a) Xác định nồng độ protein
Nguyên tắc: Định lượng protein toàn phần trong mẫu thử bằng kỹ thuật Gornall dựa trên nguyên tắc của phản ứng Biuret. Các liên kết peptid của protein khi phản ứng với ion Cu++ trong môi trường kiềm sẽ cho phức hợp màu tím, độđậm màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong mẫu thử. [12]
Tiến hành:
Xây dựng biểu đồ mẫu: Từ dung dịch protein chuẩn 1% và dung dịch đệm có pH thích hợp pha chính xác thành các dung dịch protein có nồng độ từ 1,0 đến 10,0mg/ml và thực hiện phản ứng như sau: Thành phần 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Protein mẫu (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 0 Dung dịch đệm (ml) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1,0 Nồng độ protein (mg/ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 0 Thuốc thử Gornall (ml) 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Lắc đều, để các ống 30 phút ở nhiệt độ phòng. Tiến hành đo quang phổ hấp thụ của các dung dịch ởbước sóng thích hợp. Từ kết quảđo quang dựng biểu đồ thể
hiện mối quan hệ giữa nồng độ protein C (mg/ml) – mật độ quang D. [12] Hệ số protein Ki: Ki = Nồng độ protein/Mật độ quang.
Hệ số trung bình Ktb: Ktb =∑ Ki/n.
(n: tổng số mẫu chuẩn; với thí nghiệm trên n = 10)
Nồng độ protein C: C = Ktb x D
Nguyên tắc: Dưới tác dụng của enzym, một phần protein bị thủy phân, giải phóng các acid amin tan trong acid tricloroacetic. Phần protein còn lại sau phản ứng bị tủa trong acid tricloroacetic. Định lượng protein còn lại bằng phương pháp Biuret như mục a phần 2.3.5. [12]
Tiến hành: Pha loãng dịch chiết enzym đến khi đạt nồng độ thích hợp bằng dung dịch đệm. Thực hiện phản ứng với cơ chất là casein (dung dịch 1%). Chuẩn bị
3 ống nghiệm và sử dụng hóa chất như sau:
Ống cơ chất Ống chứng Ống thử
Casein 1% (ml) 1 0 1
Dung dịch đệm (ml) 1 1 1
Dung dịch thử (ml) 0 1 1
Để các ống nghiệm vào tủ ấm 370C/1 giờ cho phản ứng xảy ra. Sau đó cho
vào mỗi ống nghiệm 3ml dung dịch tricloroacetic 10% để ngừng phản ứng. Lắc đều,
để 10 phút ở nhiệt độ phòng. Li tâm 4.000 vòng/10 phút để thu tủa. Hòa tan tủa bằng dung dịch đệm và tiến hành phản ứng Biuret. [12]
+ Cách tính kết quả:
Dựa trên biểu đồ mẫu, tính ra lượng casein bị thủy phân P = P1 + P2 – P3
Trong đó: P1 là lượng protein trong ống cơ chất (mg)
P2 là lượng protein trong ống chứng (mg)
P3 là lượng protein trong ống thử (mg)
Hoạt độ enzym: Từnăm 1972; khái niệm đơn vị hoạt độ enzym Katal (Kat)
được đưa ra: 1 Katal là lượng enzym có khảnăng xúc tác làm chuyển hóa 1 mol cơ
chất sau 1 giây ởđiều kiện tiêu chuẩn. Đơn vịđo mức độ phân giải protein của chế
phẩm enzym được dùng là nanoKatal (nKat): 1nKat = 10-9 Kat. [8],[36] Mức độ phân giải protein (MDP) được tính theo công thức:
MDP =P. B. L. 10
M. m. T (nKat)
Trong đó: P là lượng protein (mg) bị thủy phân (tính theo biểu đồ mẫu)
M là trọng lượng phân tử gam của protein (của casein là 23.600) L là số liên kết peptid của phân tử protein (của casein là 209) T là thời gian thủy phân (3.600 giây)
m là lượng chế phẩm enzym dùng thử nghiệm (ml hay mg)