ĐẶT VẤN ĐỀ Thời gian gần đây các chế phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc probiotics ngày càng gia tăng mạnh mẽ về số lượng. Tuy nhiên, các vi sinh vật probiotics này rất nhạy cảm với sự thay đổi của điều kiện môi trường bảo quản như nhiệt độ, độ ẩm, nồng độ oxy hòa tan và hàng rào sinh học của hệ tiêu hóa. Do đó, trong quá trình bảo quản và sau khi vào hệ tiêu hóa, số lượng vi khuẩn còn sống sót rất hạn chế 34. Để giải quyết vấn đề này, một trong những hướng nghiên cứu đáng chú ý gần đây là bổ sung thêm prebiotics nhằm làm tăng số lượng vi sinh vật trong chế phẩm cũng như tăng khả năng chống chịu của chúng trước các điều kiện bất lợi trong quá trình bảo quản, sử dụng. Sự kết hợp này tạo ra synbiotics. Có thể thấy các sản phẩm synbiotics ngày càng có mặt phổ biến trên thị trường với sự kết hợp rất đa dạng giữa các chủng probiotics và prebiotics như: Lactobacillus acidophilusinulin, Lactobacillus rhamnosusFOS, Bifidobacterium breveGOS, Bifidobacterium longumlactulose,… Tuy nhiên câu hỏi đặt ra là sản phẩm nào mới thực sự có tác dụng vượt trội bởi mỗi vi sinh vật sống trong probiotics chỉ phù hợp với một hoặc một số prebiotics và ngược lại. Xuất phát từ lý do này, chúng tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của một số prebiotics lên quá trình nuôi cấy Lactobacillus acidophilus và Bifidobacterium longum” nhằm 2 mục tiêu: Khảo sát ảnh hưởng của inulin lên khả năng sinh trưởng, phát triển của Lactobacillus acidophilus và Bifidobacterium longum. Khảo sát ảnh hưởng của lactulose lên khả năng sinh trưởng, phát triển của Lactobacillus acidophilus và Bifidobacterium longum.
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ HỒNG LIÊN KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG LÊN MEN CHỨA ĐẬU TƯƠNG TỚI KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CỦA Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ HỒNG LIÊN KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG LÊN MEN CHỨA ĐẬU TƯƠNG TỚI KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CỦA Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: Ts. Đàm Thanh Xuân Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô giáo TS. Đàm Thanh Xuân - Giảng viên Bộ môn Công nghiệp Dược, người thầy đã luôn quan tâm, trực tiếp tận tình hướng dẫn tôi thực hiện khóa luận này. Đồng thời, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ths. Kiều Thị Hồng, Ths. Nguyễn Khắc Tiệp, DS. Lê Ngọc Khánh đã cho tôi nhiều ý kiến đóng góp quý báu và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên trong Bộ môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi thực hiện khóa luận. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dìu dắt, dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và tất cả những người thân, bạn bè đã động viên, khích lệ, ủng hộ nhiệt thành và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua. Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Lê Thị Hồng Liên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto 2 1.1.1. Phân loại khoa học 2 1.1.2. Nguồn gốc 2 1.1.3. Đặc điểm hình thái 2 1.1.4. Đặc điểm sinh dưỡng 3 1.1.5. Đặc điểm sinh lý 3 1.1.6. Sản phẩm trao đổi chất của Bacillus subtilis natto 3 1.2. Natto và Nattokinase 4 1.2.1. Natto 4 1.2.2. Nattokinase 5 1.2.3. Đậu nành 8 1.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp protease của Bacillus subtilis natto 9 1.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ 9 1.3.2. Ảnh hưởng của pH môi trường 10 1.3.3. Độ thông khí 10 1.3.4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường 10 1.3.5. Ảnh hưởng của thời gian lên men 10 1.3.6. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh enzym protease của B. subtilis natto 11 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1. Nguyên liệu và thiết bị sử dụng 13 2.1.1. Vi sinh vật sử dụng 13 2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng 13 2.1.3. Môi trường 14 2.1.4. Máy móc và dụng cụ 14 2.2. Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung nguồn dinh dưỡng chứa đậu tương tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto 15 2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung kết hợp đậu tương và casein tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto 15 2.3. Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1. Phương pháp giữ giống và nuôi cấy Bacillus subtilis natto 16 2.3.2. Phương pháp làm sữa đậu nành 16 2.3.3. Phương pháp làm đậu natto 16 2.3.4. Phương pháp thử hoạt tính các nhóm enzym 17 2.3.5. Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm: 18 Chương 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ 19 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcacbon chứa đậu tương tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto 19 3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung sữa đậu nành và bột đậu tới khả năng sinh enzym ngoại bào của Bacillus subtilis natto 19 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men Bacillus subtilis natto trong môi trường canh thang có bổ sung sữa đậu nành và bột đậu nành đến khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto 23 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường tổng hợp chứa đậu tương và casein đến khả năng sinh enzym protease của Bacillus subtilis natto 27 3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ casein đến khả năng sinh enzym protease của Bacillus subtilis natto 27 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung kết hợp casein và bột đậu nành lên khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribo nucleic Atm Đơn vị đo áp suất atmosphe B. subtilis natto Bacillus subtilis natto CMC Carboxy methyl cellulose CU Caseinolytic units Da, kDa Dalton, kilo Dalton FU Fibrinolytic units (Đơn vị đánh giá khả năng phân giải fibrin của chất nghiên cứu NCBI National center for Biotechnology Information (Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học) pI Điểm đẳng điện của protein TLPT Trọng lượng phân tử t – PA Tissue plasminogen activator (các tác nhân hoạt hóa plasminogen ở mô) VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Thành phần chính trong 100g Natto 5 1.2 Thành phần hóa học trong đậu nành 9 2.1 Nguyên liệu và hóa chất sử dụng 13 2.2 Thiết bị được sử dụng 15 3.1 Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch lên men các môi trường canh thang bổ sung sữa đậu nành, bột đậu và của dịch chiết natto sau 24 giờ 20 3.2 Đường kính vòng phân giải casein casein ) của dịch lên men khi nuôi cấy B. subtilis natto sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ trong các môi trường bổ sung sữa đậu nành, bột đậu và của dịch chiết natto 24 3.3 Đường kính vòng phân giải casein ( casein ) của dịch lên men khi nuôi cấy B. subtilis natto sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ trong các môi trường canh thang có bổ sung casein 28 3.4 Đường kính vòng phân giải casein ( casein ) của dịch lên men khi nuôi cấy B. subtilis natto sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ trong môi trường canh thang có bổ sung casein 2% và bột đậu nành 31 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ STT Tên hình Trang 1.1 Hình thái vi khuẩn của Bacillus subtilis natto 3 1.2 Sản phẩm natto 4 1.3 Cấu trúc bậc 3 của nattokinase 6 1.4 Cơ chế tiêu fibrin của nattokinase 7 3.1 Biểu đồ thể hiện đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch lên men các môi trường canh thang bổ sung sữa đậu nành, bột đậu và dịch chiết natto sau 24 giờ 21 3.2 Biểu đồ thể hiện đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men sau các khoảng thời gian trong các môi trường bổ sung sữa đậu nành, bột đậu và dịch chiết natto 25 3.3 Biểu đồ thể hiện đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ trong các môi trường canh thang bổ sung casein 28 3.4 Biểu đồ thể hiện đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men sau 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ trong các môi trường bổ sung casein 2% và bột đậu nành 32 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Các bệnh liên quan đến tim mạch là nguyên nhân lớn nhất gây tử vong trên toàn thế giới. Trong năm 2012, khoảng 17,5 triệu người chết vì bệnh tim mạch, chiếm 31% tỉ lệ người tử vong trên toàn cầu [47]. Ở Mỹ, mỗi năm có khoảng 900.000 người mắc bệnh huyết khối tĩnh mạch, trong đó khoảng 300.000 ca tử vong [26]. Tại thành phố Hồ Chí Minh, theo thống kê, mỗi năm có khoảng 17.500 nguời bị đột quỵ do tai biến mạch máu não, trong đó 9.000 người tử vong. Việc ngăn ngừa sự hình thành huyết khối có vai trò quan trọng để phòng ngừa và điệu trị các bệnh này [16]. Trước đây, để điều trị bệnh huyết khối người ta sử dụng các chất chống đông như heparin và coumarin. Bước sang đầu thế kỷ 20, người ta đã phát hiện ra các enzym có khả năng tiêu fibrin, các enzym hiện nay đang được dùng như streptokinase, urokinase tuy nhiên các enzym này được dùng chủ yếu trong cấp cứu tai biến và có nhiều tác dụng phụ [45]. Nattokinase là một protease có khả năng tiêu fibrin mạnh, được phát hiện năm 1980 bởi giáo sư Hiroyuki Sumi có nguồn gốc từ Natto - một món ăn truyền thống từ Nhật Bản được lên men bằng cách ủ đậu nành nấu chín với Bacillus subtilis natto. Đặc biệt, nattokinase còn dùng được đường uống để phòng bệnh huyết khối [24], [43]. Trong điều kiện lên men chìm, B. subtilis natto còn có khả năng sinh nhiều enzym ngoại bào như protease, amylase, cellulase,…Việc thay đổi môi trường dinh dưỡng có thể ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzym của vi khuẩn. Với khả năng phát triển tốt trên đậu tương đã nấu chín và nguồn đậu tương dễ kiếm trong nước, việc lựa chọn môi trường lên men B. subtilis natto chứa đậu tương có ý nghĩa trong sản xuất protease quy mô công nghiệp. Do đó khóa luận “Khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên men chứa đậu tương tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto” được thực hiện với hai mục tiêu: 1. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon chứa đậu tương tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto. 2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung kết hợp đậu tương và casein đến khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto [...]... subtilis natto - Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung sữa đậu nành và bột đậu tới khả năng sinh enzym ngoại bào của Bacillus subtilis natto - Khảo sát thời gian thu enzym protease khi nuôi cấy vi khuẩn trong các môi trường canh thang có bổ sung sữa đậu nành và bột đậu 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung kết hợp đậu tương và casein tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto - Lựa chọn... nghiệm tiếp tục khảo sát thời gian nuôi cấy B subtilis natto trong các môi trường canh thang có bổ sung sữa đậu, bột đậu và so sánh với natto Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men của các môi trường canh thang có bổ sung bã sữa đậu, bột đậu và natto tự làm đến khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto Tiến hành: - Nuôi cấy B subtilis natto trong 3 bình nón chứa 100ml môi trường thử,... 19 Chương 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcacbon chứa đậu tương tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto 3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung sữa đậu nành và bột đậu tới khả năng sinh enzym ngoại bào của Bacillus subtilis natto B subtilis natto có nhiều trong rơm rạ, cỏ khô, phát triển rất tốt trên đậu tương đã nấu chín, chúng cũng phát triển trên các... tăng hoạt độ protease của B subtilis natto Tuy nhiên sau 48 giờ, hoạt độ protease của các môi trường đã tăng và cao hơn so với khi không bổ sung Natto tự làm sau 48 giờ cũng cho hoạt độ protease xấp xỉ với hoạt độ protease của natto Nhật 27 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường tổng hợp chứa đậu tương và casein đến khả năng sinh enzym protease của Bacillus subtilis natto 3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ... trên đặc điểm này của B subtilis natto, thí nghiệm chọn môi trường lên men là môi trường canh thang có bổ sung sữa đậu nành và bột đậu nành và thời gian lấy mẫu vào thời điểm 24 giờ Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung sữa đậu nành và bột đậu tới khả năng sinh enzym ngoại bào của Bacillus subtilis natto Tiến hành: - Nuôi cấy B subtilis natto trong 3 bình nón chứa 100ml môi trường thử, ủ trong... casein đến khả năng sinh enzym protease của Bacillus subtilis natto Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của casein tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto Tiến hành: - Nuôi cấy B subtilis natto trong 5 bình nón chứa 100ml môi trường thử, ủ trong máy lắc với tốc độ 110 vòng/phút, ở 370C theo phương pháp nêu ở mục 2.3.1.c; - Sau các khoảng thời gian 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ lấy dịch lên men, thử... hoạt độ protease thấp hơn của dịch chiết natto Nhật và cao hơn của dịch chiết natto tự làm 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men Bacillus subtilis natto trong môi trường canh thang có bổ sung sữa đậu nành và bột đậu nành đến khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto Các thí nghiệm ở phần 3.1.1 được tiến hành trong thời gian 24 giờ, theo sinh lý phát triển, thời gian này tế bào vi sinh vật... bổ sung vào môi trường canh thang, khảo sát thời gian cho hoạt độ protease cao nhất - Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung kết hợp bột đậu và casein, khảo sát thời gian cho hoạt độ protease khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường bổ sung 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp giữ giống và nuôi cấy Bacillus subtilis natto a) Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng Pha môi trường thạch... cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh enzym protease của B subtilis natto a) Nghiên cứu trên thế giới Năm 2005, Junguo Liu và cộng sự đã nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện dinh dưỡng cho sinh tổng hợp nattokinase sử dụng chủng Bacillus subtilis natto NLSSE Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát các nguồn nitrogen: (NH4)2SO4, NaNO3, natri glutamate, casein, pepton đậu nành; khảo sát các... vật sẽ giảm [6] 1.3.4 Ảnh hưởng của thành phần môi trường Thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzym Nếu môi trường có những chất khó đồng hóa thì vi sinh vật sẽ tiết ra những enzym tương ứng để phân hủy chúng thành những chất đồng hóa được Vì vậy, khi cho chất cảm ứng vào môi trường dinh dưỡng thì khả năng tổng hợp enzym của vi sinh vật tăng lên nhiều lần so với bình . dưỡng chứa đậu tương tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto 15 2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường bổ sung kết hợp đậu tương và casein tới khả năng sinh protease của Bacillus. 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcacbon chứa đậu tương tới khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto 19 3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung sữa đậu nành và bột đậu tới khả. đến khả năng sinh protease của Bacillus subtilis natto 23 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường tổng hợp chứa đậu tương và casein đến khả năng sinh enzym protease của Bacillus subtilis natto