Do điều kiện phòng thí nghiệm, tủa enzym thu được từ môi trường nuôi cấy
B. subtilis natto trong đề tài được tinh chế bằng phương pháp sắc kí lọc gel Sephadex G – 75. Đây là bước tinh chếđầu tiên được Huang Jun sử dụng năm 2005
[35] và là bước tinh chế thứhai được Cong Wang sử dụng năm 2009 [67].
Mục đích: Tinh chế loại muối còn lẫn trong protein enzym thu được từbước kết tủa enzym bằng amoni sulfat 60% bão hòa; sơ bộ tiến hành tách loại amylase và cellulase ra khỏi protease.
Tiến hành: Sử dụng phương pháp sắc kí lọc gel Sephadex G – 75 để tinh chế
các bước được nêu ra trong mục b phần 2.3.4. Thử khả năng phân giải casein, tinh bột, CMC của các phân đoạn thu được theo phương pháp được nêu ra trong phần
2.3.2. Định lượng protein và xác định hoạt độ protease của phân đoạn tối ưu theo
các phương pháp được nêu ra trong phần 2.3.5. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Mẫu trắng sử dụng là dung dịch đệm phosphat pH = 7,6 sau khi chảy qua cột sắc kí lúc
chưa cho mẫu vào. Kết quả:
Sau khi chạy sắc kí lọc gel thu được 12 phân đoạn đã được loại sạch amoni sulfat.
Kết quả thử khảnăng phân giải casein của 12 phân đoạn được thể hiện trên
bảng 3.7. Mẫu trắng không cho vòng phân giải casein nên đã loại trừ được ảnh
hưởng của nền mẫu đến kết quả thí nghiệm.
Bảng 3.7: Kết quả thử khảnăng phân giải casein của các phân đoạn thu được sau tinh chế
N0 Đường kính vòng phân giải casein của 12 phân đoạn (mm)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 10,0 12,1 15,3 14,8 15,7 17,3 16,8 17,6 19,6 22,0 19,4 18,4 2 10,5 12,6 15,7 15,2 16,4 17,8 17,4 18,0 20,2 22,4 20,1 18,6 3 10,2 12,5 15,5 15,1 15,9 17,4 17,3 17,5 19,7 22,3 19,6 18,9 Kết quả trung bình đường kính vòng phân giải casein của các lần thí nghiệm
Hình 3.4: Mối liên hệ giữa hoạt tính enzym protease của các phân đoạn và thể tích rửa giải (Ve )
Nhận xét: Kết quảđưa ra trên bảng 3.7 và đồ thị hình 3.4 cho thấy xuất hiện
3 đỉnh có hoạt tính enzym protease cao tương ứng với ba phân đoạn 3, 6,10; trong
đó phân đoạn 10 có hoạt tính enzym protease cao nhất.
Kết quả sơ bộ xác định sự có mặt của amylase và cellulase trong các phân
đoạn được thể hiện trên bảng 3.8. Mẫu trắng không cho vòng phân giải tinh bột và
CMC nên đã loại trừđược ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả thí nghiệm.
Bảng 3.8: Đánh giá sự có mặt của amylase và cellulase trong các phân đoạn
Enzym cần
đánh giá
Các phân đoạn thu được
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Amylase (–) (–) (+) (–) (+) (+) (–) (–) (–) (+) (+) (+)
Cellulase (–) (–) (–) (–) (+) (+) (+) (+) (+) (–) (–) (–)
Chú thích (+): Xuất hiện vòng phân giải cơ chất
(–): Không xuất hiện vòng phân giải cơ chất
Nhận xét: Kết quảđưa ra trên bảng 3.8 cho thấy tuy phương pháp sắc kí lọc gel Sephadex G – 75 đã loại được amoni sulfat ra khỏi các phân đoạn thu được;
nhưng trong những phân đoạn có hoạt tính enzym protease cao, các enzym tạp
10.2 12.4 15.5 15 16 17.5 17.2 17.7 19.8 22.2 19.7 18.6 0 5 10 15 20 25 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Đ ư ờ n g k ín h v ò n g p h â n g i ả i ca se in Ve d (mm)
(amylase, cellulase) không được tách biệt hoàn toàn ra khỏi protease. Tuy nhiên, một sốphân đoạn đã phân tách được amylase hoặc cellulase như: phân đoạn 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Phân đoạn 10 là phân đoạn cho đường kính vòng phân giải casein cao nhất được định lượng protein và xác định hoạt độ protease. Hai phân đoạn 6 và 10
(hai phân đoạn xuất hiện đỉnh trên đồ thị hình 3.4) được sử dụng làm mẫu để điện di.
Kết quả định lượng protein và xác định hoạt độ protease qua các giai đoạn
được thể hiện trên bảng 3.9.
Bảng 3.9: Kết quảcác giai đoạn tách chiết và tinh chế protease
Giai đoạn V Pt P At A Ap Hiệu quả Mức tinh sạch Dịch trong 100 972,603 9,726 434,709 4,347 0,447 100 1 Dịch enzym 60% 10 213,699 21,370 172,536 17,254 0,807 39,69 0 1,805 Phân đoạn 10 1 11,153 11,153 27,221 27,221 2,441 6,262 5,461
Chú thích V: thể tích dung dịch (ml) At: hoạt độ protease tổng (nKat) = A x V Pt: protein tổng số (mg) = P x V A: hoạt độ protease (nKat/ml)
P: nồng độ protein (mg/ml) Ap: hoạt tính riêng = At/Pt
Hiệu quả (Yield): hoạt tính còn lại sau mỗi giai đoạn = At giai đoạn sau/At dịch chiết ban đầu (100)
Mức tinh sạch (Purification fold) = hoạt tính riêng sau mỗi bước tinh sạch/hoạt tính riêng của dịch ban đầu
Bàn luận: Dựa trên kết quả bảng 3.9, có thểđưa ra một số bàn luận sau: Về hiệu quả và mức tinh sạch của chế phẩm thu được: Nhìn chung các nghiên cứu về chiết tách protease từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto có hiệu quảkhá dao động (từ10% đến gần 80%), mức tinh sạch cũng có sự khác biệt rất lớn (từ 6 lần đến hơn 40 lần) [31],[32],[35],[39],[44],[64],[67]. Kết quả thí nghiệm được tiến hành so sánh với kết quả theo nghiên cứu của Cong Wang năm 2009 [67].
Theo kết quả của thí nghiệm, hiệu quả và mức tinh sạch của bước kết tủa enzym bằng amoni sulfat lần lượt là 39,690% và 1,805 thấp hơn so với kết quả của
Cong Wang là 52,1% và 2,3 [67]. Có nhiều nguyên nhân có thể giải thích cho sự sai
khác này như:
+ Sự khác biệt vềđiều kiện nuôi cấy do điều kiện nuôi cấy trong phạm vi đề tài chưa được tối ưu hóa cho khảnăng sinh tổng hợp protease của B. subtilis natto.
+ Sự khác biệt về chất lượng hóa chất sử dụng.
Hiệu quả và mức tinh sạch của enzym ởbước tinh chế bằng phương pháp sắc kí lọc gel Sephadex G – 75 lần lượt là 6,262% và 5,461. Hiệu quả thấp được giải thích do trong phạm vi đề tài mới tiến hành định lượng protein và xác định hoạt độ
protease của một phân đoạn có hoạt tính enzym protease cao nhất; trong khi nghiên cứu của Cong Wang sử dụng tất cảcác phân đoạn thu được để tiếp tục tiến hành các
bước tinh chế tiếp theo [67].
Tuy nhiên, so với kết quả hiệu quả là 0,18% theo quy trình của Xiaoyan Zu
năm 2010 tiến hành theo phương pháp khác [73]; thì hiệu quả của quy trình này có thể chấp nhận được.