Xác định pH của dịch nghiên cứu. Sau đó phân phối dịch vào các cốc có mỏ
(10ml/1 cốc). Điều chỉnh pH đến giá trị pH nghiên cứu bằng cách thêm từng giọt dung dịch NaOH 0,1M hoặc HCl 0,1M (có kết hợp khuấy từ). Để ổn định 1 giờ ở
nhiệt độ phòng. Tiến hành thử khảnăng phân giải casein của dịch nghiên cứu trước
và sau khi đã điều chỉnh pH theo mục a phần 2.3.2. [67]
2.3.4. Phương pháp chiết tách và tinh sạch protease
a) Phương pháp chiết tách protease bằng amoni sulfat
Nguyên tắc: Khi thêm muối vào dung dịch protein enzym; tính tan của
protein enzym tăng nhẹ (salting in) ở nồng độ muối thấp và giảm mạnh (salting out)
ở nồng độ muối cao. Sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình solvat hóa, giảm tính hòa tan của protein enzym dẫn đến sự tủa. [5],[26]
Tiến hành:
Dịch chiết enzym thô được giữ ở nhiệt độ 40C/1 giờ. Thêm dần dần amoni sulfat vào 100ml dịch chiết enzym thô đến khi đạt nồng độ amoni sulfat bão hòa theo yêu cầu. Sau khi muối tan hết, để yên 1 giờ. Li tâm dịch chiết với tốc độ
15.000 vòng/20 phút ở nhiệt độ 40C để thu riêng tủa enzym. Hòa tan tủa enzym vào 10ml dung dịch đệm thu được dịch enzym. [23],[59]
Kết tủa phân đoạn protein enzym
Ở nồng độ amoni sulfat bão hòa đầu tiên, tiến hành tương tựnhư trên. Sau khi li tâm với tốc độ 15.000 vòng/20 phút ở nhiệt độ 40C để tách riêng tủa enzym; phần dịch còn lại được thêm dần dần amoni sulfat đến khi đạt nồng độ amoni sulfat bão hòa thứ hai. Sau khi muối tan hết, để yên 1 giờ. Li tâm với tốc độ 15.000 vòng/20 phút ở nhiệt độ 40C để tách riêng phần tủa và dịch. Phần tủa được hòa tan vào 10ml dung dịch đệm. Phần dịch lại được thêm amoni sulfat đến khi đạt nồng độ
amoni sulfat bão hòa thứ ba. Lặp lại các bước cho đến nồng độ amoni sulfat bão hòa cuối cùng. [59]
b) Phương pháp tinh sạch protease bằng sắc ký lọc gel Sephadex G – 75
Nguyên tắc: Khi nạp mẫu vào cột sắc kí có pha tĩnh là các hạt gel xốp; các phân tử mẫu có kích thước lớn hơn kích thước của lỗ gel sẽ đi vào khoảng trống giữa các hạt gel và ra khỏi cột trước. Các phân tử có kích thước nhỏ khuếch tán tối
đa vào trong các hạt gel và ra khỏi cột sau. [6],[14],[26],[42]
Tiến hành: Ngâm gel Sephadex G –75 trong dung dịch đệm trong 24 giờđể gel trương nở hoàn toàn.
Cho một lớp bông thủy tinh vào đáy cột sắc kí. Gel Sephadex G–75 được
đưa vào cột cùng với dung dịch đệm qua phễu một cách từ từ (tránh tạo bọt khí và phân lớp). Để gel lắng xuống dưới tác dụng của trọng lực. Tiếp tục đổ gel vào cột
cho đến khi gel trong cột cao được khoảng 15cm. Đặt lên trên bề mặt gel một khoanh giấy lọc để cân bằng gel. Cho dung dịch đệm chảy qua cột với tốc độ
khoảng 7 ml/giờ trong vài giờđểổn định cột.
Mẫu cần tinh chế loại muối được đưa vào cột. Chờ30 phút để mẫu ngấm hết xuống. Thêm dung dịch đệm vào cột và thu mỗi phân đoạn 1ml. Đánh giá sơ bộ quá
trình lọc gel kết thúc: Cho dung dịch chảy ra từ cột phản ứng với dung dịch BaCl2, nếu tạo thành tủa trắng không tan trong dung dịch HCl loãng thì quá trình lọc gel kết thúc. Rửa cột bằng dung dịch đệm trong khoảng 3 giờ. [13],[26]
2.3.5. Phương pháp Biuret xác định nồng độ protein và hoạt độ protease
a) Xác định nồng độ protein
Nguyên tắc: Định lượng protein toàn phần trong mẫu thử bằng kỹ thuật Gornall dựa trên nguyên tắc của phản ứng Biuret. Các liên kết peptid của protein khi phản ứng với ion Cu++ trong môi trường kiềm sẽ cho phức hợp màu tím, độđậm màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong mẫu thử. [12]
Tiến hành:
Xây dựng biểu đồ mẫu: Từ dung dịch protein chuẩn 1% và dung dịch đệm có pH thích hợp pha chính xác thành các dung dịch protein có nồng độ từ 1,0 đến 10,0mg/ml và thực hiện phản ứng như sau: Thành phần 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Protein mẫu (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 0 Dung dịch đệm (ml) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1,0 Nồng độ protein (mg/ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 0 Thuốc thử Gornall (ml) 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Lắc đều, để các ống 30 phút ở nhiệt độ phòng. Tiến hành đo quang phổ hấp thụ của các dung dịch ởbước sóng thích hợp. Từ kết quảđo quang dựng biểu đồ thể (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
hiện mối quan hệ giữa nồng độ protein C (mg/ml) – mật độ quang D. [12] Hệ số protein Ki: Ki = Nồng độ protein/Mật độ quang.
Hệ số trung bình Ktb: Ktb =∑ Ki/n.
(n: tổng số mẫu chuẩn; với thí nghiệm trên n = 10)
Nồng độ protein C: C = Ktb x D
Nguyên tắc: Dưới tác dụng của enzym, một phần protein bị thủy phân, giải phóng các acid amin tan trong acid tricloroacetic. Phần protein còn lại sau phản ứng bị tủa trong acid tricloroacetic. Định lượng protein còn lại bằng phương pháp Biuret như mục a phần 2.3.5. [12]
Tiến hành: Pha loãng dịch chiết enzym đến khi đạt nồng độ thích hợp bằng dung dịch đệm. Thực hiện phản ứng với cơ chất là casein (dung dịch 1%). Chuẩn bị
3 ống nghiệm và sử dụng hóa chất như sau:
Ống cơ chất Ống chứng Ống thử
Casein 1% (ml) 1 0 1
Dung dịch đệm (ml) 1 1 1
Dung dịch thử (ml) 0 1 1
Để các ống nghiệm vào tủ ấm 370C/1 giờ cho phản ứng xảy ra. Sau đó cho
vào mỗi ống nghiệm 3ml dung dịch tricloroacetic 10% để ngừng phản ứng. Lắc đều,
để 10 phút ở nhiệt độ phòng. Li tâm 4.000 vòng/10 phút để thu tủa. Hòa tan tủa bằng dung dịch đệm và tiến hành phản ứng Biuret. [12]
+ Cách tính kết quả:
Dựa trên biểu đồ mẫu, tính ra lượng casein bị thủy phân P = P1 + P2 – P3
Trong đó: P1 là lượng protein trong ống cơ chất (mg)
P2 là lượng protein trong ống chứng (mg)
P3 là lượng protein trong ống thử (mg)
Hoạt độ enzym: Từnăm 1972; khái niệm đơn vị hoạt độ enzym Katal (Kat)
được đưa ra: 1 Katal là lượng enzym có khảnăng xúc tác làm chuyển hóa 1 mol cơ
chất sau 1 giây ởđiều kiện tiêu chuẩn. Đơn vịđo mức độ phân giải protein của chế
phẩm enzym được dùng là nanoKatal (nKat): 1nKat = 10-9 Kat. [8],[36] Mức độ phân giải protein (MDP) được tính theo công thức:
MDP =P. B. L. 10
M. m. T (nKat)
Trong đó: P là lượng protein (mg) bị thủy phân (tính theo biểu đồ mẫu)
M là trọng lượng phân tử gam của protein (của casein là 23.600) L là số liên kết peptid của phân tử protein (của casein là 209) T là thời gian thủy phân (3.600 giây)
m là lượng chế phẩm enzym dùng thử nghiệm (ml hay mg)
2.3.6. Phương pháp điện di SDS – PAGE
Nguyên tắc của phương pháp điện di: Trong môi trường pH khác pI của protein, protein sẽtích điện trên bề mặt và chuyển dịch vềphía điện cực trái dấu khi có dòng điện chạy qua: protein tích điện càng lớn sẽ di chuyển càng nhanh trong (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
điện trường và ngược lại. Nhờđó có thể phân tách riêng biệt các protein có trọng
lượng phân tử khác nhau bằng phương pháp điện di. [14],[26]
Tiến hành: Các protein biến tính được tải vào các giếng trên bản gel
polyacrylamid, đặt trong đệm thích hợp. Khi đặt dòng điện một chiều với hiệu điện thế phù hợp vào, các protein tích điện âm sẽ dịch chuyển qua gel với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào kích thước và trọng lượng phân tử của chúng. Sau điện di, gel
được nhuộm bằng thuốc nhuộm thích hợp. Các protein khác nhau sẽ xuất hiện ở các
băng phân biệt trong gel. [26]
2.3.7. Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính phân giải fibrin
Nguyên tắc: Nattokinase có khả năng phân giải fibrin. Dựa trên nguyên tắc của phương pháp khuếch tán qua giếng thạch, tiến hành thử khả năng phân giải fibrin bằng cách tạo ra môi trường thử: thạch – fibrin; với mục đích sơ bộxác định sự có mặt của nattokinase trong mẫu nghiên cứu sau khi đã có kết quả trọng lượng phân tử của protein enzym. Thời điểm phối hợp fibrin với môi trường thạch là khi
môi trường thạch đạt nhiệt độ 450C để tránh làm phân hủy fibrin. [51]
Tiến hành: Tạo 20ml hỗn dịch fibrin trong nước; cho vào cốc có mỏ 200ml.
Đun chảy 80ml dung dịch thạch 2,5%. Để thạch nguội đến 450C và phối hợp với hỗn dịch fibrin theo nguyên tắc đồng lượng. Đổ16ml môi trường thử trên vào các
đĩa petri. Khi thạch đông thì đục các giếng thạch có đường kính 0,6cm. Nhỏ 0,05ml dịch thử vào giếng thạch, ủ trong tủ ấm 370C/18 giờ. Quan sát vòng phân giải fibrin
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ – BÀN LUẬN
3.1. Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp trong quá trình tách chiết protease từmôi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto
3.1.1. Sơ bộ xác định các enzym có mặt trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto natto
Môi trường nuôi cấy được chọn là môi trường canh thang do môi trường này
hay được sử dụng để nhân giống B. subtilis natto và B. subtilis [22],[23],[28],[43], [49],[67]. Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy lần lượt là 370C và 24 giờ để tối ưu hóa
khả năng sinh tổng hợp protease của B. subtilis nói chung và B. subtilis natto nói riêng [22],[25],[37],[47],[49],[59],[68]; đồng thời hạn chế lượng cellulose (đạt tối
đa sau 48 giờ nuôi cấy [63]).
Theo các nghiên cứu đã được công bố, trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto có nhiều loại enzym khác nhau [40],[57],[58],[63],[70]. Vì vậy, thí nghiệm
được tiến hành để sơ bộ xác định sự tồn tại của một số enzym, đặc biệt là các protease ngoại bào của B. subtilis natto.
Mục đích: Bước đầu khảo sát sự tồn tại của các enzym trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto.
Tiến hành: Nuôi cấy B. subtilis natto theo phương pháp được nêu ra trong mục c phần 2.3.1. Li tâm dịch lên men (4.000 vòng/20 phút) để thu riêng phần dịch nổi hay dịch trong. Thử khả năng phân giải casein, tinh bột, CMC của dịch trong
theo các phương pháp được nêu ra trong phần 2.3.2. Mẫu trắng là môi trường canh thang không cấy B. subtilis natto và được điều chỉnh pH tương đương với pH dịch trong. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Kết quả: Kết quả thí nghiệm được thể hiện trên bảng 3.1.
Bảng 3.1: Sơ bộ thử hoạt tính các enzym trong dịch nuôi cấy B. subtilis natto
Lần thí nghiệm Đường kính vòng phân giải casein (mm) Khảnăng phân giải tinh bột Khảnăng phân giải CMC Dịch trong Mẫu trắng Dịch trong Mẫu trắng Dịch trong Mẫu trắng Lần 1 18,3 (-) (+) (-) (+) (-)
Lần2 18,9 (-) (+) (-) (+) (-)
Lần 3 18,7 (-) (+) (-) (+) (-)
Trung bình 18,6 (-) (+) (-) (+) (-) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chú thích (+): Xuất hiện vòng phân giải cơ chất
(-): Không xuất hiện vòng phân giải cơ chất
Nhận xét: Kết quả đưa ra trên bảng 3.1 cho thấy trong cả 3 lần thí nghiệm, dịch trong thu được từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto đều có khảnăng phân
giải cơ chất casein, tinh bột, CMC. Mẫu trắng không cho vòng phân giải cơ chất do
đó đã loại trừđược ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả thí nghiệm.
Kết luận sơ bộ: Trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto có mặt cả
protease, amylase và cellulase.
Bàn luận: Kết quả thí nghiệm phù hợp với kết quả nghiên cứu về các loại enzym có mặt trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto. Trong phạm vi đề tài này,
enzym được quan tâm là protease; được sơ bộ xác định bằng khả năng phân giải casein. Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới [31],[35],[39],[44],[62],[64],[67],[73] và kết quả của Đào Thị Mai năm 2012 (tiến hành trên cùng giống vi khuẩn) [7], protease tập trung chủ yếu trong phần dịch nổi hay dịch trong. Kết quả vòng phân giải casein của dịch trong ở thí nghiệm này (18,6mm) phù hợp với kết quả thí nghiệm của Đào Thị Mai năm 2012 (18,4mm) [7] và Hin Virek năm 2012
(17,9mm) [20].
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym protease ngoại bào của B. subtilis natto B. subtilis natto
Thí nghiệm dựa trên phương pháp nghiên cứu của Cong Wang (2009) và R. Dubey (2011) khi khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease của dịch chiết enzym [67],[55]. Theo kết quả của Lu Ying năm 2004, khoảng pH được lựa chọn để
khảo sát từ 4 – 11 [41].
Mục đích: Xác định giá trị pH tối ưu cho hoạt tính phân giải casein của protease ngoại bào sinh ra bởi B. subtilis natto; nhằm lựa chọn hệđệm có pH thích hợp hòa tan tủa enzym trong bước chiết tách.
Tiến hành: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng phân giải casein của dịch trong theo phương pháp được nêu ra trong phần 2.3.3. Các giá trị pH được khảo sát là 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 và pH của dịch trong. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Kết quả: pH trung bình của dịch trong là 7,58. Kết quả đường kính vòng phân giải casein của dịch trong tại các giá trịpH khác nhau được thể hiện trên bảng 3.2.
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym protease của dịch trong
pH Đường kính vòng phân giải casein (mm) pH Đường kính vòng phân giải casein (mm) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 4 (-) (-) (-) 8 18,2 18,6 18,3 5 10,0 10,8 10,4 9 17,2 18,0 17,4 6 15,4 16,2 15,8 10 14,8 15,4 15,4 7 17,6 18,2 17,8 11 (-) (-) (-) 7,58 18,3 18,9 18,7
Ghi chú (-): Không xuất hiện vòng phân giải cơ chất
Kết quả trung bình đường kính vòng phân giải casein của dịch trong tại các giá trịpH khác nhau được thể hiện trên đồ thị hình 3.1
Hình 3.1: Kết quả trung bình đường kính vòng phân giải casein tại các giá trị pH khác nhau 10.5 15.8 17.9 18.6 18.4 17.5 15.2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 4 5 6 7 7.58 8 9 10 11 d (mm) Đ ư ờ n g k ín h v ò n g p h â n g i ả i c a se in pH
Nhận xét: Kết quảđưa ra trên bảng 3.2 và đồ thị hình 3.1 cho thấy khảnăng
phân giải casein của dịch trong thay đổi theo pH. Đường kính vòng phân giải casein
đạt giá trị lớn nhất (trung bình 18,6mm) tại pH dịch trong khi chưa điều chỉnh: 7,58. Ngoài ra, tại các giá trị pH = 7 và pH = 8, đường kính vòng phân giải casein cũng tương đối lớn (trung bình 17,9mm và 18,4mm). Khảnăng phân giải casein của dịch trong bị giảm mạnh ở pH <6 và pH >10, đặc biệt tại giá trị pH = 4 và pH = 11 không thấy xuất hiện vòng phân giải casein.
Kết luận sơ bộ: Protease ngoại bào của B. subtilis natto hoạt động tối ưu ở
pH trung tính và kiềm nhẹ (khoảng pH 6 – 9), bị bất hoạt ở pH <5 và hoạt tính giảm
ở pH ≥10. Hoạt tính enzym protease mạnh nhất ở pH = 7,58. Do đó dung dịch đệm phosphat có pH = 7,6 được sử dụng cho giai đoạn chiết tách và tinh chế protease.
Bàn luận: Kết quả thí nghiệm phù hợp với nhiều kết quả nghiên cứu vềảnh
hưởng của pH đến hoạt tính của nattokinase theo Lu Ying năm 2004 (enzym ổn
định trong khoảng pH từ 5 – 10) [41], Cong Wang năm 2009 (khoảng pH tối ưu từ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
6 – 9) [67], Bai Zhen năm 2004 (pH tối ưu là 7,5) [72], Zhu Jianhui năm 2006 (pH
tối ưu là 7,4) [74]; hoạt tính của elastase theo K. Muramatsu năm 2000 (khoảng pH tối ưu từ 8 – 9) [44]. Tuy nhiên cũng có nghiên cứu đã đưa ra kết quảkhác như pH
tối ưu cho hoạt tính của protease serin có TLPT 90kDa là 10 [39].
Việc lựa chọn hệ đệm phosphat dựa trên các nghiên cứu về ảnh hưởng của một số hệđệm đến hoạt tính enzym protease của B. subtilis. Nhiều nghiên cứu gần
đây đã lựa chọn hệ đệm phosphat là hệ đệm tối ưu cho hoạt tính enzym protease như nghiên cứu của J. Yang năm 2000 [69], I. Ahmed năm 2011 [22], Hassanein
năm 2011 [33], M. Padmapriya năm 2012 [49]… Nghiên cứu của Mahmoud năm
1978 [45] và E. M. El-Safey năm 2004 [30] cho thấy hệđệm phosphat có một sốưu điểm sau:
+ Là hệđệm không làm giảm hoạt tính của protease như hệđệm borat. + Hoạt tính enzym protease trong hệ đệm phosphat cao hơn khi so sánh với hoạt tính enzym protease trong hệđệm citrat.
+ Có sự liên quan giữa sự có mặt của ion phosphat với sựổn định hoạt tính enzym protease của B. subtilis.
Các thí nghiệm do Trương ThịHương Tràm tiến hành năm 2010 và Đào Thị
Mai tiến hành năm 2012 trong điều kiện tương tự cũng sử dụng hệđệm phosphat để