuôi cấy tốt cho vi sinh vật đòi hỏi phải biết được nhu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật đó và cung cấp cho chúng trong môi trường nuôi cấy Hiện nay, môi trường King’s B là môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường nhất và thích hợp cho sự tạo sắc tố huỳnh quang Tuy nhiên, không phải tất cả các vi sinh vật đều tạo huỳnh quang trên môt trường này (Madigan

at al, 1997)

Thành phần dinh dưỡng của một số loại vật liệu sử dụng trong các công thức môi trường thí nghiệm (Lã Văn Kính, 2003)

Thành phần dinh dưỡng của khoai tây tươi: (Tính theo trạng thái thức ăn)

Vật chất

khô

(%)

Protein thô (%)

Béo thô (%) Xơ thô(%)

ADF (%)

NDF (%)

NFE

(%)

Đường TS (%) Khoáng TS (%)

Ca (%)

P (%)

Muối (%)

Béo thô (%)

Xơ thô(%) ADF

(%)

NDF (%)

NFE

(%)

Đường TS (%)

Khoáng

TS (%)

Ca (%)

P (%)

Muối (%)

Béo thô (%) Xơ thô(%)

ADF (%)

NDF (%)

NFE

(%)

Đường TS (%) Khoáng TS (%)

Ca (%)

P (%)

Muối (%)

Thành phần dinh dưỡng của bã bia tươi: (Tính theo trạng thái thức ăn)

Vật chất

khô

(%)

Protein thô (%)

Béo thô (%) Xơ thô(%)

ADF (%)

NDF (%)

NFE

(%)

Đường TS (%)

Khoáng

TS (%)

Ca (%)

P (%)

Muối (%)

Béo thô (%) Xơ thô(%)

ADF (%)

NDF (%)

NFE

(%)

Đường TS (%)

Khoáng

TS (%)

Ca (%)

P (%)

Muối (%)

* NFE (Nitrogen free extractives): Dẫn xuất không đạm hoặc chất chiết không Nitrogen

1.5 Sinh trưởng của vi khuẩn

1.5.1 Yếu tố sinh trưởng

Theo Biền Văn Minh và ctv., (2006) thì:

Đối với vi sinh vật thì yếu tố sinh trưởng là một khái niệm rất linh động

Nó chỉ có ý nghĩa là những chất hữu cơ cần thiết đối với hoạt động sống mà một loại vi sinh vật nào đó không tự tổng hợp được từ các chất khác Những chất được coi là yếu tố sinh trưởng của loài vi sinh vật này hoàn toàn có thể không phải là yếu tố sinh trưởng đối với một loại vi sinh vật khác Hầu như không có chất nào là yếu tố sinh trưởng chung đối với tất cả các loài vi sinh vật

Đặc điểm của môi trường sống có ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp yếu

tố sinh trưởng của vi sinh vật, mặt khác ảnh hưởng đến đặc điểm trao đổi chất của chúng Chính thông qua các ảnh hưởng này mà môi trường sống của từng

loại vi sinh vật đã góp phần quyết định nhu cầu của chúng về yếu tố sinh trưởng Khi sống lâu dài trong các môi trường thiếu yếu tố sinh trưởng, vi sinh vật sẽ dần dần tạo ra được khả năng tự tổng hợp yếu tố sinh trưởng mà chúng cần thiết

Cùng một loài vi sinh vật nhưng nếu nuôi cấy trong các điều kiện khác nhau cũng có thể có những nhu cầu khác nhau về yếu tố sinh trưởng Chẳng

hạn nấm mốc Mucor rouxii được chứng minh là chỉ cần biotine và thiamine

khi phát triển trong điều kiện kị khí Khi nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí, chúng sẽ tự tổng hợp ra được yếu tố sinh trưởng này

Sự có mặt của một số chất dinh dưỡng khác có khi cũng ảnh hưởng đến nhu cầu về yếu tố sinh trưởng của vi sinh vật Chẳng hạn việc đòi hỏi pantotenic acid của một số vi sinh vật (ví dụ vi khuẩn bạch hầu

Corynebacterium diphtheriae) có thể thỏa mãn khi chỉ cần cung cấp cho

chúng  - alanine, chúng có thể tự tổng hợp được pantoic acid (pantotenic acid cấu tạo từ pantoic acid và  - alanine)

- Thông thường các chất được coi là yếu tố sinh trưởng đối với một loài nào đó có thể thuộc về một trong các loại sau đây: các gốc kiềm purine, pirimidine và các dẫn xuất của chúng, các acid béo và thành phần của màng tế bào, các vitamin thông thường

1.5.2 Sự tăng trưởng của vi khuẩn

* Sinh trưởng của vi khuẩn trong nuôi tĩnh

Theo Biền Văn Minh và ctv (2006) thì nuôi cấy tĩnh là phương pháp

nuôi cấy mà trong suốt thời gian đó ta không thêm vào hay lấy đi bất kì chất gì vào trong môi trường nuôi cấy Sự sinh trưởng của vi khuẩn trong “hệ kín” như vậy tuân theo những quy luật bắt buộc không những đối với các cơ thể đơn bào mà cả đối với các cơ thể đa bào

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của logarit số lượng tế bào theo thời gian gọi là đường cong sinh trưởng:

Hình 2.1: Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn 0

n bị

GĐ tăng trưởng nhảy vọt

GĐ ổn

đoạn chết

Log 1

0

mật

số

Theo Phạm Văn Kim (2000) thì trong một mẻ nuôi cấy thích hợp, vi khuẩn thường tăng trưởng theo 4 giai đoạn chính:

Giai đoạn chuẩn bị (latent phase): trong giai đoạn này, tức là ngay sau khi nuôi cấy, vi khuẩn chưa tăng mật số, có thể đây là giai đoạn vi sinh vật làm quen với môi trường nuôi cấy mới và chuẩn bị cho sự tăng trưởng vượt bậc sau đó

Giai đoạn tăng trưởng nhảy vọt (logarithmic phase, exponential phase): ở giai đoạn này vi khuẩn bắt đầu nhân mật số lên với tốc độ rất nhanh theo cấp

số nhân Trong giai đoạn này mật số tổng cộng và mật số vi khuẩn sống không chênh lệch nhau nhiều vì trong giai đoạn này còn nhiều chất dinh dưỡng cung ứng đủ nhu cầu, nên số vi khuẩn chết chưa tăng cao

Giai đoạn ổn định (stationary phase): đây là giai đoạn mà mật số vi sinh vật không tăng thêm mà giữ an định ở một mức Lúc này mật số vi khuẩn chết

có tăng nên mật số tổng cộng đã chênh lệch so với mật số vi sinh vật sống Giai đoạn này có thể do vi khuẩn thu hút và làm cạn dần một vài thành phần dinh dưỡng hoặc là do tác động của vài chất đối kháng do chính vi khuẩn ấy tiết ra trong quá trình tăng trưởng

Giai đoạn chết (death phase): mật số vi sinh vật sống giảm dần trong khi

đó mật số vi khuẩn tổng cộng có hơi tăng nhẹ Đây là giai đoạn trùng hợp vào lúc mà dưỡng chất trong môi trường bị hao mòn dần hoặc do sự tích lũy các chất đối kháng ngày càng nhiều

* Sinh trưởng của vi khuẩn trong nuôi liên tục

Trong phương pháp nuôi cấy tĩnh, các điều kiện môi trường luôn luôn thay đổi theo thời gian, mật độ vi khuẩn tăng lên còn nồng độ cơ chất giảm xuống Vi khuẩn phải sinh trưởng và phát triển theo một số giai đoạn nhất định, sinh khối đạt được không cao Tuy nhiên trong nhiều nghiên cứu và thực tiễn sản xuất ta cần cung cấp cho vi sinh vật những điều kiện ổn định để trong một thời gian dài chúng vẫn có thể sinh trưởng trong giai đoạn tăng trưởng nhảy vọt (pha log) Trong một mức độ nào đó có thể cấy chuyền tế bào nhiều lần (qua những khoảng thời gian ngắn) vào môi trường dinh dưỡng mới Nhưng đơn giản hơn, người ta đưa môi trường dinh dưỡng mới vào bình nuôi cấy vi khuẩn đồng thời loại khỏi bình một lượng tương ứng dịch vi khuẩn Đây chính là cơ sở của phương pháp nuôi cấy liên tục trong chemostas và

turbidostas (thiết bị nuôi cấy liên tục) (Biền Văn Minh và ctv., 2006)

1.5.3 Điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng đến sinh trưởng vi khuẩn

* Cơ chế tác dụng của các yếu tố bên ngoài lên vi khuẩn

Tác dụng có hại của các yếu tố bên ngoài tế bào thể hiện chủ yếu ở

những biến đổi sau đây (Biền Văn Minh và ctv., 2006):

Phá hủy thành tế bào: một số chất nhưenzyme lysozyme (chứa trong lá

lách, bạch cầu, lòng trắng trứng, đuôi thực khuẩn thể ) có khả năng phân huỷ thành tế bào vi khuẩn dẫn đến tạo thành các nguyên lạp chủ yếu ở vi khuẩn Gram dương và các cầu lạp ở vi khuẩn Gram âm

Biến đổi tính thấm của màng tế bào chất: một số chất không nhất thiết

phải xâm nhập tế bào, nhưng vẫn gây tác dụng kháng khuẩn Do tác dụng lên một hoặc một chức phận sinh lí của màng tế bào, chất này sẽ làm vi khuẩn mất khả năng sinh sản Rất có thể, trong trường hợp như vậy, hàng rào thẩm thấu tồn tại trong màng tế bào chất đã bị hư hại

Thay đổi đặc tính keo của nguyên sinh chất: các yếu tố vật lí cũng như

hóa học đều có thể gây nên tác dụng này Nhiệt độ cao làm biến tính protein

và làm chúng đông tụ do nhiệt có thể làm mất nước tế bào vi sinh vật

Kìm hãm hoạt tính: một số chất tác động vào các hệ thống sinh năng

lượng của tế bào, cyanite kìm hãm cytochrome - oxydase, fluoride ngăn cản quá trình đường phân, các hợp chất hoá trị ba của arcsenic bao vây chu trình Krebs, dinitrophenol kìm hãm quá trình phosphoryl hoá oxy hóa

Hủy hoại các quá trình tổng hợp: trong sự có mặt của một số chất tương

tự về mặt cấu trúc với các chất trao đổi tự nhiên, gọi là các chất kháng sự trao đổi chất (antimetabolism), quá trình sinh tổng hợp có thể bị ức chế

* Các nhân tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn

Yếu tố vật lý

Theo Biền Văn Minh và ctv (2006) thì hầu hết tế bào sinh dưỡng của vi

sinh vật bị chết ở nhiệt độ cao do protein bị biến tính, một hoặc hàng loạt enzyme bị bất hoạt Các enzyme hô hấp đặc biệt là các enzyme trong chu trình Krebs rất mẫn cảm với nhiệt độ Sự chết của vi khuẩn ở nhiệt độ cao cũng có thể còn là hậu quả của sự bất hoạt hóa ARN và sự phá hoại màng tế bào chất Còn khi nhiệt độ thấp sự tăng trưởng sẽ ngưng lại do tế bào chất từ dạng lỏng

bị ngưng tụ lại làm quá trình trao đổi ion và hoạt động của enzyme trong tế bào bị đình chỉ, nên sự tăng trưởng của vi sinh vật bị ngừng lại Khoảng nhiệt

độ tối đa của nhóm vi khuẩn lam (cyanobacteria) là 70 – 74oC, vi khuẩn

quang dưỡng kị khí (anoxygenicphototrophic bacteria) là 70 – 73oC và nhóm

vi khuẩn hóa dưỡng hữu cơ (chemoorganotrophic bacteria) là 90oC (Madigan

at al, 1997)

Ngoài ra, các yếu tố áp suất, ánh sáng, âm thanh cũng có tác động không nhỏ đến việc sinh trưởng và sinh sản của vi khuẩn Nếu các yếu tố này bất thuận thì mật số của mẻ nuôi cấy có thể bị ảnh hưởng (Phạm Văn Kim, 2000;

Biền Văn Minh và ctv., 2006)

Yếu tố hóa học

Ảnh hưởng của pH môi trường: pH của môi trường có ý nghĩa quyết định đối với sinh trưởng của nhiều vi sinh vật Các ion H+ và OH- là hai ion hoạt động cao nhất trong các các ion, những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của chúng cũng có tác động mạnh mẽ Cho nên việc xác định pH thích hợp ban đầu và duy trì pH cần thiết trong thời gian sinh trưởng của tế bào là rất quan trọng

Các giá trị pH (cực tiểu, tối thích, cực đại) cần cho sinh trưởng và sinh sản của vi khuẩn tương ứng với các giá trị pH trung bình cần cho hoạt động của nhiều enzyme Giới hạn pH hoạt động đối với vi sinh vật ở trong khoảng 4

- 10 Đa số vi khuẩn sinh trưởng tốt nhất ở pH trủng tính (7,0) như nhiều vi khuẩn gây bệnh (môi trường tự nhiên là máu và bạch huyết của cơ thể động vật có pH khoảng 7,4) Các vi khuẩn nitrate hóa, vi khuẩn nốt sần, xạ khuẩn,

vi khuẩn phân giải urea lại ưa môi trường hơi kiềm Một số vi khuẩn chịu acid

(vi khuẩn lactic, Acetobacter, Sarcina ventriculi), một số khác ưa acid như

Acetobacter acidophilus, Thiobacillus thiooxydans (oxy hóa lưu huỳnh thành

H2SO4) có thể sinh trưởng ở pH <1 (Biền Văn Minh và ctv., 2006) Trong quá

trình đồng hóa của vi khuẩn thường tiết ra hay bazơ làm thay đổi pH của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng bất lợi đến sự phát triển của vi khuẩn Do đó trong điều kiện nuôi cấy, chất đệm như K2HPO4, Na2HPO4 thưởng được bổ sung để

giúp ổn định pH của môi trường (Madigan et al, 1997)

Oxygen cũng là yếu tố quan trọng cho sự phát triển của vi sinh vật, đây cũng là yếu tố để phân chia vi sinh vật thành vi sinh vật hiếu khí bắt buộc,

hiếu khí không bắt buộc, vi hiếu khí và kỵ khí (Biền Văn Minh và ctv., 2006)

Yếu tố sinh học

Chất kháng sinh có thể có từ nhiều nguồn gốc khác nhau như tổng hợp hoá học, chiếc xuất từ thực vật, động vật nhưng chủ yếu là được tổng hợp từ vi sinh vật Đây là các chất đặc hiệu mà ở nồng độ thấp cũng có khả năng ức chế

hoặc tiêu diệt vi sinh vật một cách chọn lọc (Biền Văn Minh và ctv., 2006)

1.6 Sự thành lập và “nảy mầm” của nội bào tử vi khuẩn

Các loài vi khuẩn có khả năng hình thành nội bào tử thường thuộc các chi Bacillus, Clostridium, Sporolactobacillus, Thermoactinomyces, Sporosarcina, Desulfotomaculum,

Sự thành lập và đặc điểm cấu tạo của nội bào tử

Sự khởi tạo nội bào tử ở vi khuẩn được gợi bởi nhiều tác nhân liên quan đến các điều kiện sinh trưởng bất lợi, bao gồm sự tích tụ các nhân tố ức chế

sinh dưỡng (Kim và Gadd, 2008, Moat et al, 2002) Nhiều nhân tố môi trường

khác có ảnh hưởng trên sự hình thành nội bào tử được ghi nhận, như nhiệt độ sinh trưởng, pH môi trường, điều kiện thoáng khí, sự hiện diện của một số khoáng, nguồn carbon, nitrogen và phosphorus và nồng độ của chúng, nhưng hai nhân tố môi trường có vai trò đặc biệt quan trọng được xác định là sự thiếu hụt dưỡng chất và mật số quần thể (Logan and Halket, 2011) Tình trạng thiếu hụt dưỡng chất, đặc biệt khi nguồn carbon hoặc nitrogen đầy đủ, là tác nhân

kích thích tế bào sinh dưỡng chuyển sang dạng nội bào tử

Sự tạo nội bào tử dễ dàng hơn khi mật số vi khuẩn cao và điều kiện là tế

bào vi khuẩn phải ở một giai đoạn nào đó của chu trình sinh trưởng (Moat et

al, 2002) Ở hầu hết các loài, tiến trình từ khi tế bào sinh dưỡng nhận biết điều

kiện kích thích, cần thời gian 6-8 giờ (Cowan, 2013) Thởi gian để hình thành

nội bào tử từ tế bào sinh dưỡng cần khoảng 10 giờ ở loài Bacillus megaterium (Willey et al, 2011)

Sự hình thành nội bào tử là kết quả của tiến trình điều hòa phức tạp, trải qua nhiều giai đoạn, bao gồm sự dẫn truyền các tín hiệu từ môi trường và các nhân tố sinh lý và được điều khiển bởi một loạt phospho transfer (phosphorelay), giúp hoạt hóa các gen liên quan đến việc tạo nội bào tử và ức chế các gen liên quan đến tăng trưởng sinh dưỡng (Kim và Gadd, 2008, Moat

et al, 2002) Sự hình thành nội bào tử bắt đầu từ sự phân chia bất đối xứng tế

bào thành 2 phần không bằng nhau (phần nhỏ hơn được gọi là prespore và phần lớn được gọi là tế bào mẹ) Sau đó, tế bào mẹ sử dụng tất cả các nguồn chất dinh dưỡng và thành phần của tế bào mẹ để hình thành lớp vỏ rắn chắc có thể bảo vệ prespore, do đó tối đa hóa cơ hội sống sót cho các nội bào tử trưởng thành (Errington, 2003)

- Đặc điểm cấu tạo của nội bào tử:

Cấu trúc của nội bào tử gồm nhiều lớp màng bao bọc, tính không thấm của các lớp màng nên các chất hóa học, chất sát trùng khó tác động

Thành phần hóa học của nội bào tử gồm: Các lớp bao và màng của nội bào tử cấu tạo bởi protein, gồm nhiều amin chứa lưu huỳnh như: glyxin, tirozin, xistin, ngoài ra còn có keratin Cấu tạo của nội bào tử có liên quan đến sức chống chịu với sự tác động của điều kiện ngoại cảnh của nội bào tử (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 1979; Nguyễn Xuân Thành và ctv., 2006):

Nước phần lớn ở trạng thái liên kết nên không có khả năng làm biến tính protein khi tăng nhiệt độ Trong bào tử có chứa ion Ca2+ và dipicolinit acid, các protein sẽ kết hợp với dipicolinat calcium tạo thành phức chất có tính ổn định cao với nhiệt độ Các enzyme ở trạng thái không hoạt động nên hạn chế được sự trao đổi chất của nội bào tử với môi trường ngoài Sự có mặt của các amin chứa lưu huỳnh giúp nội bào tử đề kháng mạnh với tia cực tím

- Sự “nẩy mầm” của nội bào tử:

Thời gian vi khuẩn tồn tại bất hoạt dưới dạng nội bào tử thường rất lâu, cho đến khi điều kiện môi trường thuận lợi hơn cho sự tăng trưởng như có đủ nước và có tác nhân kích thích hóa học hay môi trường giúp nảy mầm, khi đó nội bào tử trải qua tiến trình chuyển thành tế bào sinh dưỡng (Cowan, 2013) Kết quả của tiến trình này là lớp vỏ bào tử bị phá và n65i bào tử vi khuẩn được chuyển thành dạng tế bào sinh dưỡng để tăng trưởng và sinh sản bình thường (Nguyễn Như Hiền, 2005)

Sự chuyển thành tế bào sinh dưỡng từ nội bào tử thường gồm 3 giai đoạn chính: hoạt hóa, nảy mầm và tăng sinh, trong đó nếu không có tác động hoạt hóa nội bào tử có thể không hoạt động, ngay cả khi dinh dưỡng đầy đủ

(Willey et al, 2011) Tiến trình hoạt hóa, chuẩn bị cho nội bào tử nảy mầm,

thường có liên quan đến vai trò tác động của nhiệt Các khảo sát về ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự chuyển hóa từ nội bào tử thành tế bào sinh dưỡng, cho thấy nhiệt độ kích hoạt thường là 65oC trong 45 phút, 34oC trong 48 giờ và sự hoạt hóa nầy là thuận nghịch Ở nhiệt độ 30oC sự hoạt hoá nội bào tử nảy mầm cũng được ghi nhận và trong thực tế nhiệt độ nầy dễ dàng xảy ra trong đất hoặc đống chất hữu cơ đang phân hũy (Keynan et al 1964)

Trong tự nhiên, nội bào tử nảy mầm có lẻ chỉ do phản ứng với chất dinh dưỡng, thường là các amino acid, đường hoặc purine nucleoside, riêng rẻ hay kết hợp, như kết hợp của asparagine, glucose, fructose and K+ (AGFK) gợi sự

nảy mầm của nội bào tử B subtilis, giai đoạn gợi nầy chỉ xảy ra trong vòng vài

giây, và tiến trình tiếp tục ngay cả khi đã loại bỏ tác nhân khởi phát.Các bước tiếp theo của sự nảy mầm, là 1) nội bào tử phóng thích H+ giúp tăng pH từ 6,5 lên 7,7 để thuận lợi cho tiến trình biến dưỡng khi mức độ thủy phân đủ cao cho hoạt động của enzyme và Zn2+; 2) phóng thích lượng lớn dipicolinic acid

(DPA) (10% trọng lượng khô của nội bào tử) từ thể lỏi và sẽ kết hợp với Ca2+; 3) Nước sẽ thay thế cho làm tăng hoạt động thủy hóa của thể lỏi và làm giảm khả năng kháng nhiệt của nội bào tử; 4) thủy phân thành phần peptidoglycan của lớp vỏ nội bào tử; 5) Nội bào tử hút thêm nước căng lên và tăng kích thước tế bào, từ sau đó hoạt động của protein dự trử được hồi phục, bao gồm các enzyme và khởi đầu cho hoạt động biến dưỡng tạo ra các đại phân tử và nội bào tử chuyển thành tế bào sinh dưỡng Bên cạnh yếu tố dinh dưỡng, nội bào tử cũng nảy mầm dưới tác động của một số tác nhân khác, bao gồm các lysozyme, muối, áp suất cao, Ca2+–DPA và các chất có hoạt tính bề mặt mang điện tích dương như dodecylamine Ca2+–DPA phóng thích từ một nội bào tử có thể k1ich thích sự nảy mầm các nội bào tử bên cạnh Đối với từng nội bào tử, giai đoạn 1-3, chỉ cần thời gian khoảng vài giây, nhưng có thể kéo dài nhiều phút và sự phân giải vỏ nội bào tử có thể xảy ra trong nhiều phút (Setlow, 2003) Theo Cowan (2013), tiến trình nầy có thể hoàn tất khá nhanh, thường trong 1½ giờ Các tác nhân kích thích hóa học có thể là các phân tử hữu cơ có trọng lượng phân tử nhỏ như amino acid hoặc muối vô cơ kích thích hoạt động của các thể màng của nội bào tử hình thành các enzyme để thủy phân lớp vỏ bao và tạo điều kiện để tế bào hấp thu nước, hút dinh dưỡng

và phát triển thành tế bào sinh dưỡng có chức năng biến dưỡng và sinh trưởng bình thường Sự nảy mầm giúp nội bào tử thoát khỏi trạng thái nghỉ, trong đó

có vai trò của các protein trong vỏ ngoài, vỏ trong và màng của nội bào tử, bao gồm cả sự hiện diện của đường và amino acid Trong sự nẩy mầm, nội bào tử phồng lên, làm phân hũy và tiêu thụ các lớp vỏ bảo vệ, tăng hoạt động biến dưỡng, nên cũng mất khả năng chống chịu với nhiệt và các yếu tố khắc nghiệt của môi trường khác Ở giai đoạn tăng sinh, các thành phần mới trong tế bào chất được hình thành, từ các phần còn lại của nội bào tử, và phát triển thành tế

bào vi khuẩn hoạt động (Willey et al, 2011)

1.7 Một số hợp chất trong công thức tồn trữ vi khuẩn

Talc (hoạt thạch): công thức hòa học Mg3Si4O10(OH)2, đây là hợp chất

có các tính chất như dẫn điện, dẫn nhiệt kém, chịu nhiệt, chịu acid, không nóng chảy dưới 1300 – 1400oC và nó dễ được nhận biết do có độ cứng thấp,

sờ trơn tay, tạo thành vẩy mỏng (Nguyễn Văn Chiển, 1961) Trong việc tồn trữ vi khuẩn thì talc được sử dụng như chất mang để vi khuẩn bám vào đó mà

phát triển (Vivekannthan et al, 2004; Commare et al, 2002) Ngoài việc bột

talc được sử dụng làm chất mang, với thành phần cấu tạo có Magnesium là một loại khoáng giữ vai trò đặc biệt quan trọng trong việc ổn định ribosome, màng tế bào, acid nucleic và cần cho hoạt động của các enzyme, có thể xem

talc là nguồn khoáng bổ sung dinh dưỡng cho môi trường tồn trữ vi khuẩn (Nguyễn Văn Chiển, 1961)

Carboxymethylcellulose (CMC): CMC là dẫn xuất hòa tan của cellulose,

dễ bị thủy phân bởi tất cả các men cellulolytic của sinh vật, CMC được sử dụng để xác định khả năng sản xuất ra các enzyme phân hủy cellulose không kết tinh của các sinh vật (Paul and Diana, 1993) CMC có nhiều công dụng khác nhau, tùy thuộc vào điều kiện sử dụng mà CMC có thể có chức năng khác nhau như: giữ nước, tạo đặc, ổn định, trợ phân tán,… nên có nhiều ứng dụng trong thực tế như trong công nghiệp tẩy rửa, CMC được dùng làm chất phụ gia CMC có khả năng ổn định huyền phù, nên được sử dụng để bảo vệ hệ bùn dùng trong khoan dầu khí, CMC tinh khiết được dùng trong hóa dược, hóa

mỹ phẩm (Hồ Sỹ Tráng, 2003) và trong những nghiên cứu về vi khuẩn kị khí tồn tại trong ruột gián (Cruden and Markovetz, 1979)

Calcium Carbonate (CaCO3): có hoạt tính làm tăng pH môi trường, cho nên trong các công thức tồn trữ vi khuẩn thường có CaCO3 giúp ổn định pH

Để tồn trữ Pseudomonas fluorescens thì Bharathi et al,(2004) đã dùng 15g

CaCO3 trộn với 1 kg bột talc để điều chỉnh pH của hỗn hợp về trung tính

1.8 Một số kết quả nghiên cứu về môi trường nhân nuôi vi khuẩn và tồn trữ vi khuẩn

1.8.1 Những kết quả nghiên cứu về môi trường nhân nuôi vi khuẩn

Những nghiên cứu về nhân nuôi vi khuẩn bắt đầu từ rất sớm, King et

al,(1954) đã sử dụng môi trường King’s B để nhân nuôi vi khuẩn P fluorescens trong glycerol 30% và trữ ở -800C Khi tiến hành nhân nuôi vi

khuẩn P fluorescens trong King’s B lỏng trên máy lắc Infors AG với tần số

lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng sau 48 giờ mật số vi khuẩn đạt được khoảng 9 x 108 CFU/ml, vi khuẩn sẽ tăng trưởng tốt khi có bổ sung thêm rifampicin (190 μgml), penicilin (100 μgml) và streptomicin (30 μgml) mà ở

nồng độ này sẽ ức chế vi sinh vật khác phát triển (Vidhyasekaran et al,1997) Theo Bharathi et al.(2004) thì dịch trích từ hạt cây neem và hợp chất chitin (dưới dạng colloidal chitin) có tác dụng làm tăng mật số 2 chủng PGPR

trong môi trường nuôi cấy Neem và chitin sau khi pha chế được cho vào môi trường nuôi cấy trước khi thanh trùng theo tỉ lệ 1% (V/V)

Nguyễn Thị Thu Nga (2003) đã thử nghiệm dịch trích đậu nành với các liều lượng khác nhau trong chất nền có chứa saccharose, kết quả ghi nhận được ở môi trường dịch trích đậu nành với liều lượng 150 g/lít cho hiệu quả cao hơn các nghiệm thức khác và khi chọn môi trường này cũng với liều lượng

150 g/lít và thử nghiệm bổ sung sucrose với các liều lượng khác nhau thì tác giả đi đến kết luận việc bổ sung sucrose không có hiệu quả làm gia tăng mật

số vi khuẩn trên máy lắc ngang Cũng nghiên cứu về vi khuẩn TG17 thì

Nguyễn Đắc Khoa và ctv., (2002) đã sử dụng dịch trích đậu nành với liều

lượng 150 g/lít để sản xuất vi khuẩn bằng nồi lên men tự chế, sau 72 giờ thì thu được 7 lít huyền phù vi khuẩn có mật số là 6 x 109 CFU/ml Tuy nhiên, cách nhân nuôi này lại gặp nhược điểm lớn là môi trường đậu nành dễ bị trào

ra trong quá trình nhân nuôi do đó rất dễ bị nhiễm, để khắc phục hiện tượng này cũng nhân nuôi bằng nồi lên men tự chế nhưng Nguyễn Thị Thu Nga (2003) đã sử dụng môi trường cám với các liều lượng khác nhau để thử nghiệm, kết quả ghi nhận được môi trường cám với liều lượng 40 g/lít cho mật

số vi khuẩn cao nhất và không bị trào ra trong quá trình nhân nuôi do đó không bị nhiễm Nhân nuôi bằng các loại môi trường trên chưa cho được mật

số vi khuẩn cao nên Dương Thị Nguyễn Quyên (2004) tiến hành nhân nuôi vi khuẩn TG17 với 3 loại môi trường: dịch trích cám (40 g/lít), dịch trích đậu nành (150 g/lít), cùng với môi trường kết hợp (cám hòa với đậu nành theo tỉ lệ 9:1), kết quả ghi nhận được môi trường kết hợp là tốt nhất để nhân nuôi vi khuẩn TG17 trên máy lắc ngang (tần số 150 lần/phút ở điều kiện nhiệt độ phòng), vi khuẩn đạt mật số cao trong khoảng từ 48 – 96 giờ sau khi nhân nuôi, lúc 72 giờ đạt mật số cao nhất là 2,3 x 1010 CFU/ml Dương Thị Nguyễn Quyên (2007) đã thử nghiệm bổ sung thêm PVP vào môi trường nhân nuôi, kết quả là bổ sung PVP ở nồng ðộ 2% có thể nhân mật số ðạt 1,2 x 1010 và rút ngắn thời gian nhân nuôi xuống còn 60 giờ

1.8.2 Những kết quả nghiên cứu về tồn trữ vi khuẩn

Vidhyasekaran và Muthamilan (1995) nghiên cứu 6 loại chất mang khác nhau gồm: than bùn, phân xanh, talc, chất khoáng bón cây, kaolinite và lignite trong việc tồn trữ vi khuẩn, có bổ sung thêm 10 g CMC (chất giúp bám dính)

và CaCO3 (giúp điều chỉnh pH về 7), các chất này được trộn đều và thanh trùng trong 2 ngày, huyền phù vi khuẩn có mật số 9 x 108 CFU/ml được nhân trước 48 giờ trên máy lắc ngang (tần số 150 vòng/phút), sau đó trộn đều với hỗn hợp ở trên trong điều kiện vô trùng (400 ml huyền phù trộn cho 1 kg giá thể) sau đó cho vào bọc PE, hàn kín và để trong điều kiện phòng Kết quả cho thấy công thức tồn trữ với bột talc có thể duy trì mật số vi khuẩn còn khoảng 1,3 x 107 CFU/ml ở 240 ngày sau khi trộn

Trong nghiên cứu của Bharathi et al,(2004), đã sử dụng 400 ml huyền phù vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có mật số 9 x 108 CFU/ml trộn đều với 1 kg bột talc (thanh trùng ở 105oC trong 12 giờ) có bổ sung 10 g CMC (chất bám dính), 15 g CaCO3 (điều chỉnh pH) trong điều kiện vô trùng Sản

phẩm được sấy khô trong mát để giảm độ ẩm (độ ẩm < 20%) rồi cho vào bọc

PE và hàn kín Hiện nay, có một số nhà khoa học đã thành công khi sử dụng

bột talc để tồn trữ vi khuẩn Pseudomonas (Vivekananthan et al,2004;Co mmare et al,2002)

Kanjanamaneesathian et al (1998) đã nghiên cứu phát triển các chế

phẩm của vi khuẩn đối kháng theo phương pháp tạp hạt ướt, thành phần chính trong công thức này là tế bào vi khuẩn, dầu thực vật đã được hydrate hóa, monohyrate lactose, polyvinyl pyrrolidone, sodium carboxymethyl cellulose, kết quả cho thấy mật số vi khuẩn còn 107-108 CFU/g và vẫn có hiệu quả tốt đối với bệnh đốm vằn trên lúa tương tự như khi xử lý với huyền phù vi khuẩn mới nuôi nhân

Bora et al,(2004) cũng nghiên cứu về khả năng sống sót của vi khuẩn, huyền phù vi khuẩn P putida sau khi được nhân mật số trong môi trường

King’s B, được ly tâm khoảng 20 phút với tốc độ 6250 vòng/phút Dạng viên thu được hòa vào MgSO4 0,1 M theo tỉ lệ 1:1 (trọng lượng/thể tích), sau đó được trộn tiếp với glycerol 10% (1 thể tích/1 thể tích), rồi tồn trữ

Dương Thị Nguyễn Quyên (2004) đã thử nghiệm tồn trữ vi khuẩn TG17 trên một số loại giá thể, kết quả ghi nhận trên giá thể đậu nành xay chỉ có thể bảo quản vi khuẩn trong 15 ngày, trên giá thể trấu không thêm chất nền agar thì có thể bảo quản được đến 45 ngày, riêng đối với giá thể cùi bắp xay khi thêm agar ở nồng độ 0,005% có tác dụng kéo dài thời gian bảo quản vi khuẩn

đối kháng B cepacia TG17 lên đến 60 ngày

Tiếp tục theo dõi thời gian tồn trữ của B cepacia TG17 trong giá thể cùi

bắp xay, có bổ sung thêm 0,05% agar, Dương Thị Nguyễn Quyên (2007) ghi nhận chế phẩm có thể bảo quản được đến 150 ngày sau khi cấy, tuy nhiên việc bổ sung thêm PVP (polyvinyl pirrolidone) và CMC (carboxymethyl cellulose) thì không ảnh hưởng đến tỉ lệ sống sót của TG17 trong chế phẩm ở dạng bột, theo thời gian tồn trữ

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 PHƯƠNG TIỆN

- Thời gian: từ tháng 3/2013 đến tháng 3/2014

-Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn bảo vệ thực vật, khoa NN và SHƯD, Trường ĐH Cần Thơ

- Dụng cụ: bình tam giác, đĩa petri, máy lắc, tủ cấy, ống nghiệm, máy đo

pH, lame đếm Thoma (Tokyo) …

- Máy trộn và Tủ sấy khô chế phẩm (tự chế)

- Các chủng Bacillus đã được xác định và được trữ trong tủ đông ở nhiệt

độ -20oC, trong Glycerol 15%, được cung cấp bởi phòng thí nghiệm phòng trừ

sinh học, Bộ môn Bảo vệ thực vật, Trường Đại học Cần Thơ

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng nhân mật số và tạo nội bào

tử của chủng vi khuẩn PGPR1 trong các loại môi trường khác nhau

* Mục tiêu: Chọn loại môi trường thích hợp cho nhân nuôi, vi khuẩn đạt

mật số cao, tỉ lệ nội bào tử (NBT) / tế bào sinh dưỡng (TBSD) cao trong thời

gian nhân nuôi ngắn

2.2.1.1 Chuẩn bị

- Các loại môi trường theo các công thức sau:

* Môi trường King’s B (Atlas, 2010)

pH 6,5

- Các môi trường sửa đổi từ môi trường PDA (Atlas, 2010), trong đó thành phần và lượng dinh dưỡng trong khoai lang, khoai mì, khoai tây, bã bia,

bã đậu nành được dựa theo Lã Văn Kính (2005) Các loại củ nguyên liệu được

thái ra trong phòng thí nghiệm, sau đó được nấu bằng autoclave 20 phút ( to =

121oC, p =1 atm), tiếp theo cho đường saccharose và điều chỉnh pH = 7 Sau

đó thanh trùng 30 phút

* Môi trường với khoai lang tươi:

Khoai lang tươi: 20g

*Môi trường với khoai tây:

Khoai tây tươi: 20g

- Chủng vi khuẩn PGPR1 được chuẩn bị trước 2 ngày, vi khuẩn được

nuôi cấy trong ống nghiệm chứa môi trường King’s B lỏng từ đơn khuẩn lạc trong đĩa petri chứa môi trường King’s B agar

- Chuẩn bị các ống nghiệm nước cất vô trùng (10ml / ống)

- Môi trường King’s B agar để xác định số vi khuẩn sống

- Thuốc nhuộm nội bào tử và các dụng cụ nhuộm

Hình 2.1 : Nguyên liệu khoai tây (A), khoai lang (B), khoai mì (C), bã

đậu nành (D) để làm thí nghiệm