Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên khả năng tạo enzym của vi khuẩn

62 419 0
Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên khả năng tạo enzym của vi khuẩn

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, các chế phẩm enzym được sản xuất và sử dụng ngày càng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống con người. Trong số đó, protease – enzym phá vỡ liên kết peptid giữa các acid amin của protein – là enzym có nhiều ứng dụng trong một số ngành như chế biến thực phẩm, sản xuất ch ất tẩy rửa, thuộc da… Đặc biệt trong lĩnh vực y tế, các protease đã được sử dụng làm thuốc điều trị và cho hiệu quả tốt. Bên cạnh các protease thu nhận được từ các tổ chức của động vật (renin, tripsin), thực vật (bromelanin, papain), protease có nguồn gốc từ vi sinh vật cũng đang được nghiên cứu để tìm ra các phương pháp tách chiết tối ưu. Một trong số các loài vi sinh vật có khả năng sinh ra protease và được ứng dụng nhiều là vi khuẩn thuộc chi Bacillus. 55 Vi khuẩn Bacillus subtilis natto thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis được biết đến là “nguyên liệu” ủ cùng với đậu tương nấu chín, lên men tạo nên món ăn truy ền thống Natto của Nhật Bản. Năm 1980, giáo sư Sumi người Nhật đã phát hiện ra trong Natto có chứa nattokinase – một enzym thuộc nhóm các enzym protease có khả năng phân giải fibrin 53. Từ đó đến nay, nhiều nghiên cứu về Bacillus subtilis natto đã được tiến hành và kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng sinh ra nhiều enzym nhóm protease như nattokinase 31, elastase 62, bacillopeptidase F 64… Bacillus subtilis natto có khả năng sinh tổng hợp protease nhưng vấn đề đặt ra là làm cách nào để có thể thu được protease từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Vì vậ y, khóa luận “Nghiên cứu tách chiết enzym protease b ằng amoni sulfat từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto” được thực hiện với hai mục tiêu: 1. Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp trong quá trình tách chiết protease từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ THANH THẢO NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYM PROTEASE BẰNG AMONI SULFAT TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ THANH THẢO NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYM PROTEASE BẰNG AMONI SULFAT TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Đàm Thanh Xuân 2. DS. Đinh Thu Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành nhất tới cô giáo TS. Đàm Thanh Xuân – Giảng viên bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội và DS. Đinh Thu Hương, những người đã luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trên con đường học tập, nghiên cứu khoa học. Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn DS. Lê Ngọc Khánh cùng toàn thể các thầy, cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình, các thầy cô giáo trong trường và tất cả bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Hà Nội, tháng 5 năm 2013 Sinh viên Đinh Thị Thanh Thảo MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Trang DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2 1.1. Enzym vi sinh vật và phương pháp tách chiết enzym từ vi sinh vật 2 1.1.1. Enzym vi sinh vật 2 1.1.2. Chiết xuất và thu nhận enzym từ vi sinh vật 3 1.1.3. Kiểm tra độ sạch của chế phẩm enzym 6 1.1.4. Protease và chiết tách protease ngoại bào của vi sinh vật thuộc chi Bacillus 6 1.2. Phương pháp chiết tách protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto 9 1.2.1. Đặc điểm của Bacillus subtilis natto 9 1.2.2. Đặc điểm của protease ngoại bào của B. subtilis natto 10 1.2.3. Các phương pháp chiết tách protease ngoại bào của B. subtilis natto 11 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 14 2.1.1. Vi sinh vật sử dụng 14 2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng 14 2.1.3. Môi trường 14 2.1.4. Máy móc và dụng cụ 14 2.2. Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1. Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp trong quá trình tách chiết protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto 15 2.2.2. Sơ bộ tinh chế và xác định một số đặc tính của protease thu được 15 2.3. Phương pháp nghiên cứu … 15 2.3.1. Phương pháp giữ giống và nuôi cấy Bacillus subtilis natto 15 2.3.2. Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính các nhóm enzym 16 2.3.3. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym protease 17 2.3.4. Phương pháp chiết xuất và tinh sạch protease 17 2.3.5. Phương pháp Biuret xác định nồng độ protein và hoạt độ protease 19 2.3.6. Phương pháp điện di SDS – PAGE 21 2.3.7. Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính phân giải fibrin 21 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ – BÀN LUẬN 22 3.1. Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp trong quá trình tách chiết protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto………… 22 3.1.1. Sơ bộ xác định các enzym có mặt trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto 22 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym protease ngoại bào của B. subtilis natto 23 3.1.3. Khảo sát nồng độ amoni sulfat để kết tủa protease ngoại bào của B. subtilis natto 26 3.2. Sơ bộ tinh chế và xác định một số đặc tính của protease thu được 32 3.2.1. Tinh chế protease bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex G – 75 32 3.2.2. Điện di một số phân đoạn thu được sau tinh chế 36 3.2.3. Sơ bộ thử hoạt tính phân giải fibrin của mẫu nghiên cứu 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AS : Amoni sulfat bh : bão hòa CM : Carboxymethyl Sắc kí trao đổi ion CM : Sắc kí trao đổi ion có nhựa trao đổi ion mang nhóm trao đổi là cation carboxymethyl CMC : Carboxy methyl cellulose DEAE : Diethylaminoethyl Sắc kí trao đổi ion DEAE : Sắc kí trao đổi ion có nhựa trao đổi ion mang nhóm trao đổi là anion diethylaminoethyl E : Enzym FU : Fibrinolytic units (Đơn vị đánh giá khả năng phân giải fibrin của chất nghiên cứu) kDa : kilo Dalton mBar : mili Bar N 0 : Lần thí nghiệm nKat : nano Katal pI : Điểm đẳng điện của protein Quy mô PTN : Quy mô phòng thí nghiệm SDS : Sodium dodecyl sulfat (Natri dodecyl sulfat) SDS – PAGE : Sodium dodecyl sulfat – Polyacrylamide Gel Electrophoresis Điện di SDS – PAGE : Điện di gel polyacrylamid với sự có mặt của natri dodecyl sulfat TLPT : Trọng lượng phân tử t – PA : Tissue plasminogen activator (các tác nhân hoạt hóa plasminogen ở mô) UF : Mảng siêu lọc Ultra Filtration DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang B ả ng 1.1: Các phương pháp sắc kí 5 B ả ng 1.2 : Các loại gel Sephadex 5 Bảng 1.3: Sản phẩm protease ngoại bào của chi Bacillus 7 B ả ng 1.4: Các nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của B. subtilis 8 B ả ng 1. 5 : Một số nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của B. subtilis natto 12 B ả ng 2.1 : Nguyên liệu và hóa chất 14 B ả ng 2.2 : Thiết bị được sử dụng 15 B ả ng 3.1 : Sơ bộ thử hoạt tính các enzym trong dịch nuôi cấy B. subtilis natto 22 B ả ng 3.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym protease của dịch trong 24 B ả ng 3.3 : Giá trị mật độ quang của dung dịch protein đã biết nồng độ 26 B ả ng 3.4: Kết quả đường kính vòng phân giải casein, tinh bột, CMC của các dịch enzym khi chiết xuất với các nồng độ amoni sulfat bão hòa khác nhau 27 B ả ng 3.5: Kết quả định lượng protein và xác định hoạt độ protease của các dịch enzym khi chiết xuất với các nồng độ amoni sulfat bão hòa khác nhau 29 B ả ng 3.6: Khả năng phân giải casein, nồng độ protein và hoạt độ protease của các dịch enzym thu được theo quy trình kết tủa phân đoạn 31 Bảng 3.7: Kết quả thử khả năng phân giải casein của các phân đoạn thu được sau tinh chế 33 B ả ng 3.8: Đánh giá sự có mặt của α – amylase và cellulase trong các phân đoạn 34 B ả ng 3.9: Kết quả các giai đoạn tách chiết và tinh chế protease 35 B ả ng 3.10 : Kết quả đo đường kính vòng phân giải fibrin 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ Tên hình Trang Hình 1.1 : Cơ chế thủy phân phân tử protein của protease 6 Hình 1.2 : Năng suất và mức tinh sạch của protease chiết xuất từ môi trường nuôi cấy B. subtilis 9 Hình 1.3 : Quy trình kết tinh công nghiệp của subtilisin dưới dạng muối halogen 9 Hình 1.4 : Hình thái vi khuẩn B. subtilis natto 10 Hình 3.1: Kết quả trung bình đường kính vòng phân giải casein tại các giá trị pH khác nhau 24 Hình 3.2: Biểu đồ mẫu định lượng protein theo phương pháp Biuret 26 Hình 3.3: Khả năng phân giải casein, tinh bột, CMC của các dịch enzym khi chiết xuất với các nồng độ amoni sulfat bão hòa khác nhau 28 Hình 3.4: Mối liên hệ giữa hoạt tính enzym protease của các phân đoạn và thể tích rửa giải (V e ) 34 Hình 3.5: Kết quả điện di SDS – PAGE 37 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, các chế phẩm enzym được sản xuất và sử dụng ngày càng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống con người. Trong số đó, protease – enzym phá vỡ liên kết peptid giữa các acid amin của protein – là enzym có nhiều ứng dụng trong một số ngành như chế biến thực phẩm, sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da… Đặc biệt trong lĩnh vực y tế, các protease đã được sử dụng làm thuốc điều trị và cho hiệu quả tốt. Bên cạnh các protease thu nhận được từ các tổ chức của động vật (renin, tripsin), thực vật (bromelanin, papain), protease có nguồn gốc từ vi sinh vật cũng đang được nghiên cứu để tìm ra các phương pháp tách chiết tối ưu. Một trong số các loài vi sinh vật có khả năng sinh ra protease và được ứng dụng nhiều là vi khuẩn thuộc chi Bacillus. [55] Vi khuẩn Bacillus subtilis natto thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis được biết đến là “nguyên liệu” ủ cùng với đậu tương nấu chín, lên men tạo nên món ăn truyền thống Natto của Nhật Bản. Năm 1980, giáo sư Sumi người Nhật đã phát hiện ra trong Natto có chứa nattokinase – một enzym thuộc nhóm các enzym protease có khả năng phân giải fibrin [53]. Từ đó đến nay, nhiều nghiên cứu về Bacillus subtilis natto đã được tiến hành và kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng sinh ra nhiều enzym nhóm protease như nattokinase [31], elastase [62], bacillopeptidase F [64]… Bacillus subtilis natto có khả năng sinh tổng hợp protease nhưng vấn đề đặt ra là làm cách nào để có thể thu được protease từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Vì vậy, khóa luận “Nghiên cứu tách chiết enzym protease bằng amoni sulfat từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto” được thực hiện với hai mục tiêu: 1. Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp trong quá trình tách chiết protease từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto. 2. Sơ bộ tinh chế và xác định một số đặc tính của protease thu được 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.3. Enzym vi sinh vật và phương pháp tách chiết enzym từ vi sinh vật 1.3.1. Enzym vi sinh vật Enzym là các chất xúc tác sinh học có tính đặc hiệu cao, phần lớn có bản chất là protein; có ở trong tất cả các tế bào sống và có thể duy trì được hoạt tính xúc tác sau khi tách ra khỏi cơ thể sống (ở những điều kiện nhất định). [2],[8],[14] Ngày nay, người ta có thể tổng hợp enzym bằng phương pháp hóa học (các synzym), tìm ra các kháng thể có hoạt tính xúc tác (abzym), acid ribonucleic có hoạt tính xúc tác (ribozym)… Tuy nhiên, đa số các enzym hiện nay vẫn được chiết tách từ các tổ chức của động vật; thực vật; và chủ yếu là từ vi sinh vật. [3],[8] Vi sinh vật là nguồn thu enzym rất phong phú trong đó có những enzym mà cơ thể động vật và thực vật không thể tổng hợp được. Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym với một lượng lớn, trong thời gian ngắn. Con người có thể tác động vào vi sinh vật để thu được enzym theo ý muốn. Mặt khác enzym vi sinh vật thường có hoạt tính mạnh. [14],[17],[36] Quy trình thu nhận chế phẩm enzym từ vi sinh vật gồm bốn giai đoạn chủ yếu:  Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật  Nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzym  Chiết tách và thu nhận enzym  Kiểm tra độ sạch của chế phẩm enzym Quá trình phân lập, tuyển chọn, cải tạo giống vi sinh vật nhằm tạo ra giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym nghiên cứu với hiệu quả cao; sử dụng các biện pháp như: gây đột biến bằng tác nhân vật lý, hóa học, sinh học phân tử (biến nạp, tải nạp, tiếp hợp gen). [14],[17],[36] Quá trình nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzym được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt hoặc phương pháp nuôi cấy chìm. Cần lựa chọn thành phần môi trường dinh dưỡng (đặc biệt là các chất cảm ứng); kiểm soát các thông số [...]... nghiệm của Đào Thị Mai năm 2012 (18,4mm) [7] và Hin Virek năm 2012 (17,9mm) [20] 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym protease ngoại bào của B subtilis natto Thí nghiệm dựa trên phương pháp nghiên cứu của Cong Wang (2009) và R Dubey (2011) khi khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease của dịch chiết enzym [67],[55] Theo kết quả của Lu Ying năm 2004, khoảng pH được lựa chọn để khảo sát. .. Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp trong quá trình tách chiết protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto  Sơ bộ xác định các enzym có mặt trong môi trường nuôi cấy B subtilis natto  Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym protease ngoại bào của B subtilis natto  Khảo sát nồng độ amoni sulfat để kết tủa protease ngoại bào của B subtilis natto 2.2.2... (có khả năng trộn lẫn với nước) được thêm vào dịch chiết enzym sẽ làm giảm hằng số điện môi của dung dịch, làm giảm độ tan của protein enzym và tạo kết tủa Các dung môi dùng phổ biến: aceton, ethanol, isopropanol Để hạn chế ảnh hưởng của dung môi đến hoạt tính của enzym cần tiến hành ở nhiệt độ thấp (dưới 0 0C) [5],[6],[14] Ngoài ra khi kết tủa enzym còn sử dụng các phương pháp khác như: kết tủa enzym. .. casein của protease ngoại bào sinh ra bởi B subtilis natto; nhằm lựa chọn hệ đệm có pH thích hợp hòa tan tủa enzym trong bước chiết tách 24 Tiến hành: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng phân giải casein của dịch trong theo phương pháp được nêu ra trong phần 2.3.3 Các giá trị pH được khảo sát là 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 và pH của dịch trong Thí nghiệm được lặp lại 3 lần Kết quả: pH trung bình của. .. giống trong bình nón Pha 20ml môi trường canh thang (theo phần 2.1.3) cho vào bình nón 50ml, nút kín Hấp tiệt khuẩn môi trường ở điều kiện 1atm/20 phút Sau khi tiệt khuẩn, để môi trường nguội xuống dưới 400C, dùng que cấy vô khuẩn cấy khuẩn lạc trong ống giống vào môi trường Nuôi trên máy lắc ở 37 0C/24 giờ, tốc độ lắc 100 vòng/phút [4],[10] c) Phương pháp lên men Pha 100ml môi trường canh thang (theo phần... tiệt khuẩn môi trường ở điều kiện 1atm/20 phút Sau khi tiệt khuẩn, để môi trường nguội xuống dưới 40 0C, cấy giống từ môi trường nhân giống sang môi trường mới với tỷ lệ cấy truyền là 10% Nuôi trên máy lắc ở 370C/24 giờ, tốc độ lắc 100 vòng/phút [4],[10] 2.3.2 Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính các nhóm enzym a) Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính protease Nguyên tắc: Dùng “casein” làm cơ chất, xác định khả năng. .. nuôi cấy [63]) Theo các nghiên cứu đã được công bố, trong môi trường nuôi cấy B subtilis natto có nhiều loại enzym khác nhau [40],[57],[58],[63],[70] Vì vậy, thí nghiệm được tiến hành để sơ bộ xác định sự tồn tại của một số enzym, đặc biệt là các protease ngoại bào của B subtilis natto Mục đích: Bước đầu khảo sát sự tồn tại của các enzym trong môi trường nuôi cấy B subtilis natto Tiến hành: Nuôi cấy B... 60% 70% 80% 90% Hình 3.3: Khả năng phân giải casein, tinh bột, CMC của các dịch enzym khi chiết tách với các nồng độ amoni sulfat bão hòa khác nhau Nhận xét: Kết quả đưa ra trên bảng 3.4 và đồ thị hình 3.3 cho thấy các dịch enzym 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% đều có khả năng phân giải casein, tinh bột và CMC + Về khả năng phân giải casein: Khả năng phân giải casein của dịch enzym tăng dần theo lượng... 4,5 B subtilis natto có khả năng sinh bào tử và nhiệt độ thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử là 400C [57] Bào tử Tế bào vi khuẩn Hình 1.4: Hình thái vi khuẩn B subtilis natto [75] 1.4.2 Đặc điểm của protease ngoại bào của B subtilis natto Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B subtilis natto có khả năng sinh tổng hợp nhiều nhóm enzym ngoại bào khác nhau như: Nhóm enzym γ– transpeptidase theo... từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto đều có khả năng phân giải cơ chất casein, tinh bột, CMC Mẫu trắng không cho vòng phân giải cơ chất do đó đã loại trừ được ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả thí nghiệm Kết luận sơ bộ: Trong môi trường nuôi cấy B subtilis natto có mặt cả protease, amylase và cellulase Bàn luận: Kết quả thí nghiệm phù hợp với kết quả nghiên cứu về các loại enzym có mặt trong môi trường . natto 22 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym protease ngoại bào của B. subtilis natto 23 3.1.3. Khảo sát nồng độ amoni sulfat để kết tủa protease ngoại bào của B. subtilis. các enzym trong dịch nuôi cấy B. subtilis natto 22 B ả ng 3.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym protease của dịch trong 24 B ả ng 3.3 : Giá trị mật độ quang của. chiết enzym sẽ làm giảm hằng số điện môi của dung dịch, làm giảm độ tan của protein enzym và tạo kết tủa. Các dung môi dùng phổ biến: aceton, ethanol, isopropanol. Để hạn chế ảnh hưởng của dung

Ngày đăng: 29/07/2015, 10:15

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan