Phương pháp đĩa fibrin (fibrin plate method) đã được đưa ra bởi Astrup năm
1952 và Ekio Ohta năm 2008 để đánh giá khả năng phân giải fibrin của các chất [21],[51]. Nattokinase có TLPT khoảng 29kDa, có khảnăng phân giải mạnh fibrin [31],[32],[35],[67],[73]. Phân đoạn 10 thu được sau khi tinh chế có protein TLPT khoảng 29kDa nên tiến hành thử khảnăng phân giải fibrin đểđánh giá chính xác.
Mục đích: So sánh khả năng phân giải fibrin của các mẫu thử thu được từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto với các mẫu đối chứng.
Tiến hành: Tiến hành theo phương pháp được nêu ra trong phần 2.3.7. Hai mẫu đối chứng: Nattospes; nattokinase trong đệm phosphat pH = 7,6. Ba mẫu thử: dịch trong (từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto); dịch enzym 60% (kết tủa với amoni sulfat 60% bão hòa); phân đoạn 10 (tinh chế dịch enzym 60% bằng sắc kí lọc gel Sephadex G – 75). Ba mẫu trắng: nước cất; đệm phosphat pH = 7,6; NaCl 0,9%.
Kết quả: Kết quả trung bình đường kính vòng phân giải fibrin của các mẫu nghiên cứu được thể hiện trên bảng 3.10. Các mẫu trắng không cho vòng phân giải
fibrin nên đã loại trừđược ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả thí nghiệm.
Bảng 3.10: Kết quảđo đường kính vòng phân giải fibrin
Mẫu đối chứng
d (mm) Mẫu thử d (mm) Mẫu trắng d (mm)
Nattospes 16,1 Dịch li tâm 12,6 Nước cất (-)
Nattokinase 29,5 Dịch enzym 60% 20,0 Đệm pH= 7,6 (-)
Phân đoạn 10 16,9 NaCl 0,9% (-)
Chú thích d (mm):Đường kính vòng phân giải fibrin (đơn vị mm)
Nhận xét: Kết quảđưa ra trên bảng 3.10 cho thấy cả mẫu đối chứng và mẫu thử đều cho vòng phân giải fibrin. Trong đó, mẫu đối chứng nattokinase có đường kính vòng phân giải fibrin lớn nhất (29,5mm). Đường kính vòng phân giải fibrin của hai mẫu thử: dịch enzym 60% và phân đoạn 10 cũng tương đối lớn (~ 67,8% và 57,3% so với mẫu đối chứng nattokinase).
Bàn luận: Protease ngoại bào của B. subtilis natto được chiết tách từ môi
trường nuôi cấy vi khuẩn với phương pháp kết tủa bằng amoni sulfat 60% bão hòa; tinh chế bằng phương pháp sắc kí lọc gel Sephadex G – 75. Trong các protease thu
được sau tách chiết và tinh chế có mặt nattokinase do những đặc tính xác định được
đều phù hợp với kết quả của các nghiên cứu trước đó về nattokinase:
+ Là một protease do B. subtilis natto tạo ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn.
+ Có TLTP trong khoảng từ 27,7kDa – 29kDa.
+ Có khảnăng phân giải mạnh cơ chất fibrin. [31],[32],[35],[67],[73]
Các quy trình chiết tách protease từmôi trường nuôi cấy B. subtilis natto trên quy mô PTN thường có nhiều bước tinh chế như: nghiên cứu của Tetsuya Kato (1992) và Fujita (1993) có 4 bước tinh chế [31],[39]; nghiên cứu của Muramatsu (2000) và Cong Wang (2009) có 3 bước tinh chế[44],[67]. Tuy đề tài mới thực hiện một bước tinh chếnhưng phân đoạn 10 thu được sau tinh chế chỉ còn nattokinase và protein TLPT 35kDa. Muốn thu riêng nattokinase từmôi trường nuôi cấy B. subtilis natto cần tiến hành thêm một số bước tinh chế khác như: theo Cong Wang (2009) sau 3 bước tinh chế (thẩm tích, sắc kí lọc gel Sephadex G – 75, sắc kí kị nước Phenyl Sepharose); trên băng điện di chỉ còn protein TLPT 29kDa là nattokinase [67]. Việc tinh sạch được nattokinase từmôi trường nuôi cấy B. subtilis natto mở ra khảnăng có thể sử dụng nattokinase làm dược phẩm trong điều trị một số bệnh lí có
liên quan đến huyết khối như bệnh lí về tim mạch, huyết áp… bên cạnh các thực phẩm chức năng đang lưu hành trên thịtrường.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận
Qua quá trình nghiên cứu, đềtài đã thu được các kết quả sau:
1. Khảo sát khoảng nồng độ amoni sulfat để kết tủa enzym protease từ môi
trường nuôi cấy B. subtilis natto là 20 – 80% amoni sulfat bão hòa. Đã lựa chọn
được nồng độ amoni sulfat 60% bão hòa là nồng độ tối ưu thu được tủa enzym có hoạt độ protease cao nhất: 172,536nKat; đồng thời hạn chế được lượng tối đa của các enzym khác cũng có mặt trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto (amylase và cellulase). Lựa chọn được dung dịch đệm phosphat pH = 7,6 là dung môi hòa tan tủa enzym.
2. Đã sơ bộ tinh chế tủa protein enzym thu được bằng phương pháp sắc kí lọc gel Sephadex G – 75 đồng thời xác định một sốđặc tính của protease thu được. Lựa chọn được phân đoạn có hoạt độ protease cao nhất là phân đoạn 10: 27,221nKat. Đã
xác định được sự có mặt của một số protease trong một số phân đoạn thu được sau khi tinh chế. Kết quả cho thấy phân đoạn 10 có enzym nattokinase với khả năng
phân giải mạnh cơ chất fibrin. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quảthu được cho thấy đềtài đã giải quyết được hai mục tiêu:
+ Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp trong quá trình tách chiết protease từmôi trường nuôi cấy B. subtilis natto.
+ Sơ bộ tinh chếvà xác định một sốđặc tính của protease thu được.
Đề xuất
Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi xin đưa ra một sốđề xuất:
1. Tiếp tục tiến hành tinh chế protease ngoại bào (đặc biệt là nattokinase) của
B. subtilis natto thu được từphương pháp kết tủa bằng amoni sulfat 60% bão hòa. 2. Tiếp tục khảo sát độ lặp lại của phương pháp thạch – fibrin đểsơ bộ đánh
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn La Anh, Đặng Thu Hương (2009), “Nghiên cứu tách chiết enzym fibrinase từ chủng B. subtilis NT5 và ứng dụng làm thực phẩm chức năng”,
Hội thảo khoa học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Hà Nội.
2. Bộ Y Tế (2009), Hóa sinh học, Nxb Y học, Hà Nội, tr. 136 – 138, 190. 3. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2007), Công nghệ sinh học –
Enzyme và ứng dụng, Nxb Giáo dục, tập 3, tr. 22 – 28, 174 – 189.
4. Mai Thị Hằng, Đinh ThịKim Nhung, Vương Trọng Hào (2011), Thực hành vi sinh vật học, Nxb Đại học Sư phạm, Hà Nội, tr. 25 – 34, 96 – 100.
5. Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Giáo trình nhập môn công nghệ sinh học, Nxb
Đại học Huế, tp Huế, tr. 209 – 236.
6. Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ Enzym, Nxb Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, tp Hồ Chí Minh, tr. 67 – 96.
7. Đào Thị Mai (2012), Khảo sát khả năng sinh enzym tiêu fibrin của vi khuẩn Bacillus subtilis natto, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr. 23, 30.
8. Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi (2007), Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, Nxb Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tr. 178.
9. Trần Thị Hồng Nghi, Lê Thanh Hùng, Trương Quang Bình (2006), Nghiên cứu ứng dụng enzym protease từ vi khuẩn (Bacillus subtilis) để thủy phân phụ phẩm cá tra, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ
Chí Minh, tp Hồ Chí Minh.
10.Lê Xuân Phương (2008), Thí nghiệm vi sinh vật học, Đại học Đà Nẵng, Đà
Nẵng, tr. 33 – 36, 43 – 49, 87.
11.Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh, Trần Thạnh Phong, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Lê Thị Hương (2012), “Phân lập và tuyển chọn một
số chủng Bacilus sinh tổng hợp nattokinase”, Tạp chí sinh học, 34(3), tr. 99 – 104.
12.Nguyễn Văn Rư (2002), Nghiên cứu tạo chế phẩm protease nguồn gốc động vật, thực vật ứng dụng trong phòng chống suy dinh dưỡng, Luận án tiến sĩ Dược học, tr. 3 – 5, 33 – 36.
13.Bùi Thị Thiết (2012), Tinh chế và chế thử bột chymopapain có thể pha tiêm, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr. 32 – 35.
14.Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú (2012), Công nghệ enzym, Nxb Khoa học và kỹ
thuật, Hà Nội, tr. 25 – 56.
15.Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi (2004), “Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp protease của chủng
Serratia sp. DT3”, Tạp chí Công nghệ sinh học, 2(2), tr. 205 – 216. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
16.Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi (2008), “Nhân dòng, phân tích trình tự
và biểu hiện gen mã hóa subtilisin từ các chủng B. subtilis G1 và RD23 trong
E. coli BL21/pESUb”, Hội nghị Khoa học - Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Quy Nhơn.
17.Nguyễn Văn Thanh (2009), Công nghệ sinh học Dược, Nxb Giáo dục Việt Nam, tr. 149 – 150.
18.Trương Thị Hương Tràm (2010), Bước đầu nghiên cứu khả năng sinh và
tách chiết nattokinase từ đậu tương lên men, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr. 27 – 31.
19.Vũ Đình Vinh, Đặng Hạnh Phức, Đỗ Đình Hồ (1974), Kỹ thuật y sinh hóa,
Nxb Trường Đại học Quân Y, Hà Nội, tr. 243 – 244.
20.Hin Vireak (2012), Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng
tạo enzym protease của vi khuẩn Bacillus subtilis natto, Khóa luận tốt nghiệp
Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr. 23.
21.Astrup, Mullertz S. (1952), “The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity”, Archives of Biochemistry and Biophysics, 40, Denmark, p. 346 – 351.
22.I. Ahmed, Muhammad Anjum Zia (2011), “Purification and kinetic parameters characterization of an alkaline protease produced from Bacillus subtilis through submerged fermentation technique”, World Applied Sciences Journal, 12 (6), p. 751 – 757.
23.S. Almas, Abdul Hameed (2009), “Purification and characterization of a novel protease from Bacillus strain SAL1”, African Journal of Biotechnology, 8(15), p. 3603 – 3609.
24.S. Ashikaga, H. Nanamiya (2000), “Natural genetic competence in Bacillus subtilis natto OK2”, Journal of Bacteriology, 182(9), p. 2411 – 2415. 25.P. Chantawannakul, Anchalee Oncharoena (2002), “Characterization of
proteases of Bacillus subtilis strain 38 isolated from traditionally fermented soybean in Northern Thailand”, Science Asia, 28, p. 241 – 245.
26.C. Dennison (2002), A Guide to protein isolation, Kluwer Academic Publishers, p. 87 – 64, 71 – 108, 129 – 133.
27.Do Thi Bich Thuy, Salil Kumar Bose (2011), “Characterization of multiple extracellular proteases produced by a Bacillus subtilis strain and identification of the strain”, International Journal of Biology, 3(1), p. 101 – 110.
28.G. Das, M.P. Prasad (2010), “Isolation, purification & mass production of protease enzyme from Bacillus subtilis”, International Research Journals of Microbiology, 1(2), p 26 – 31.
29.Paul De Vos et al (2009), Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology – the Firmicutes, 3, Springer Science Business Media, p. 20 – 24.
30.E.M. El - Safey, U.M. Abdul - Raouf (2004), “Production, purification and charactrization of protease enzyme from Bacillus subtilis”, International
conferences for development and the environment in the Arab World, Assiut University, p. 14.
31.M. Fujita et al (1993), “Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto, a popular soybean fermented food in Japan”, Biochemical and Biophysical research communication, p. 1340 – 1347.
32. C. Guang, Wang Gang (2012), “Purification and characterization of Bacillus subtilis nattokinase”, Food science, 33(15), p. 231 – 234.
33.W.A. Hassanein, Y.A. El - Zawahry (2011), “Fibrinolysis and anticoagulant potential of a metallo protease produced by Bacillus subtilis K42”, Journal of Biosciences, 36, p. 773 – 779.
34.M. Haritha, M. Vangalapati (2011), “Nattokinase: A review on fibrinolytic enzyme”, International Journal of Chemical Environmental and Pharmaceutical Research, 2(1), p. 61 – 66.
35.H. Jun, Mei Le-he (2005), “Screening of Bacillus subtilis natto from traditional Japanese Food Natto and separation of Nattokinase”, Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities, 19(4), p. 518 – 522.
36.A. Illanes (2008), Enzyme Biocatalysis – Principles and Applications, Springer Science Publishing, p. 58 – 59.
37.Jian X., Xue – li Z., Guang C. (2005), “Optimization of liquid fermentation conditions of nattokinase”, Journal of Jilin Agricultural University, p. 5. 38.Ji Young Kim, Si Nae Gum (2008), “Effects of nattokinase on blood
pressure: A randomized, controlled trial”, Hypertension Research, 31, p. 1583 – 1588. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
39.T. Kato et al (1992), “Purification of a new extracellular 90 – kDa serine proteinase with isoelectric point of 3.9 from Bacillus subtilis (natto) and elucidation of its distinct mode of action”, Bioscience biotechnology and biochemistry, 56 (7), p. 1166 – 1168.
40.K. Yamane, Hiroshi M. (1974), “Hybrid α – amylases produced by transformants of Bacillus subtilis – Purification and characterization of
extracellular α – amylases produced by the parental strains and transformants”, Biochimica et Biophysica Acta, 365, p. 235 – 247.
41.Lü Ying, Zhang Lu, Feng Lei (2004), “Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis”, China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing.
42.A. Maurer (2010), Gel filtration – Principles and Methods, GE Healthcare UK, p. 57 – 63.
43.F. Mashayekhi Mazar, H. Shahbaz Mohammadi (2012), “Isolation, purification and characterization of a thermophilic alkaline protease from
Bacillus subtilis BP – 36”, Journal of Sciences, 23(1), Islamic Republic of Iran, p. 7 – 13.
44.K. Muramatsu, N. Yamawake (2000), “Purification and crystallization of a new Bacillus subtilis elastase”, Journal of Home Economics of Japan, 51(12), p. 1127 – 1135.
45.Mahmoud, RF Gamal (1978), “Production and chemical studies of protease from Bacillus subtilis (SH-6) Egyptian strain”, Zentralbl Bakteriol Naturwiss, 133(2), p. 121 – 124.
46.Maruyama, Sumi H. (1998), “Effect of natto diet on blood pressure, in basic and clinical aspects of Japanese Traditional Food Natto II”, Japan Technology Transfer Association, p. 1 – 3.
47.P. Mahajan, Sagar V. (2010), “Production of nattokinase using Bacillus natto
NRRL 3666: media optimization, scale up and kinetic modeling”, Food Science and Biotechnology, 19(6), p. 1593 – 1603.
48.M. Fujita, Hong K. (1995), “Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically induced thrombosis model in rat”, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 18(10), p. 1387 – 1391.
49.M. Padmapriya, B. Williams (2012), “Purification and characterization of neutral protease enzyme from Bacillus subtilis”, Journal of Microbiology andBiotechnologyResearch, 2 (4), p. 612 – 618.
50.Noda K., Igata K. (1989), “Synthesis of γ – glytamyl peptides catalyzed by transamidase from Bacillus natto”, Agricultural Biology and Chemistry, 44, p. 2419 – 2423.
51.Eiko Ohta, Yutaka Miura, Yoshio Tozawa (1972), “Fibrin-Agar-Plate method, a new method for estimation of fibrinolytic activity”, Rinsho Ketsueki, 13(5), p. 793 – 799.
52.Chi Hye Park, Sang Jun Lee (2004), “Hetero – and autoprocessing of the extracellular metalloprotease (Mpr) in Bacillus subtilis”, Journal of Bacteriology, 186(19), p. 6457 – 6464.
53.Holsworth (2002), “Nattokinase and Cardiovascular Health”, Special Report, p. 2.
54.R. Dubey, J. Kumar (2011), “Isolation, production, purification, assay and characterization of fibirnolytic enzymes (nattokinase, streptokinase and urokinase) from bacterial sources”, Afican Journal of Biotechnology, 10(8), p. 1408 – 1420.
55.R. Gupta, Q. K. Beg (2002), “Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications”, Applied Microbiology and Biotechnology, 59, p. 15 – 32.
56.A. Sloma, Gerald A. Rufo (1991), “Cloning and characterization of the gene for an additional extracellular serine protease of Bacillus subtilis”, Journal of Bacteriology, 173(21), p. 6889 – 6895.
57.K. Steinkraus (2004), Industrialization of indigenous fermented foods, p. 227 – 230.
58.M. Shimizu (1992), “Purification and Characterization of Phytase from
Bacillus subtilis (natto) N – 77”, Bioscience biotechnology and biochemistry, 56(8),p. 1266 – 1269.
59.R. Sankar, Deepthi Y. (2012), “Purification and characterization of an extracellular alkaline serine protease from Bacillus subtilis NR 18”,
International Journal of Current Research, 4(3), p. 98 – 103.
60.B.V. Reddy, B. Rasmitha Reddy (2013), “Lyophilization (freeze – drying) – a review”, International Journal of Pharma World Research, 4(1), p. 1 – 20. 61.Seki T., Oshima T. (1975), “Taxonomic study of Bacillus by deoxyribonucleic acid – deoxyribonucleic acid hybridization and interspecific transformation”, International Journal of Systematic Bacteriology, 25(3), p. 258 – 270.
62.Sumi Hiroyuki, Yoshikawa Misako (1999), “Elastase activity in Natto, and its relation to nattokinase”, Nippon Nogeikagaku Kaishi, 73(11), p. 1187 – 1190.
63.Sun Yan, Wang JiaQi (2011), “Screening of protease and cellulase producing
Bacillus subtilisnatto strain and its growth characteristics”, Dongbei Nongye Daxue Xuebao Journal, 42(3), p. 39 – 43. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
64.Shogo Tokudome, Kazunobu Omura (2005), “A newly derived protein from
Bacillus subtilis natto with both antithrombotic and fibrinolytic effects”,
Journal of Pharmacological Sciences, 99, p. 247 – 251.
65.Tamang J., Thapa S. (2002), “Phylogenetic analysis of Bacillus strains isolated from fermented soybean foods of Asia: Kinema, Chungkokjang and Natto”, Journal of Hill Resarch, 15(2), p. 56 – 62.
66.Tran L., X.C.Wu, S. L.Wong (1991), “Cloning and expression of a novel protease gene encoding an extracellular neutral protease from Bacillus subtilis”, Journal of bacteriology, 173, p. 6364 – 6372.
67. C. Wang, Ming Du (2009), “Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis natto B – 12”, Journal of Agricultural and food chemistry article, 57, p. 9722 – 9729.
68.Xie Qiuling Guo Jong (1999), “ The optimization of fermentation conditions of nattokinase”, Journal of south China university of technology (natural science), p. 5.
69.Jen - Kuo Yang, Ing - Lung Shih (2000), “Production and purification of protease from a Bacillus subtilis that can deproteinize crustacean wastes”,
Enzyme and Microbial Technology, 26, p. 406 – 413.