Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên khả năng tạo enzym của vi khuẩn

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC ÁNH KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG LÊN KHẢ NĂNG TẠO ENZYM CỦA VI KHUẨN Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC ÁNH KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG LÊN KHẢ NĂNG TẠO ENZYM CỦA VI KHUẨN Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đàm Thanh Xuân Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp dược HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Với kính trọng lòng biết ơn sâu sắc xin gửi lời cảm ơn đến cô giáo, TS Đàm Thanh Xuân DS Lê Ngọc Khánh, người thầy tận tình hướng dẫn bảo cho tơi thời gian làm khóa luận Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên môn Công Nghiệp Dược tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian nghiên cứu để hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian học tập trường Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè ln giúp đỡ, động viên suốt thời gian học tập vừa qua Hà Nội, ngày 21 tháng năm 2013 Sinh viên Nguyễn Ngọc Ánh Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis natto 1.1.1 Phân loại khoa học .2 1.1.2 Nguồn gốc .2 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.1.4 Đặc điểm sinh dưỡng 1.1.5 Đặc điểm sinh lý 1.1.6 Sản phẩm trao đổi chất B subtilis natto 1.2 Natto Nattokinase .4 1.2.1 Natto .4 1.2.2 Các enzym có khả tiêu huyết khối trước Nattokinase 1.2.3 Nattokinase 1.3 Quá trình lên men sản xuất enzym 10 1.3.1 Các phương pháp lên men sản xuất enzym từ vi sinh vật 10 1.3.2 Thu nhận chế phẩm enzym 11 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới tổng hợp enzym 11 1.4 Các nghiên cứu ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả sinh enzym Nattokinase vi khuẩn 12 1.4.1 Ngoài nước 13 1.4.2 Trong nước 13 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị sử dụng .14 2.1.1 Vi sinh vật sử dụng .14 2.1.2 Nguyên liệu, hóa chất sử dụng: 14 2.1.3 Các môi trường sử dụng: 14 2.1.4 Thiết bị 15 2.1.5 Dụng cụ 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1 Phân lập vi khuẩn B subtilis natto từ sản phẩm Natto xác định enzym Bacillus subtilis natto tạo 16 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện dinh dưỡng lên khả tạo enzym B subtilis natto 16 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 16 2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn từ sản phẩm Natto 16 2.3.2 Phương pháp nhuộm Ogiestka 17 2.3.3 Phương pháp giữ giống thạch nghiêng 17 2.3.4 Phương pháp nhân giống môi trường lỏng 17 2.3.5 Phương pháp lên men chìm vi khuẩn 18 2.3.6 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng lên khả sinh enzym 18 2.3.7 Phương pháp xác định có mặt enzym sản phẩm Natto 19 2.3.8 Phương pháp xác định enzym dịch sinh khối dịch lên men vi khuẩn Bacillus subtilis natto 19 2.3.9 Phương pháp thử hoạt tính protease: 19 2.3.10 Phương pháp thử hoạt tính amylase 20 2.3.11 Phương pháp thử hoạt tính cellulase: 20 2.3.12 Phương pháp thử hoạt tính fibrinolytic (tiêu fibrin) 21 CHƯƠNG BA: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1 Phân lập vi khuẩn B subtilis natto từ chế phẩm Natto xác định enzym vi khuẩn sinh 22 3.1.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis natto từ chế phẩm Natto .22 3.1.2 Xác định số enzym vi khuẩn sinh 23 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 3.1.3 Xác định enzym sản phẩm Natto .25 3.2 Khảo sát ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả sinh enzym vi khuẩn B subtilis natto .26 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng nguồn hydratcarbon 26 3.2.2 Lựa chọn nồng độ maltose thích hợp 30 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng đậu tương chất cảm ứng 32 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng số muối vô 34 3.2.5 Xây dựng môi trường tổng hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis natto sinh protease 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1: Thành phần 100g Natto Bảng 2.2: Thực phẩm chức chứa Nattokinase Bảng 2.1 Các nguyên liệu, hóa chất sử dụng 14 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng 15 Bảng 3.1 Kết định tính enzym dịch ly tâm sinh 24 khối Bảng 3.2 Hoạt tính enzym thể đường kính vòng phân 25 giải chất dịch enzym chiết từ phần hạt đậu phần dịch nhớt Natto Bảng 3.3 Hoạt tính protease dịch lên men ni cấy 27 mơi trường MT2 mơi trường MT2 có bổ sung nguồn hydratcarbon khác thể đường kính vòng phân giải casein Bảng 3.4 Hoạt tính amylase cellulase dịch lên men 27 nuôi cấy mơi trường MT2 mơi trường MT2 có bổ sung nguồn hydratcarbon khác thể đường kính vòng phân giải chất Bảng 3.5 Thời gian tiêu fibrin dịch lên men thu nuôi 29 cấy mơi trường có bổ sung nguồn hydratcarbon khác Bảng 3.6 Hoạt tính protease dịch lên men nuôi cấy 30 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi môi trường MT2 mơi trường MT2 có bổ sung maltose nồng độ khác thể đường kính vòng phân giải casein Bảng 3.7 Hoạt tính amylase cellulase dịch lên men 31 nuôi cấy mơi trường MT2 có bổ sung maltose nồng độ khác thể đường kính vòng phân giải chất Bảng 3.8 Hoạt tính protease dịch lên men nuôi cấy 32 môi trường MT2 mơi trường MT2 có bổ sung đậu tương casein thể đường kính vòng phân giải chất Bảng 3.9 Hoạt tính enzyme dịch lên men nuôi cấy 34 môi trường MT2 MT2 có bổ sung số muối vơ cơ, thể đường kính vòng phân giải chất Bảng 3.10 Hoạt tính enzyme dịch lên men ni cấy 36 môi trường MT2 môi trường tổng hợp, thể đường kính vòng phân giải chất Bảng 3.11 Thời gian tiêu fibrin dịch lên men thu nuôi cấy môi trường canh thang môi trường tổng hợp 37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ Tên hình Trang Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis natto Hình 1.2 Cấu trúc bậc Nattokinase Hình 1.3 Cơ chế tiêu fibrin Nattokinase Hình 3.1 Ảnh khuẩn lạc phân lập hình ảnh tế bào vi 22 khuẩn soi kính hiển vi độ phóng đại 1.000 lần Hình 3.2 Kết thử hoạt tính protease, amylase, cellulase 24 dịch ly tâm dịch chiết từ sinh khối Hình 3.3 Biểu đồ thể ảnh hưởng nguồn hydratcarbon 28 đến hoạt tính enzym vi khuẩn Hình 3.4 Biểu đồ so sánh khả sinh enzym Bacillus subtilis natto nuôi cấy môi trường MT2 môi trường tổng hợp 37 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Tên đầy đủ B subtilis natto Bacillus subtilis natto E coli Escherichia coli CU Caseinolytic units FU Fibrinolytic units U Unit t- PA Tissue plasminogen activator γ – PGA γ - polyglutamat Na CMC Natri carboxymethylcellulose 29 lên men B subtilis natto môi trường MT2 so với môi trường MT2 có bổ sung nguồn hydratcarbon khác Bảng 3.5 Thời gian tiêu fibrin dịch lên men thu ni cấy mơi trường có bổ sung nguồn hydratcarbon khác nhau: Môi trường Thời gian tiêu fibrin (phút) MT2 >300 MT2 +2% lactose >300 MT2 + 2% saccharose 250 MT2 + 2% glucose 230 MT2 + 2% maltose 210 Nhận xét: Kết bảng 3.5 cho thấy thời gian tiêu fibrin tăng dần theo thứ tự: MT2 + 2% maltose < MT2 + 2% glucose < MT2+ 2% saccharose < MT2 + 2% lactose, MT2 Như vậy, bổ sung maltose vào môi trường canh thang giúp vi khuẩn sinh nhiều enzym tiêu fibrin (có thể Nattokinase) Bàn luận: Nguồn hydratcarbon có ảnh hưởng quan trọng đến trình phát triển sản sinh enzym vi khuẩn Nhiều nghiên cứu tối ưu hóa nguồn hydratcarbon cho vi khuẩn sản xuất lượng lớn protease Nattokinase tiến hành Các nghiên cứu K Gouda cộng (2005) 30 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus xác định cám bột mì, rỉ đường maltose nguồn hydratcarbon giúp sinh nhiều protease kiềm Deepak cộng (2008) nghiên cứu tối ưu hóa mơi trường cho sinh tổng hợp Nattokinase từ chủng Bacillus subtilis, Junguo Liu cộng (2006) tối ưu hóa điều kiện dinh dưỡng cho sinh tổng hợp Nattokinase từ chủng B subtilis natto NLSSE, Li Hui Rong (2011) HU Ling-li cộng (2011) tối ưu hóa nguồn carbon cho B subtilis natto sản xuất Nattokinase xác định maltose nguồn hydratcarbon thích hợp nồng độ maltose nghiên cứu chưa thống [11], [15], [19], [20] Như vậy, nhiều nghiên cứu trước kết khóa luận cho thấy bổ sung Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 30 maltose có khả làm giúp vi khuẩn sản xuất lượng protease tốt nhất, protease lại có khả tiêu fibrin tốt nuôi cấy môi trường MT2 Vì vậy, thí nghiệm nhằm lựa chọn nồng độ maltose thích hợp để bổ sung 3.2.2 Lựa chọn nồng độ maltose thích hợp Mục đích: Khảo sát để tìm nồng độ maltose cho vi khuẩn sinh nhiều protease sinh enzym khác Tiến hành: - Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn B subtilis natto mơi trường MT2 có bổ sung nồng độ maltose khác nhau: 2%, 4%, 6%, 8% theo phương pháp lên men chìm mơ tả mục 2.3.5 - Tiến hành thử hoạt tính enzym dịch ly tâm thu từ môi trường nuôi cấy phương pháp mô tả mục 2.3.9, 2.3.10, 2.3.11 Thí nghiệm tiến hành lần, lấy kết trung bình Kết trình bày bảng 3.6, 3.7 Bảng 3.6 Hoạt tính protease dịch lên men nuôi cấy môi trường MT2 môi trường MT2 có bổ sung maltose nồng độ khác thể đường kính vòng phân giải casein Môi trường Dp (mm) ∆p1 % MT2+ 2% maltose 18,0 0% MT2+ 4% maltose 16,7 – 7,2% MT2+ 6% maltose 17,1 – 5% MT2+ 8% maltose 18.2 1,1% (Ghi chú: Dp : đường kính vòng phân giải casein trung bình, ∆p1%: % tăng giảm Dp so với MT2 bổ sung % maltose, cách tính ∆% sau: dịch lên men mơi trường A có Dp = a, MT2 bổ sung 2% maltose có Dp = b ∆p1% = a b x 100%, ∆%< 0: môi trường A có Dp nhỏ ∆p1% so với MT2 bố sung 2% b maltose, ∆p%> 0: mơi trường A có Dp lớn ∆p1% so với MT2 bố sung 2% maltose) 31 Bảng 3.7 Hoạt tính amylase cellulase dịch lên men nuôi cấy môi trường MT2 có bổ sung maltose nồng độ khác thể đường kính vòng phân giải chất Amylase Cellulase Môi trường Da (mm) ∆a1 Dc (mm) ∆a2 MT2+ 2% maltose 13.3 0% 12.0 0% MT2+ 4% maltose 12.3 7,5% 12.0 0% MT2+ 6% maltose 11.2 15,8% 11.2 – 6,7% MT2+ 8% maltose 13.3 0% 12.5 + 4,2% (Ghi chú: Da , Dc : đường kính vòng phân giải tinh bột, Na CMC trung bình; ∆a1%, ∆c1%: % tăng giảm Da , Dc so với MT2 bổ sung 2% maltose, cách tính tương tự ∆p1% trên) Nhận xét: Các kết bảng 3.6, 3.7 cho thấy: - Kích thước vòng phân giải casein mơi trường MT2 có bổ sung nồng độ maltose 2% 8% lớn (lần lượt 18,0 mm 18,2 mm) Tuy nhiên, nồng độ maltose 8% cho đường kính vòng phân giải casein lớn 1,1% so với nồng độ maltose 2% Còn so sánh kích thước vòng phân giải tinh bột NaCMC ta thấy với nồng độ maltose bổ sung vào MT2 6% vòng phân giải tinh bột NaCMC có đường kính nhỏ nhất, nhỏ Nồng độ maltose 6% cho đường kính vòng phân giải tinh bột NaCMC nhỏ 15,8% 6,7% so với nồng độ maltose 2% Nồng độ maltose 8% cho đường kính vòng phân giải NaCMC tinh bột lớn nồng độ 2% Vì thế, kết hợp mục đích làm tăng lượng protease hạn chế sinh enzym khác, nồng độ maltose 2% lựa chọn bổ sung vào môi trường canh thang Bàn luận: Có nhiều nghiên cứu tối ưu hóa nồng độ maltose để vi khuẩn sản xuất nattokinase protease kết không thống nhất, song nồng độ tối ưu nghiên cứu thường 5% Junguo Liu cộng (2006) tối ưu hóa điều kiện dinh dưỡng cho sinh tổng hợp Nattokinase từ chủng B subtilis natto NLSSE sử dụng maltose 2% [18] LiHuiRong (2011) xác định maltose % nguồn Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 32 hydratcarbon tốt cho Bacillus subtilis natto sản xuất nattokinase [16] HU Ling-li cộng (2011) xác định maltose 1% nguồn hydratcarbon thích hợp [17] Như vậy, nồng độ maltose 2% lựa chọn nguồn hydratcarbon bổ sung vào môi trường nuôi cấy 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng đậu tương chất cảm ứng lên khả tạo enzym vi khuẩn B subtilis natto Mục đích: So sánh khả sinh enzym vi khuẩn B subtilis natto nuôi cấy môi trường MT2 MT2 bổ sung đậu tương (dạng hạt dạng bột, MT2 bổ sung chất cảm ứng tạo protease (casein) để lựa chọn bổ sung vào môi trường nuôi cấy Tiến hành: - Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn B subtilis natto môi trường: MT2 môi trường MT2 bổ sung 2% riêng loại đậu tương dạng hạt dạng bột, MT2 bổ sung chất cảm ứng tạo protease casein với nồng độ 0,5% theo phương pháp mô tả mục 2.3.6 - Tiến hành thử hoạt tính enzym dịch ly tâm thu từ môi trường nuôi cấy phương pháp mô tả mục 2.3.9, 2.3.10, 2.3.11 Thí nghiệm tiến hành lần, lấy kết trung bình Kết trình bày bảng 3.8 Bảng 3.8 Hoạt tính protease dịch lên men nuôi cấy môi trường MT2 mơi trường MT2 có bổ sung đậu tương casein thể đường kính vòng phân giải chất Hoạt tính enzym thể đường kính vòng phân giải chất (mm) Mẫu thử Protease Amylase Cellulase Dp ∆p2% Da ∆a2% Dc MT2 18,0 0% 17,9 0% 18,1 0% MT2+ 2% đậu hạt 21,1 17,2% 20,3 13,4% 22,3 23,2% ∆c2% 33 MT2+ 2% bột đậu 22,5 25,0% 20,8 16,2% 22,5 24,3% MT2+ 0,5% casein 22,8 26,7% 18,9 5,6% 18,4 1,6% (Ghi chú: Dp , Da , Dc : đường kính vòng phân giải casein, tinh bột, NaCMC trung bình, ∆p2 %, ∆a2%, ∆c2% : % tăng Dp , Da , Dc so với MT2, cách tính tương tự cách tính ∆p% mục 3.2.1) Nhận xét: Số liệu bảng 3.8 cho thấy bổ sung đậu tương dạng hạt dạng bột vào mơi trường MT2 đường kính vòng phân giải casein, tinh bột, Na CMC tăng, nghĩa hoạt tính tất enzym tăng, bố sung bột đậu cho đường kính vòng phân giải casein lớn bổ sung đậu tương dạng hạt Điều giải thích đậu tương dạng hạt khả đồng hóa protein vi khuẩn thấp đậu tương dạng bột vi khuẩn phải phá lớp vỏ hạt đậu Bổ sung đậu tương cho đường kính vòng phân giải casein lớn nhiều so với MT2 (lớn 21,1% - 22,5% so với MT2) Tuy nhiên bổ sung casein lại cho đường kính vòng phân giải casein lớn hai dạng đậu (lớn 22,8% so với MT2) Mặt khác, bổ sung đậu tương lại làm cho đường kính vòng phân giải tinh bột Na CMC tăng lên nhiều (13,4% - 24,3%) bổ sung casein đường kính vòng phân giải tinh bột Na CMC tăng không đáng kể (lần lượt 5,6% 1,6%) Vì thế, casein chọn bổ sung vào môi trường nuôi cấy Bàn luận: Để tăng tổng hợp enzym người ta thường bổ sung chất cảm ứng, chất thường chất tương ứng enzyme cần tổng hợp Casein tên nhóm protein chủ yếu có sữa, casein thường dùng làm chất cảm ứng cho vi khuẩn sản xuất protease Hin Vireak (2012) khảo sát ảnh hưởng chất cảm ứng đến khả sinh protease vi khuẩn B subtilis natto xác định casein nồng độ 0,5% cho lượng enzym lớn Trong môi trường MT2 có nguồn nitơ hữu pepton cao thịt, mặt khác bổ sung đậu tương vào mơi trường MT2 khơng có hiệu tăng protease bổ sung casein mà lại làm tăng lượng amylase cellulase casein lựa chọn bổ sung vào môi trường MT2 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 34 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng số muối vô Tiến hành: - Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn B subtilis natto môi trường MT2, MT2 bổ sung số muối vô theo phương pháp mô tả mục 2.3.6 - Tiến hành thử hoạt tính protease, amylase, cellulase dịch ly tâm thu từ môi trường nuôi cấy theo phương pháp mô tả mục 2.3.9, 2.3.10, 2.3.11 Thí nghiệm tiến hành lần, lấy kết trung bình Kết trình bày bảng 3.9 Bảng 3.9 Hoạt tính enzyme dịch lên men nuôi cấy môi trường MT2 MT2 có bổ sung số muối vơ cơ, thể đường kính vòng phân giải chất Hoạt tính enzym thể đường kính vòng phân giải chất (mm) Mẫu thử Protease Dp ∆p3% Amylase Da ∆a3% Cellulase Dc ∆c3% MT2 18,5 0% 17,6 0% 18,1 0% MT2 + 0,05% CaCl2 21,3 15,1% 18,7 6,2% 18,4 1,6% MT2+ 0,05 % MgSO4 20,7 11,9% 19,5 10,8% 19,1 5,5% MT2+ 0,05% MnCl2 19,8 7,0% 20,5 16,5% 18,9 4,4% (Ghi chú: ∆p3%, ∆a3%, ∆c3% : % tăng Dp , Da , Dc so với MT2, cách tính tương tự cách tính ∆p% mục 3.2.1) Nhận xét: Số liệu bảng 3.9 cho thấy bổ sung CaCl2, MgSO4, MnCl2 vào mơi trường canh thang dịch ni cấy có đường kính vòng phân giải casein, 1tinh bột, NaCMC tăng nghĩa hoạt tính tất enzym tăng, bổ sung CaCl2 đường kính vòng phân giải casein lớn (tăng 21,3% so với MT2) đường kính vòng phân giải tinh bột NaCMC tăng thấp so với MT2 35 (tăng 6,2% 1,6% so với mơi trường MT2) Vì CaCl2 lựa chọn làm muối vô bổ sung vào môi trường Bàn luận: Các yếu tố khống có ảnh hưởng rõ rệt đến trình sinh tổng hợp enzym Deepak cộng (2008) nghiên cứu tối ưu hóa mơi trường cho sinh tổng hợp Nattokinase từ chủng Bacillus subtilis, hoạt tính enzym lớn có mặt 0,2% MgSO4 0,5% CaCl2 [10] Junguo Liu cộng (2006) xác định 0,64% CaCl2 tối ưu cho sinh tổng hợp Nattokinase sử dụng chủng Bacillus subtilis natto NLSSE [18] Li Hui Rong (2011) xác định muối vô cần thiết để tối ưu hóa sản xuất Nattokinase từ B subtilis natto MgSO4 0,05%, CaCl2 0,02%, KH2PO4 0,4% [16] Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng tích cực muối vô đến khả sinh protease vi khuẩn Tuy nhiên, nồng độ muối cao kìm hãm phát triển vi khuẩn [4] Do đó, khóa luận lựa chọn bổ sung CaCl2 nồng độ 0,05% vào môi trường nuôi cấy 3.2.5 Xây dựng môi trường tổng hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis natto sinh protease a Xây dựng môi trường tổng hợp: Qua khảo sát tiến hành, nghiên cứu lựa chọn thành phần bổ sung vào môi trường MT2 giúp vi khuẩn B subtilis natto môi trường tổng hợp gồm thành phần sau: - Cao thịt: 0,5% - Pepton: 1% - NaCl: 0,5 % - Maltose: 2% - Casein: 0,5% - CaCl2: 0,05% - Nước máy vừa đủ: 100ml b So sánh khả sinh enzym so với môi trường canh thang môi trường tổng hợp: Tiến hành: Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 36 - Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn B subtilis natto môi trường MT2 môi trường tổng hợp theo phương pháp lên men chìm mơ tả mục 2.3.5 - Tiến hành thử hoạt tính enzym dịch ly tâm thu từ môi trường nuôi cấy phương pháp mô tả mục 2.3.9, 2.3.10, 2.3.11 - Tiến hành thử hoạt tính tiêu fibrin dịch ly tâm thu từ môi trường nuôi cấy phương pháp mô tả mục 2.3.12 Thí nghiệm tiến hành lần, lấy kết trung bình Kết trình bày bảng 3.10, 3.11 Bảng 3.10 Hoạt tính enzym dịch lên men nuôi cấy môi trường MT2 mơi trường tổng hợp, thể đường kính vòng phân giải chất Hoạt tính enzym thể đường kính vòng phân giải chất (mm) Mẫu thử Protease Amylase Cellulase Dp ∆p4% Da ∆a4% Dc ∆c4% MT2 17,5 0% 17,6 0% 18,1 0% Môi trường tổng hợp 21,3 21,7% 18,7 6,25% 18,4 1,66% (Ghi chú: ∆p4%, ∆a4%, ∆c4%: % tăng giảm Dp , Da , Dc môi trường tổng hợp so với MT2, cách tính quy ước tương tự ∆p% mục 3.2.1) Nhận xét: số liệu bảng 3.10 cho thấy mơi trường tổng hợp có đường kính vòng phân giải casein lớn 21,7% so với môi trường MT2, đường kính vòng phân giải tinh bột Na CMC lớn môi trường MT2 6,25% 1,66% Như vậy, môi trường tổng hợp giúp vi khuẩn sinh nhiều protease đồng thời lượng amylase cellulase tăng khơng đáng kể 37 Hoạt tính enzym thể d 25 20 15 MT2 MTTH 10 Protease Amylase Cellulase Enzyme (Ghi chú: P: protease, A: amylase, C: cellulase, MTTH: môi trường tổng hợp, d: đường kính vòng phân giải chất) Hình 3.4 Biểu đồ so sánh khả sinh enzyme B subtilis natto nuôi cấy môi trường MT2 môi trường tổng hợp Để xác định hiệu tiêu fibrin protease vi khuẩn nuôi cấy môi trường tổng hợp sinh ra, thí nghiệm thiết kế nhằm so sánh khả sinh enzym tiêu fibrin môi trường MT2 so với môi trường tổng hợp Kết thể bảng 3.11 Bảng 3.11 Thời gian tiêu fibrin dịch lên men thu nuôi cấy môi trường canh thang môi trường tổng hợp Môi trường Thời gian (phút) MT2 >300 Môi trường tổng hợp 180 Nhận xét: Thời gian tiêu fibrin dịch lên men Bacillus subtilis natto môi trường tổng hợp 180 phút, nhỏ môi trường MT2 (trên 300 phút) Vì thế, mơi trường tổng hợp giúp vi khuẩn sinh nhiều enzym tiêu fibrin Bàn luận chung phần 3.2: Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 38 Khi bổ sung 2% loại đường khác nhau: glucose, maltose, saccharose, lactose vào môi trường MT2 để nuôi cấy vi khuẩn B subtilis natto khả sinh protease vi khuẩn mơi trường có bổ sung maltose lớn enzym khác (amylase, cellulase) tăng không đáng kể, khả sinh cellulase giảm Vì thế, maltose chọn bổ sung vào môi trường nuôi cấy Qua khảo sát nồng độ maltose khác nhau, nồng độ maltose 2% thích hợp để bổ sung vào mơi trường nuôi cấy Khảo sát đậu tương casein bổ sung vào mơi trường MT2 khả sinh protease tăng cao so với MT2, bổ sung đậu tương amylase, cellulase tăng nhiều bổ sung casein tăng khơng đáng kể Vì thế, casein lựa chọn bổ sung vào MT2 Tiếp tục khảo sát muối vơ CaCl2 bổ sung thích hợp Tổng hợp kết thí nghiệm, khóa luận xây dựng mơi trường tổng hợp gồm MT2 bổ sung thành phần: maltose, casein, CaCl2 So sánh hoạt tính enzym dịch lên men thu sau nuôi cấy với vi khuẩn B subtilis natto thấy mơi trường tổng hợp giúp vi khuẩn sinh nhiều protease đồng thời amylase cellulase tăng không đáng kể Mặt khác, thử hoạt tính tiêu fibrin cho thấy protease có khả tiêu fibrin tốt nuôi vi khuẩn với mơi trường MT2 Vì thế, mơi trường tổng hợp giúp vi khuẩn Bacillus subtilis natto tăng khả sinh protease tiêu fibrin, Nattokinase 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT I Kết luận Qua q trình nghiên cứu, khóa luận thu kết sau đây: - Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis natto từ sản phẩm Natto thương mại xác định vi khuẩn sinh enzym ngoại bào là: protease, amylase, cellulase enzym protease có khả tiêu fibrin - Xác định mơi trường tổng hợp giúp vi khuẩn sinh nhiều protease có khả tiêu fibrin sinh amylase, cellulase môi trường canh thang bổ sung 2% maltose; 0,5% casein; 0,05% CaCl2 II Đề xuất Để đề tài hoàn thiện hơn, xin đưa số đề xuất: - Khảo sát số thông số khác trình ni cấy ảnh hưởng đến khả sinh enzym Bacillus subtilis natto như: nhiệt độ, điều kiện cấp khí, pH mơi trường - Xây dựng phương pháp chiết tách tinh chế Nattokinase từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Bộ Y tế (2009), Dược thư quốc gia Việt Nam, Hội đồng Dược điển Việt Nam, tr.150, 1045- 1132 Nguyễn Thị Bình (2010), Nghiên cứu hoạt tính tiêu Fibrin Natokinase từ đậu tương lên men, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Hoàng Thị Khánh Hồng (2012), Biểu tiết enzyme Nattokinase tái tổ hợp Bacillus subtilis, Luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzyme, Nhà xuất Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, tr.289 – 308 Lương Đức Phẩm (2010), Giáo trình Cơng nghệ lên men, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam, tr.7- 64 Lê Xn Phương (2008), Giáo trình thí nghiệm vi sinh vật, Đại học Đà Nẵng Lê Thị Bích Phượng cộng (2012), “Phân lập tuyển chọn số chủng Bacillus sinh tổng hợp Nattokinase”, Tạp chí sinh học (34), tr.99- 104 Hin Vireak (2012), Khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả tạo enzyme protease vi khuẩn Bacillus subtilis natto, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội Tài liệu tiếng Anh: R Dubey, J Kumar, D Agrawala, T Char and P Pusp (2011), “Isolation, production, purification, assay and characterization of fibrinolytic enzymes (Nattokinase, Streptokinase and Urokinase) from bacterial sources”, African Journal of Biotechnology Vol.10(8), pp.1408-1420 10 V Deepak et al (2008), “Optimization of media composition for Nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology”, Bioresource Technology (99), pp.8170-8174 11 Fujita M, Hong K, Ito Y, et al (1995), “Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically induced thrombosis model in a rat”, Biol Pharm Bull Vol.18(10),, pp.1387-1391 12 Fujita M, Nomura K et al (1993), “Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto, a popular soybean fermented food in Japan”, Biochemical and Biophysical Research Communication 197(3), pp.1340-1347 13 Yiu H Hui, Lisbeth Meunier- Goddik, Jiste Josephsen, Wai-Kit Nip (2005), Handbook of Food and Beverage Fermentation Technology, pp.612-620 14 Yasuhiro Inatsu et al (2002), “Characterization of Bacillus subtilis strains isolated from fermented soybean foods in southeast Asia: comparison with B subtilis (natto) starter strains”, Japan agricultural research quarterly vol.36(3), pp.169-175 15 Kato, Keitaro et al (2003), “Barley and yam Natto”, United States Patent, US 6669971B1 16 Li Hui Rong (2011), “The optimization, extraction and purification of Nattokinase and genetic cloning”, Master's thesis, Hebei Union University (China) 17 HU Ling-li et al ( 2011), “Optimization of liquid fermentation conditions of Nattokinase”, Chemistry and Bioengineering (1), pp.120- 125 18 Junguo Liu, Jianmin Xing, Tianshi Chang, Zhiya Ma, Huizhou Liu (2005), “Optimization of nutritional conditions for nattokinase production by Bacillus natto NLSSE using statistical experimental methods”, Process Biochemistry vol.40(8), pp 2757–2762 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 19 Milner M, Makise K (2002), “Natto and its active ingredient nattokinase: a potent and safe thrombolytic agent”, Alternative & complementary therapies, vol 8(3), pp.157-164 20 Qiu D, Fujita K et al (2004), “Comparative analysis of physical maps of four Bacillus subtilis (natto) genomes”, Appl Environ Microbiol (70), pp 6247-6256 21 William Shurtleff, Akiko Aoyagi (2012), History of Natto and Its Relatives, Soyinfo Center 22 Keith H Steinkraus ( 2004), Industrialization of indigenous fermented foods, pp.227-230 23 Sumi H, Hamada H, Tsushima H, Mihara H, Muraki H (1987), “A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet”, Experientia (43), pp.1110-1111 24 Jyoti Prakash Tamang, Kasipathy Kailasapathy (2010), Fermented food and beverage of the world, pp 191-225 25 Cong Wang et al (2009), “Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis natto B-12”, Journal of Agricultural and Food Chemistry (57), pp.9722- 9729 26 Xiaoyan Zu, Zhenya Zhang, YingnanYang, Haitao Che, Guihua Zhang & Ji Li (2010), “Thrombolytic activities of Nattokinase extracted from Bacillus Subtilis fermented soybean curd residues”, International Journal of Biology (2), pp 120125 Tài liệu Internet: 27 http://natto-genome.org/about.html 28 http://nattokinase.org 29 http://thucphamchucnang.net 30 http://www.vedan.com.tw/english/02_products/02_products_01_001.html 31 http://vietsciences.free.fr/timhieu/khoahoc/ykhoa/natto01.html 32 http://vi.wikipedia.org ... Phương pháp khảo sát ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng lên khả sinh enzym Nguyên tắc: So sánh khả sinh enzym vi khuẩn ni cấy mơi trường khác điều kiện nuôi cấy khác - Khảo sát ảnh hưởng nguồn hydratcarbon:... phi 3.1.3 Xác định enzym sản phẩm Natto .25 3.2 Khảo sát ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả sinh enzym vi khuẩn B subtilis natto .26 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng nguồn hydratcarbon... subtilis natto tạo lên men chìm môi trường MT2 - Xác định enzym sản phẩm Natto 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện dinh dưỡng lên khả tạo enzym B subtilis natto - Khảo sát ảnh hưởng nguồn hydratcarbon: