Tài liệu KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở CÂY LÚA (Ozyra sativa L) NUÔI CẤY IN VITRO pdf

Tiến hành nhân sẹo, tạo chồi, tạo rễ từ mô sẹo của giống lúa VĐ20 bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, sau đó khảo sát ảnh hưởng của chủng 1019 lên khả năng phát sinh cơ quan của mô sẹo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

CHU LÝ HẢI ANH

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN

METHYLOBACTERIUM SP LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ

QUAN Ở CÂY LÚA (Ozyra sativa L) NUÔI CẤY IN VITRO

Luận văn kỹ sư Chuyên Ngành: Công nghệ sinh học

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN

METHYLOBACTERIUM SP LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ

QUAN Ở CÂY LÚA (Ozyra sativa L) NUÔI CẤY IN VITRO

Luận văn kỹ sư Chuyên ngành:Công nghệ sinh học

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

PGS TS BÙI VĂN LỆ CHU LÝ HẢI ANH

ThS KIỀU PHƯƠNG NAM Khóa: 2002-2006

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY

STUDYING EFFECT OF METHYLOBACTERIUM SP ON MORPHOGENESIS OF IN VITRO RICE (Ozyra sativa L)

Engineer Thesis Major: Biotechnology

KIỀU PHƯƠNG NAM, MSc Term: 2002 - 2006

HCMC, 09/2006

iv

MỤC LỤC

Trang

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

MỞ ĐẦU ……… 1

TỔNG QUAN……… 3

2.1 Giới thiệu về cây lúa……… 3

2.1.1 Vị trí phân loại……… 3

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố……… 4

2.1.3 Đặc điểm hình thái……… 5

2.1.4 Đặc điểm hạt lúa……… 6

2.2 Ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô trong cải tiến giống lúa……… 7

2.3 Phương pháp nuôi cấy mô, tế bào in vitro………10

2.3.1 Sự tái sinh mẫu cấy (sự tạo cơ quan)……… 10

2.3.2 Sự tạo mô sẹo từ cơ quan……….11

2.3.3 Ảnh hưởng của một số môi trường và điều kiện nuôi cấy trên sự nuôi cấy tế bào……….13

2.3.3.1 Môi trường nuôi cấy………13

2.3.3.2 Các nhân tố vật lý………13

2.3.3.3 Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật……14

2.4 Ảnh hưởng của vi sinh vật lên sự phát triển thực vật……….14

2.5 Đặc điểm của chi Methylobacterium……… 15

2.5.1 Lịch sử phát hiện và phân loại……….15

2.5.2 Đặc điểm sinh thái……….17

2.5.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa……… 18

v

2.5.4 Các ứng dụng của vi khuẩn Methylobacterium sp……… 19

2.5.4.1 Tương tác với thực vật……… 19

2.5.4.2 Sinh tổng hợp auxin và cytokinin……….23

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP………24

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu……….24

3.2 Vật liệu nghiên cứu……….24

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu………24

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu………27

3.2.3 Mẫu cấy và điều kiện nuôi cấy……… 27

3.3.4 Nhân sinh khối và giữ giống vi khuẩn……… 27

3.3.5 Môi trường nuôi cấy……… 28

3.3 Phương pháp nghiên cứu………28

3.3.1 Tạo vật liệu khởi đầu (mô sẹo)……… 28

3.3.2 Nhân sinh khối vi khuẩn……….30

3.3.3 Nội dung thí nghiệm………30

3.3.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20……… 30

3.3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20……… 31

3.3.3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ NAA lên khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo của giống lúa VĐ20……… 31

3.3.3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của chủng 1019 lên khả năng tạo mô sẹo của giống lúa VĐ20………32

3.3.3.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của chủng 1019 lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20……… 33

3.3.3.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20………33

3.3.3.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo của giống lúa VĐ20……… 34

vi

3.3.3.8 Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của chủng 1019 lên khả năng tăng

sinh mô sẹo của giống lúa VĐ20……… 34

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………36

4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20………36

4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20………38

4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ NAA lên khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo của giống lúa VĐ20……….43

4.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của chủng 1019 lên khả năng tạo mô sẹo của giống lúa VĐ20……….45

4.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của chủng 1019 lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20……….47

4.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo của giống lúa VĐ20……….50

4.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ mô sẹo của giống lúa VĐ20………53

4.8 Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của chủng 1019 lên khả năng tăng sinh mô sẹo của giống lúa VĐ20……… 55

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……… 58

5.1 Kết luận……… 58

5.2 Đề nghị……….59 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

MMS : Methanol mineral salts

NAA : α-naphthalene acetic acid

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến kích thước mô sẹo (cm) sau 4 tuần nuôi cấy……… 36 Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến tỷ lệ tái sinh chồi từ mô sẹo……….38 Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ BAP và NAA đến số chồi hình thành từ mô sẹo……….40 Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tỷ lệ tái sinh và số rễ hình thành…43 Bảng 4.5: Ảnh hưởng của chủng 1019 đến tỷ lệ tạo sẹo của hạt lúa……….45 Bảng 4.6: Ảnh hưởng của chủng 1019 đến đường kính mô sẹo………47 Bảng 4.7: Ảnh hưởng của chủng 1019 đến tỷ lế tái sinh chồi và số chồi hình thành

từ mô sẹo………50 Bảng 4.8: Ảnh hưởng của chủng 1019 đến tỷ lế tái sinh rễ và số rễ trên mẫu… 53 Bảng 4.9: Ảnh hưởng của chủng 1019 lên sự tăng sinh mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy……… 55

ix

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: Vi khuẩn có sắc tố hồng ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cây: A: Saintpaulia

ionantha; B: Paulonia fortunei; C: Pacciflora sp [8]……….2

Hình 2.1: Oryza sativa L……… 6

Hình 2.2: Cấu trúc hạt lúa……….7

Hình 2.3: Methylobacterium sp trên cây rêu (A), hình dạng tế bào vi khuẩn chụp

qua kính hiển vi điện tử (B)……….17

Hình 2.4: Methylobacterium sp chủng BJ001 nuôi cấy trên môi trường thạch LB

(A) vào môi trường dịch thể LB (B) chụp qua kính hiển vi điện tử quét [36] 18 Hình 2.5: Sự tái sinh chồi của loài cây thuốc lá chuyển gen ipt trên môi trường

MS không bổ sung hormone sau một tháng nuôi cấy (a): không bổ sung vi khuẩn

Methylovorus mays (b): có bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays[21]……….20

Hình 3.1: Giống lúa VĐ20: (a) hạt chưa bóc vỏ trấu, (b) hạt bóc vỏ trấu…… 24

Hình 3.2: Hạt lúa đã khử trùng trên môi trường tạo sẹo……….29 Hình 4.1: Mô sẹo trên môi trường MS bổ sung 0,5mg/l BAP và 1mg/l NAA sau 5 tuần nuôi cấy (1.1)……… 37 Hình 4.2: Các mô sẹo ở thí nghiệm 1 sau 5 tuần nuôi cấy……….38 Hình 4.3: Mô sẹo tái sinh chồi trên môi trường MS bổ sung 2mg/l BAP và 1mg/l NAA sau 5 tuần nuôi cấy………42 Hình 4.4: Các mẫu mô tái sinh chồi ở thí nghiệm 2 sau 5 tuần nuôi cấy………42 Hình 4.5: Mô sẹo tái sinh rễ trên môi trường MS bổ sung 1,5mg/l NAA sau 5 tuần nuôi cấy………44 Hình 4.6: Các mẫu mô tái sinh rễ ở thí nghiệm 3 sau 5 tuần nuôi cấy…………45 Hình 4.7: Sự tạo mô sẹo trên môi trường MS bổ sung 2mg/l 2,4-D: (a) có bổ sung 1ml dung dịch khuẩn, (b) không có bổ sung khuẩn sau 2 tuần nuôi cấy……….47 Hình 4.8: Sự tăng sinh mô sẹo trên môi trường MS bổ sung 1mg/l BAP và 0,5mg/l NAA: (a) bổ sung 0,5ml dung dịch vi khuẩn, (b) không bổ sung khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy………49

x

Hình 4.9: Sự tăng sinh mô sẹo trên môi trường MS bổ sung 1mg/l BAP, 0,5mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (5.4)………49 Hình 4.10: Sự tái sinh chồi trên môi trường MS bổ sung 2mg/l BAP, 1mg/l NAA

và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (6.2)……… 52 Hình 4.11: Sự tái sinh chồi trên môi trường MS bổ sung 2mg/l BAP, 1mg/l NAA

và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (6.4)……… 52 Hình 4.12: Sự tái sinh rễ trên môi trường MS bổ sung 1,5mg/l NAA và 0,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (7.2)……… 54 Hình 4.13: Sự tái sinh rễ trên môi trường MS bổ sung 1,5mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (7.4)……… 55 Hình 4.14: Sự tăng sinh mô sẹo ở thí nghiệm 8 trên môi trường MS không bổ sung hormone: (a) không có bổ sung khuẩn, (b) bổ sung 0,5ml dung dịch vi khuẩn, (c)

bổ sung 1ml dung dịch vi khuẩn, (d) bổ sung 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy……… 57

xi

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3: Đường cong tăng trưởng của chủng 1019……… 26

Đồ thị 4.1: Kích thước mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy ở các nghiệm thức khác nhau36

Đồ thị 4.2: Tỷ lệ tái sinh chồi ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian…… 39

Đồ thị 4.3: Số chồi hình thành trên mẫu ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian……….40

Đồ thị 4.4: Tỷ lệ rễ tái sinh và số rễ hình thành ở các nghiệm thức khác nhau sau 2 tuần……….43

Đồ thị 4.5: Tỷ lệ tạo mô sẹo ở các nghiệm thức khác nhau sau 2 tuần………… 46

Đồ thị 4.6: Kích thước mô sẹo ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian…….48

Đồ thị 4.7: Tỷ lệ tái sinh chồi ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian…… 50

Đồ thị 4.8: Số chồi hình thành trên mẫu ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian……… 51

Đồ thị 4.9: Tỷ lệ rễ tái sinh và số rễ hình thành trên mẫu ở các nghiệm thức khác nhau sau 2 tuần……… 53

Đồ thị 4.10: Số chồi, số rễ hình thành trên mẫu, kích thước mô sẹo ở các nghiệm thức khác nhau sau 4 tuần……… 56

xii

TÓM TẮT

CHU LÝ HẢI ANH, Đại học Nông Lâm TPHCM Tháng 8/2006

“ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN CÂY LÚA (Oryza sativa L.) NUÔI CẤY IN

VITRO”

Giáo viên hướng dẫn:

PGS TS Bùi Văn Lệ

ThS Kiều Phương Nam

Đề tài được thực hiện tại trại thực nghiệm – khoa Sinh học - trường Đại học Khoa học Tự nhiên trên đối tượng là giống lúa VĐ20 và chủng vi khuẩn

Methylobacterium sp 1019 Tiến hành nhân sẹo, tạo chồi, tạo rễ từ mô sẹo của giống lúa VĐ20 bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, sau đó khảo sát ảnh hưởng

của chủng 1019 lên khả năng phát sinh cơ quan của mô sẹo bằng cách bổ sung những nồng độ khuẩn khác nhau vào môi trường nuôi cấy với 34 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại với các chỉ tiêu như tỷ lệ tái sinh, số chồi trên mẫu,

số rễ trên mẫu, đường kính mô sẹo

Những kết quả thu được:

- Chủng 1019 có tác dụng kích thích sự phát triển rễ, ức chế khả năng tái sinh chồi và thay đổi trạng thái, cấu trúc của mô sẹo Chứng tỏ chủng khuẩn có tác động đến quá trình trao đổi chất, sinh lý, sinh hóa của tế bào

mô sẹo, ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của sẹo.

- Chủng 1019 có ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái của giống lúa VĐ20, chiều hướng phát sinh cơ quan tuỳ thuộc vào bản chất của mô cấy

và loài thực vật

- Nồng độ khuẩn cao sẽ ức chế hoàn toàn mô sẹo, không thấy được sự phát

sinh cơ quan từ mô sẹo

xiii

Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến

Phó Giáo sư- Tiến sĩ Bùi Văn Lệ Người đã gợi ý đề tài, luôn giúp đỡ và tận

tình hướng dẫn em trong suốt thời gian làm khoá luận

Thạc sĩ Kiều Phương Nam, đồng hướng dẫn, thầy đã tận tình hường dẫn và

tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khoá luận này

Tiến sĩ Trần Thị Dung, cô đã giảng dạy và truyền đạt cho em nhiều kinh

nghiệm quý giá trong suốt thời gian theo học ở trường

Tiến sĩ Từ Bích Thủy, cô đã truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm làm việc,

trình bày khóa luận và đóng góp những ý kiến quý báu cho khóa luận này

xiv

Em xin chân thành cảm ơn

Tồn thể quí thầy cơ trong bộ mơn Cơng nghệ sinh học Trường Đại học Nơng Lâm TPHCM Những người đã giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quý giá trong thời gian học tập tại trường

Tồn thể quí thầy cơ trong bộ mơn Sinh học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia TPHCM Những người đã tạo điều kiện thuận lợi và đĩng gĩp nhiều ý kiến trong suốt quá trình thực hiện khĩa luận này

Tập thể các bạn sinh viên khĩa DH02SH, Trường Đại học Nơng Lâm TPHCM, và các bạn thân đã giúp đỡ và động viên tơi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện khố luận này

Các anh, chị và các bạn sinh viên khoa Cơng nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia TPHCM, đã giúp đỡ và động viên em trong thời gian thực hiện khĩa luận

Con xin tỏ lịng thành kính và biết ơn Ba, Mẹ Người đã sinh thành và

GIỚI THIỆU

Lúa là cây lương thực quan trọng, là nhu cầu không thể thiếu đối với con

người, đặc biệt ở các nước Châu Á Do đó, việc nghiên cứu, cải tiến và tạo ra các giống lúa có phẩm chất tốt, khả năng chống chịu cao là vấn đề quan tâm của nhiều nhà khoa học

Công nghệ nuôi cấy mô thực vật hiện nay đang phát triển rất mạnh mẽ và ngày càng mang lại hiệu quả kinh tế cao Công nghệ này giúp tạo ra một số lượng lớn cây trồng đồng nhất, duy trì các tính trạng tốt, tạo cây sạch bệnh… Việc nâng cao năng suất lúa bằng cách phối hợp giữa phương pháp thông thường và công nghệ sinh học là chiến lược được nhiều quốc gia quan tâm

Tuy nhiên, một trở ngại cần quan tâm trong nuôi cấy mô thực vật là hiện tượng nhiễm nấm, khuẩn sẽ ảnh hưởng không tốt đến sự sinh trưởng và phát triển của các mô thực vật Nhưng điều đó không có nghĩa là tất cả các loài nấm, khuẩn nhiễm trong môi trường nuôi cấy đều có hại Ngoài ra chính điều kiện vô trùng trong quá trình nuôi cấy đã loại bỏ các mối tương tác có ích giữa thực vật và vi sinh vật Theo một số nghiên cứu, sự hiện diện của một số loài như Bacillus spp [5], Methylobacterium sp [46], [47] trong môi trường nuôi cấy không những

không làm chết mô thực vật mà ngược lại dường như còn kích thích sự sinh trưởng của cây

A B C

Hình 1: Vi khuẩn có sắc tố hồng ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cây:

A: Saintpaulia ionantha; B: Paulonia fortunei; C: Pacciflora sp [9]

Đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành trên cây lúa (Oryza sativa L) và kết quả cho thấy vi khuẩn Methylobacterium sp có khả năng làm gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt, tăng trọng lượng tươi, chiều cao của cây mạ trong điều kiện in vitro

…Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA VI

KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở CÂY LÚA (Oryza sativa L) NUÔI CẤY IN VITRO”

Mục đích

Tìm hiểu ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacterium sp lên sự phát sinh

cơ quan cây lúa: mô sẹo, chồi, rễ

Yêu cầu

Xác định nồng độ kích thích tố thích hợp đến khả năng tạo mô sẹo, nhân

sẹo, tạo chồi, nhân chồi, tạo rễ ở cây lúa bằng phương pháp nuôi cấy in vitro Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacterium sp lên khả năng tạo

mô sẹo, tạo chồi, tạo rễ ở cây lúa

So sánh ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacterium sp với ảnh hưởng của

các kích thích tố lên sự phát sinh cơ quan

TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu về cây lúa

Lúa là cây lương thực chính cho nhiều người và đồng thời lúa gạo cũng tham gia vào các hoạt động kinh tế quan trọng nhất trên thế giới Châu Á là nơi sản xuất 90% tổng sản lượng và cũng là nơi tiêu thụ lúa gạo nhiều nhất Khoảng 85% sản lượng gạo, 72% lúa mì và 19% ngô được con người tiêu thụ trực tiếp [38] Lúa gạo cung cấp 21% năng lượng và 15% protein cho loài người [30]

Từ 1989 trở lại đây, Việt Nam trở thành một trong những nước xuất khẩu gạo hàng đầu trên thế giới Năm 2001 các nước xuất khẩu gạo chính (tính theo triệu tấn) bao gồm: Thái Lan (6,4), Việt Nam (4,0), Trung Quốc (3,0), Mỹ (2,8) (USDA, 2001) 14 năm qua, cây lúa đặc biệt là ở ĐBSCL đã đóng góp cho đất nước gần 8 tỷ USD trị giá xuất khẩu và đã góp phần to lớn cho công cuộc đổi mới

ở Việt Nam có kết quả Tuy sản xuất với số lượng nhiều, nhưng chất lượng và giá gạo xuất khẩu của Việt Nam thường thấp hơn so với một số nước như Thái Lan,

Mỹ, Úc, đặc biệt có sự chênh lệch lớn ở loại gạo đặc sản và gạo cao cấp [8]

Lúa O sativa có 2n = 24 nhiễm sắc thể, thường được phân biệt làm 3

nhóm:

Lúa Indica: thường trồng ở khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, có thân cao,

dễ đổ ngã, nhiều chồi, lá ít xanh và cong và kháng được nhiều sâu bệnh nhiệt đới Hạt gạo dài hoặc trung bình, có nhiều tinh bột Năng suất kém hơn lúa Japonica

Lúa Japonica: thường được trồng ở những vùng ôn đới hoặc những nơi có

độ cao trên 1000 m (trên mặt biển), có thân ngắn, chống đổ ngã, lá xanh đậm, thẳng đứng, ít chồi, hạt gạo thường tròn, ngắn hoặc trung bình, dẻo khi nấu vì ít chất tinh bột Lúa Japonica có năng suất cao

Lúa Javanica (bulu) hay lúa Japonica nhiệt đới được trồng ở Indonexia, có đặc tính ở giữa hai loại lúa Japonica và Indica Hình thức gần giống như lúa Japonica, có lá rộng với nhiều lông và ít chồi Thân cứng, chắc và ít cảm quang Hạt lúa thường có đuôi [7]

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố

Cây lúa được canh tác từ vĩ tuyến 400

phía nam bán cầu đến vĩ tuyến 530của bắc bán cầu, và được trồng từ mặt đất thấp hơn mặt nước biển cho đến độ cao

2000m trên mặt biển Trên thế giới có 20 loài lúa hoang và 2 loài canh tác Cây lúa

hiện được canh tác đại trà để cung cấp lương thực cho con người trên thế giới là

Oryza sativa L ở châu Á, có năng suất cao và được ưa chuộng Loài lúa Oryza glaberrima Steud được canh tác ít hơn ở Tây châu Phi, có năng suất và chỉ số thu hoạch thấp hơn O.sativa

Các cuộc nghiên cứu trên đất gạch bằng trấu trong các thành phố danh tiếng

đổ nát ở Ấn Độ và trong vùng sông Cửu Long như Myanma, Thái Lan, Lào, Campuchia và Việt Nam phát hiện rằng cây lúa trồng ở Đông Dương do phát triển theo 2 ngả: từ Lào theo sông Cửu Long đi xuống phương nam có đặc tính cây lúa Japonica nhiệt đới, một ngả khác từ Ấn Độ qua vịnh Bengal đến bờ biển Đông Dương, với đặc tính của cây lúa Indica Vì vậy, Việt Nam với khí hậu nhiệt đới nằm trong vùng đa dạng sinh thái của thảo mộc gồm cả cây lúa Indica và Japonica nhiệt đới [7]

2.1.3 Đặc điểm hình thái

O sativa là cây thân thảo, hệ thống rễ chùm, sống hằng năm, có thời gian

sinh trưởng thay đổi tùy theo giống lúa, vụ trồng, nơi trồng vá các điều kiện sinh thái và kéo dài trong khoảng từ 75-250 ngày

Cây mọc thẳng đứng hay mọc nghiêng rồi bò dài (lúa nổi), lúa sống ở cạn, đất cao hay nước ngập chân hoặc một phần thân hay trong nước sâu 2-4m

Thân cao từ 70-150cm, một số giống lúa nổi có thân cao 2-3m, hay 5-6m (lúa nổi ở Bangladesh) Đốt thân nhẵn và cách nhau bởi những dóng dài, ngắn khác nhau Phiến lá thẳng hình đều, đầu lá nhọn, bề mặt phiến lá và mép lá đều ráp Bẹ

lá có thìa lìa, lá dìa hình mũi mác hay chẻ đôi, các đầu chẻ đều nhọn

Lúa thường tạo ra thành nhiều nhánh (dảnh lúa: tillers), bao gồm cọng và lá

có hoặc không có bông (panical) Nhánh bậc 1 xuất hiện từ những đốt gần thân chính và nhánh bậc hai, bậc ba xuất hiện từ những nhánh bậc một này Lá mọc liên tiếp trên thân bao gồm bẹ lá bao lấy thân và phiến lá Cổ lá nối giữa phiến lá và bẹ

lá có một lưỡi bẹ và 2 thìa lìa từ cổ lá Bông mọc trên đốt trên cùng của thân từ bên trong lá cờ và mang nhiều hoa trong một bông con Cụm hoa là một chùm thưa, thẳng, hẹp, đầu hơi cong xuống, dài 15-30cm hoặc dài hơn Hoa nhỏ hình thuôn dài, mày hoa thuôn dài hình mũi mác, hoa màu hồng vàng hay màu tím, có hoa lưỡng tính, tự thụ phấn Hoa có 6 nhị đực mảnh, bao phấn dài, bầu hoa có vòi, nhụy ngắn và hai đầu nhụy có lông tơ [28]

Về cơ bản, lúa là cây thích nghi với điều kiện có nước Ba giai đoạn chính trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa theo viện nghiên cứu quốc tế IRRI là:

- Nẩy mầm và sinh trưởng sinh dưỡng

- Giai đoạn phát triển cơ quan sinh sản

- Giai đoạn hạt chín [28]

Hình 2.1: Oryza sativa L

2.1.4 Đặc điểm hạt lúa

Cơ cấu hạt lúa là quả dĩnh nhỏ gồm có:

 Vỏ trấu gồm trấu trên và trấu dưới

 Cám gồm biểu bì, quả bì và chủng bì (nucellus) Màu sắc hạt gạo do lớp chủng bì

 Phôi nhũ gồm có lớp aleuron và phôi nhũ tích tụ tinh bột

 Mầm cây gồm có phôi (mầm) lá, phôi rễ và trụ phôi giữa ở phần dưới của hạt

Hạt lúa là noãn sào thụ tinh đã chín, có hai mày trấu nhỏ trên và dưới, hai

vỏ trấu trên và dưới, cuống trấu ở phần dưới của hạt và đuôi ở chót hạt (ngắn hoặc dài) Một hạt lúa có trọng lượng từ 12 – 44 mg ở 0% ẩm độ

2.2 Ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô trong cải tiến giống lúa

Các tiến bộ mới đây về kỹ thuật sinh học đặc biệt là nuôi cấy mô, tế bào và sinh học phân tử đã mở ra những hướng mới cho việc cải tiến cây lúa có năng suất cao và ổn định, tạo ra cơ hội tốt để hoàn thiện các mục tiêu chọn giống mà trước đây chúng ta không thể làm được Phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phương pháp nhân giống lý tưởng không chỉ do đòi hỏi ít diện tích, nhanh mà còn

giữ nguyên được tính ưu việt của giống ban đầu Trong quá trình nghiên cứu cơ sở

di truyền của sự biến đổi các tế bào thực vật nuôi cấy, người ta thấy rằng công nghệ nuôi cấy tế bào cho chúng ta lợi thế quan trọng làm thay đổi giống cây trồng

theo hướng có lợi [4] Bên cạnh đó nuôi cấy in vitro góp phần quan trọng trong

việc tạo ra các vật liệu cần thiết như chồi, phôi mầm… cho các phương pháp chọn lọc giống, phương pháp chuyển nạp gen trên lúa và các đối tượng thực vật khác

* Nuôi cấy túi phấn

Nuôi cấy túi phấn để phát triển các dòng đồng hợp tử hay dòng đơn bội kép

Sự tái sinh cây trồng từ túi phấn chỉ giới hạn trong kiểu gen japonica, nó có nhược điểm là khá năng trồng cây lai rất thấp nhất là đối với các giống lúa indica Cho đến nay kỹ thuật này chỉ mới thành công để cái tiến các giống lúa japonica ở Trung Quốc, Hàn Quốc [57]

* Cứu sống phôi mầm

Cứu sống phôi mầm để tạo ra con lai đặc biệt: các loài hoang dại là nguồn phong phú của các gen hữu ích Phôi mầm 10 ngày tuổi được tách ra và cấy vào môi trường, tiếp tục hồi giao với giống lúa trồng để có con lai vừa nhận được gen cần thiết của lúa hoang và dạng hình cải tiến của lúa trồng Kỹ thuật này thành công trong việc khai thác nguồn gen kháng rầy nâu, rầy lưng trắng trong tổ hợp lai

giữa O officinalis và O sativa [42]

* Khai thác biến dị tế bào soma và chọn lọc các đột biến có ích trong nuôi cấy

mô tế bào

Tính chất biến dị này đã được biết với các đột biến như đặc tính kháng bệnh, kháng mặn, kháng độ độc nhôm, đặc tính chiều cao và thời gian sinh trưởng Trên lúa, Oono (1981, 1983) đã ghi nhận sự biến dị của một số đặc tính con lai trong nuôi cấy mô, quan sát dòng R2 có 52% biểu hiện dạng hình mới [51], [52], [58] Schaeffer và cs (1984) đã tìm thấy biến dị đối với đặc tính dạng hạt, hàm lượng protein, chiều cao, số chồi khi nuôi cấy túi phấn của giống Calrose 76 [56] Nguồn biến dị được kích thích bởi kỹ thuật nuôi cấy mô của con lai cần được nhấn mạnh

đặc biệt về cách du nhập các gen trong những genome khác nhau mà trong đó không có tính chất tương đồng của nhiễm thể

* Khai thác biến dị phôi (somatic embryogenesis)

Nuôi cấy tế bào phôi đang trở nên quan trọng đối với việc tạo ra một tần suất cao của sự tái sinh từ tế bào, từ hạt phấn, từ tế bào trần cũng như các tế bào chuyển nạp Người ta tạo ra hạt tổng hợp (synthetic seeds) bằng cách nuôi cấy tế bào phôi, sau đó bảo quản phôi trưởng thành trong túi (encapsulation) để làm vật liểu giống cây trồng Đối với lúa nghiên cứu hạt tổng hợp vẫn còn rất mới mẻ, cần

nghiên cứu sâu hơn invitro để phát triển các phôi somatic có thể nảy mầm thành

cây Kỹ thuật hạt giống tổng hợp trên cây lúa có tiềm năng rất lớn để khai thác ưu thế lai, vì nó giúp cho việc nhân giống, cũng như phát triển các cây lai có ưu thế mạnh được sớm đưa ra sản xuất rộng rãi [2]

* Kỹ thuật chuyển nạp gen và sản xuất cây lúa transgenic

Các tiến bộ gần đây trong nuôi cấy mô và sinh học phân tử đã mở ra những hướng mới trong thu nhập các gen lạ vào cây trồng Gen lạ được lắp ghép thành

công ở nhiều loài cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium cũng như phương

pháp chuyển nạp DNA trực tiếp [61]

Có 2 cách để đưa vật liệu di truyền ngoại lai ở dạng từng gen riêng biệt vào

tác giữa IRRI và PGS (Plant Genetic System) Bỉ, nhằm thực hiện tách gen Bt (từ

Bacillus thurigiensis) dòng có độc tính đối với sâu cuốn lá và sâu đục thân - đồng

thời chuyển gen này vào cây lúa Chuyển nạp gen giữa các tế bào trần đã áp dụng thành công trên giống Tepei Boro (Bangladesh) và IR43 [37]: cả hai phương pháp lai tế bào trần và bắn gen đều được sử dụng, những cây được chuyển nạp đều có hai gen của bacteria

2.3 Phương pháp nuôi cấy mô, tế bào in vitro

2.3.1 Sự tái sinh mẫu cấy (sự tạo cơ quan)

Môi trường và chất điều hòa sinh trưởng thực vật thích hợp cho sự phân chia

tế bào để tế bào tăng sinh nhanh chóng thì không thể cảm ứng cho sự phát sinh hình thái (tạo chồi, rễ) Tuy nhiên, trong nuôi cấy mô thực vật, sự phát sinh cơ quan xảy ra khi mô sẹo được nuôi lâu trong môi trường, nhưng có thể sự phát sinh hình thái này bị ức chế nếu mô sẹo cấy chuyền liên tục Trong trường hợp khác,

mô sẹo hình thành từ mẫu cấy trong môi trường tạo mô sẹo, sau đó chuyển sang môi trường khác có thành phần dưỡng chất và chất điều hòa sinh trưởng thực vật thay đổi thì sự phát sinh cơ quan (chồi, rễ) sẽ xảy ra

Sự phát sinh cơ quan từ mô sẹo tương tự như sự phát sinh cơ quan trực tiếp

từ mẫu cấy Khi thay đổi thành phần và nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật thì tế bào mô sẹo lại được cảm ứng để phân hóa tạo cơ quan [13]

Tái sinh cây từ mô sẹo lúa: khi đường kính mô sẹo đạt 0,5-1mm, mô sẹo

sẽ được cấy chuyền sang môi trường tái sinh Nếu các mô sẹo còn non (0,5mm hay nhỏ hơn) mà đã cấy chuyền sang môi trường tái sinh thì sẽ bị chết nhiều và cho số chồi xanh ít Mô sẹo càng già thì khả năng tái sinh càng kém Vì vậy nên chọn những mô sẹo trung bình và đang tăng trưởng tốt để cấy chuyền Kích thước

mô sẹo tăng khá nhanh, sau vài tuần, trên một số mô sẹo xuất hiện những điểm xanh, từ những điểm xanh này sẽ hình thành chồi và phát triển thành cây [13]

2.3.2 Sự tạo mô sẹo từ mô hay cơ quan

Kỹ thuật tạo mô sẹo được tiến hành lần đầu tiên vào cuối những năm 1920, đầu những năm 1930, và là một trong những phương pháp đầu tiên của kỹ thuật nuôi cấy mô trong nhiều năm [59] Trong phương pháp này, mô sẹo ở những điều kiện môi trường thích hợp có thể tái sinh cơ quan theo chiều hướng mà ta mong muốn, tạo ra những vật liệu sử dụng trong các phương pháp sinh học khác như: chuyển gen, chọn lọc dòng soma, tạo giống cây sạch bệnh…

Mô sẹo (callus) là một khối tế bào không có tổ chức, có đặc tính phân chia mạnh, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt:

có vết thương, xử lý các chất điều hòa tăng trưởng như 2,4- D trong tối… Các tế bào thuộc các mô hoặc các cơ quan này, trừ tế bào của mô phân sinh, phải chịu một sự phản phân hóa trước lần đầu tiên Sự phản phân hóa có vai trò rất quan trọng, nó cho phép một tế bào đã trưởng thành trở lại trạng thái trẻ (trẻ hóa) Sự trẻ hóa giúp tế bào tái lập khả năng phân chia và tạo phôi soma trong điều kiện thích hợp [54]

* Vai trò của loại cơ quan, tuổi cơ quan và ánh sáng trong sự tạo mô sẹo

Khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hóa và kiểu gen [59] Sự tăng sinh của mô sẹo là kết quả của sự cân bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh áp dụng trong môi trường nuôi cấy [13]

- Các mô và các cơ quan có thể được sử dụng làm vật liệu tạo mô sẹo như:

rễ, thân, lá, củ, chồi hoa, túi phấn, phôi hợp tử chưa trưởng thành, phôi hợp tử trưởng thành…Tuy nhiên, với mỗi loại mô hay cơ quan, thường phải sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật với loại và nồng độ khác nhau tuỳ theo mức độ nhạy cảm của các tế bào trong mô hay cơ quan đó

- Những mảnh cơ quan đã trưởng thành thường không có khả năng tạo mới cơ quan, cũng không có khả năng tạo mô sẹo Ngược lại, cây non

(còn nguyên vẹn hay cắt đoạn) hay những mảnh thân còn rất non của cây trưởng thành có thể tạo mô sẹo trên môi trường có chất điều hòa sinh trưởng thực vật, đặc biệt là auxin

- Tùy theo loại mẫu cấy, ánh sáng cần hoặc không cần trong suốt thời gian tạo mô sẹo [54] Trong đa số trường hợp, sự tạo mô sẹo trong tối thường tốt hơn ngoài sáng, đặc biệt là đối với mẫu cấy lá như tạo mô sẹo từ lá

khoai tây; ngược lại, sự tạo mô sẹo từ lá cây thuốc lá Nicotiana tabacum;

mô củ khoai tây… xảy ra trong điều kiện chiếu sáng

- Vai trò của auxin trong tăng trưởng mô sẹo: mô sẹo sau khi hình thành nếu được tiếp tục duy trì trong môi trường có auxin thì mô sẹo sẽ tăng sinh nhanh, nhưng nếu chuyển sang một môi trường có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng nhưng không có sự hiện diện của auxin thì sự tăng sinh của mô sẹo xảy ra rất chậm Tốc độ tăng trưởng của mô sẹo phụ thuộc vào thành phần cũng như nồng độ của auxin

- Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong phát sinh hình thái mô sẹo: hình thái của mô sẹo phụ thuộc rất nhiều vào loại cũng như nồng độ của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật hiện diện trong môi trường nuôi cấy Nếu giữ nguyên nồng độ và loại auxin nhưng thay đổi thành phần và nồng độ cytokinin thì hình thái mô sẹo thay đổi Trong đa

số trường hợp, sự hiện diện của BAP trong môi trường nuôi cấy kích thích sự tạo mô sẹo dạng nốt, chắc, màu nâu và có khả năng sinh phôi;

mô sẹo trên môi trường có kinetin có dạng bở và thường không có khả năng sinh phôi Nồng độ auxin tăng cao kích thích sự tạo mô sẹo dạng bở nhưng khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc [13]

2.3.3 Ảnh hưởng của một số môi trường và điều kiện nuôi cấy trên sự nuôi

cấy tế bào

2.3.3.1 Môi trường nuôi cấy

Tiềm năng tạo sẹo của một số loài thực vật được xác định bởi sự tương tác

giữa trạng thái sinh lý của vật liệu nuôi cấy và môi trường nuôi cấy [15], [49] Vì

vậy, việc chọn đúng môi trường nuôi cấy thích hợp cho từng đối tượng nuôi cấy

rất cấn thiết trong công tác nuôi cấy mô và tế bào thực vật [6]

Các môi trường cơ bản được sử dụng trong nuôi cấy mô lúa thường là: MS

(Murashige và Skoog); N6 (Chu và csv) Đây là các môi trường được đánh giá là

giàu dinh dưỡng và có thành phần khoáng cân bằng [6]

Thông thường có sự đồng nhất giữa môi trường cảm ứng tạo sẹo và môi

trường thích hợp cho sự tăng trưởng của mô sẹo; tuy nhiên, trong một số trường

hợp có sự khác nhau của nồng độ chất điều hòa tăng trưởng thực vật ở cả hai môi

trường này [25]

2.3.3.2 Các nhân tố vật lý

Ánh sáng: Nhu cầu ánh sáng cho sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo tuỳ

thuộc vào loài thực vật Ở một số loài, mô sẹo thường được cảm ứng và tăng

trưởng trong điều kiện tối tuy nhiên một số loài sự cảm ứng và tăng trưởng của mô

sẹo đòi hỏi điều kiện ánh sáng hoặc quang kỳ thích hợp [55] Hiệu ứng ánh sáng với chiều hướng tăng trưởng và biệt hóa tế bào trong nuối cấy

tế bào in vitro không chỉ phụ thuộc vào kiểu gen của vật liệu nuôi cấy mà còn phụ

thuộc vào bước sóng, cường độ, thời gian chiếu sáng và giai đoạn tăng trưởng của

tế bào nuôi cấy [33]

Nhiệt độ: Hầu hết các mô và tế bào đều tăng trưởng tốt ở điều kiện nhiệt độ

khoảng 26-30o

C [43] Tuy nhiên, hiệu ứng nhiệt độ cũng thay đổi tùy loài thực vật

Phaseolus 28oC, Brassica 15oC [20]; Oryza sativa 24-32oC [33]

2.3.3.3 Ảnh hưởng của chất điều hoà tăng trưởng thực vật

Chất điều hòa tăng trưởng thực vật là thuật ngữ được dùng để chỉ tổng quát

những hợp chất hữu cơ có tác động làm biến đổi một quá trình sinh lý nào đó của thực vật ở nồng độ rất thấp Chúng không phải là chất dinh dưỡng hay là nguyên

tố khoáng cần thiết cho sự tăng trưởng của thực vật [11]

- Bản chất và nồng độ của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật

- Sự cân bằng giữa các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong mô đích

- Loại mô đích và trạng thái sinh lý của mô đích [3]

2.4 Ảnh hưởng của vi sinh vật lên sự phát triển của thực vật

Giữa thực vật và vi sinh vật có mối quan hệ mật thiết với nhau, bên cạnh một số vi sinh vật có hại thì một số khác có lợi cho cây trồng giúp cây dễ hấp thu,

có khả năng tổng hợp các hormone tăng trưởng thực vật và các chất tạo tính kháng với các tác nhân gây bệnh Dựa vào những đặc điểm có lợi đó người ta áp dụng các kỹ thuật sinh học tạo ra các loại phân bón, thuốc trừ sâu sinh học thay thế cho phân bón, thuốc trừ sâu hóa học gây độc cho người và động vật Ví dụ như:

- Azobacterin là loại vi khuẩn cố định đạm, có khả năng cung cấp một lượng lớn chất auxin, giberelin do đó để tăng năng suất cây trồng trong đó có cây lúa, người

ta sản xuất hàng loạt các vi khuẩn này để sản xuất phân bón cho đất màu mỡ gọi là phân sinh học Azotobacterin [4]

- Nấm Trichoderma là nấm hiện diện trên nhiều thực vật và là chủng nấm có lợi, khi xử lý trên ruộng lúa thì không những gia tăng năng suất lúa mà còn gia tăng khả năng kháng bệnh của cây lúa [10]

- Baculovirus gây nhiễm cho hơn 600 loài côn trùng khác nhau, vấn đề quan trọng

là nó không gây nhiễm cho người, động vật và cả thực vật Baculovirus có tiềm năng như là tác nhân kiểm soát sinh học đối với vật làm hại côn trùng Song thị trường áp dụng còn nhiều hạn chế, do đó đòi hỏi phải có nhiều hiểu biết hơn nữa

để kiểm soát sự biểu hiện gene của Baculovirus hy vọng mang đến nhiều lợi ích cho sản xuất vaccin và thuốc trừ sâu sinh học [4]

* Trong nuôi cấy mô tế bào, điều kiện vô trùng phải được đảm bảo tuyệt đối,

và chíng điều kiện vô trùng đã loại bỏ các mối tương tác có ích giữa thực vật và vi sinh vật Có rất nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm mục tiêu chọn lọc

những chủng vi khuẩn có tác động tốt tới sự phát triển của cây in vitro, cải thiện

phẩm chất, phát triển khả năng trong chọn lọc giống cây trồng Một vài nghiên cứu

gần đây đã đề cập đến tác động của vi khuẩn Methylobacterrium sp lên nhiều loại

cây trồng

2.5 Đặc điểm của chi Methylobacterium

2.5.1 Lịch sử phát hiện và phân loại

Chi Methylobacterium bao gồm nhiều loài vi khuẩn có sắc tố hồng dinh

dưỡng methyl tùy ý (pink- pigmented facultative methlotrophs, PPFM) [24], [53] Chúng có khả năng sử dụng các hợp chất chỉ chứa một nguyên tử carbon như formaldehyde, methanol hay các hợp chất chứa nhiều nguyên tử carbon làm nguồn cung cấp năng lượng và carbon cho quá trình sinh trưởng [44] Đa số các loài đều

có khả năng phát triển trên môi trường nutrient agar, một số loài có khả năng tăng trưởng trên môi trường có bổ sung methylamine và chỉ có một loài có khả năng sử dụng methan [34]

Loài Methylobacterium được phân lập và mô tả lần đầu tiên vào năm 1913

do Bassalik phân lập từ giun đất và được đặt tên là Bacillus extorquens Mặc dù vi

khuẩn PPFM hiện diện rất phổ biến trong đất hay trên các sinh vật nhưng trong một thời gian dài các vi khuẩn này không được phân lập và nghiên cứu nhiều Vào những năm 1960, 1970 khi nghiên cứu tập trung vào con đường đồng hóa các hợp chất một cacbon thì nhóm vi khuẩn dinh dưỡng methyl được phân lập và nghiên cứu, trong đó tập trung vào các phương thức biến dưỡng năng lượng và những ứng dụng của nhóm vi khuẩn này [34]

Năm 1974, Patt và các cộng sự phân lập được loài vi khuẩn PPFM đầu tiên

có khả năng sử dụng methan Loài này sắp xếp vào một chi mới là

Methylobacterium với tên loài là Methylobacterium organophilum Năm 1982, Green và Bousfield nhận thấy chủng Methylobacterium organophilum có nhiều

đặc điểm rất giống các loài vi khuẩn PPFM đã được công bố trước đây Khi so sánh 140 đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái của 149 chủng vi khuẩn PPFM

với lòai M organophilum cho thấy chúng tương đồng hơn 70% Do vậy, Green và Bousfield đã đề nghị sắp xếp các loài vi khuẩn PPFM vào chi Methylobacterium

[34]

Từ năm 1992 đến năm 2005 đã có thêm 15 loài Methylobacterium sp mới

phân lập và đặt tên Trong đó, các loài mới được xác định nhờ vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác biệt và sự tương đồng của trình tự rRNA giữa các loài khác

nhau [29], [48], [62] Vị trí phân loại chi Mehtylobacterium trong giới vi sinh vật

2.5.2 Đặc điểm sinh thái

Vi khuẩn Methylobacterium phân bố rộng rãi trong tự nhiên, chúng hiện

diện trong nhiều môi trường khác nhau bao gồm: đất, đất bùn ao hồ, nước sạch, nước mưa, không khí, bề mặt lá cây, nốt sần ở rễ thực vật, các loại hạt giống…[23], [29]

PPFM phân bố rộng rãi trên nhiều loài cây, chúng được phân lập từ hơn 100 loài thực vật từ địa tiền, rêu cho đến các loài cây hạt trần và cây hạt kín [26]

Vi khuẩn PPFM là những vi khuẩn hiếu khí hoàn toàn, do vậy các vi khuẩn này thường được phân lập từ bất kỳ môi trường nước sạch nào có chứa oxy hòa tan Ngoài ra, vi khuẩn PPFM còn có khả năng kháng với ion Cl- nên chúng vẫn hiện diện trong nước sạch dùng trong sinh hoạt [32], [33] Vi khuẩn PPFM thường lan truyền qua không khí và có khả năng thực hiện nhiều quá trình trao đổi chất khác nhau, trong một số điều kiện thuận lợi nhất định vi khuẩn PPFM có khả năng lên men tạo ra các sản phẩm khác nhau Do vậy, các vi khuẩn PPFM đang được sử dụng các sản phẩm có giá trị sinh học, chẳng hạn như các hợp chất polyme sinh học [27], [34]

Hình 2.3: Methylobacterium sp trên cây rêu (A), hình dạng tế bào vi khuẩn

chụp qua kính hiển vi điện tử (B) [36]

2.5.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá

Hầu hết các loài vi khuẩn Methylobacterium sp thường có hình que (0,8-1,0

x 1,0-0,8 μM) Vi khuẩn thường nằm ở dạng tế bào đơn hay đôi hay đôi khi kết lại theo dạng hoa hồng (rosettes) [9]

Hình 2.4: Methylobacterium sp chủng BJ001 nuôi cấy trên môi trường thạch

LB (A) vào môi trường dịch thể LB (B) chụp qua kính hiển vi điện tử quét [22]

Đa số các chủng đều có khả năng di động nhờ một tiêm mao ở cực hay gần cực, tuy nhiên một vài loài lại không có khả năng di động Đa số các loài vi khuẩn

Methylobacterium sp là vi khuẩn Gram âm, một số có Gram biến đổi Vi khuẩn

thường tăng trưởng chậm, khuẩn lạc thường có màu hồng đậm hay đỏ cam sáng, một số chủng không tăng trưởng được trên môi trường nutrient agar Sắc tố hồng của vi khuẩn không tan trong nước, không phát sáng huỳnh quang và là hợp chất carotenoid, hấp thu bước sóng cực đại ở 473, 499 và 532 nm [29], [34]

Ở môi trường lỏng nuôi cấy tĩnh vi khuẩn tạo thành một lớp màng mỏng trên bề mặt, điều này cho thấy hầu hết các chủng là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc Oxidase dương tính yếu, catalase dương tính hay âm tính tuỳ thuộc vào loài vi

khuẩn Methylobacterium sp là những vi khuẩn hoá dị dưỡng, có khả năng sử

dụng tùy ý các hợp chất methyl Do vậy, tất cả các loài đều có khả năng tăng trưởng trên môi trường có bổ sung formaldehyde (ở nồng độ thấp), formate và methanol, một vài loài có khả năng sử dụng các hợp chất methylamine, chỉ có một

loài duy nhất là M organophilum có khả năng sử dụng methane làm nguồn cung

tính ức chế mạnh đối với vi khuẩn Methylobacterium sp [34]

2.5.4 Các ứng dụng của vi khuẩn Methylobacterium sp

2.5.4.1 Tương tác với thực vật

Giữa cây và vi khuẩn có quan hệ tương hỗ, một số vi khuẩn có lợi cho cây trồng vì chúng tham gia vào các chu trình sinh địa hoá, cung cấp cho cây các chất dinh dưỡng cần thiết Vi khuẩn dinh dưỡng methyl chiếm tỷ lệ lớn trong hệ vi sinh vùng lá của nhiều loài cây Kalyaeva và cộng sự (2000, 2003) phát hiện việc gây

nhiễm vi khuẩn Methylovorus mays và Methylomonas methanica vào môi trường nuôi cấy invitro tạo mối liên kết bền vững giữa vi khuẩn và mô thực vật [39], [40]

Thuốc lá, cây lanh và khoai tây khi nhiễm vi khuẩn tăng trưởng mạnh hơn so với đối chứng (số chồi tăng, rễ phát triển mạnh), ngay cả trên môi trường không có vitamine [35]

Hình 2.5: Sự tái sinh chồi của loài cây thuốc lá chuyển gen ipt trên môi trường

MS không bổ sung hormone sau một tháng nuôi cấy (a): không bổ sung vi

khuẩn Methylovorus mays (b): có bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays [39]

Theo Maliti (2000), so với các vi khuẩn liên kết với thực vật khác thì vi

khuẩn Methylobacterium sp là loài tồn tại lâu dài và chiếm tỉ lệ lớn nhất khi bề

mặt lá được rửa sạch [46] Holland và cộng sự (1994) đã đề cập đến việc khử trùng thông thường trong khâu chuẩn bị nuôi cấy mô không loại trừ được

Methylobacterium sp., dù đã xử lý với hypochlorite và cồn nhưng các mô sẹo phát

sinh từ mẫu cấy này vẫn có nguy cơ bị nhiễm PPFM [35] Đây là nhóm vi khuẩn rất phong phú và không gây bệnh thực vật PPFM chiếm tỷ lệ lớn và có mật độ từ

104 đến 107 đơn vị khuẩn lạc (cfu) trên mỗi gram trọng lượng tươi của mô thực vật [35] Chúng lây nhiễm qua hạt [26], ở hạt đậu nành khô mật độ là 105 cfu/gram [35]

Tuy PPFM không tăng trưởng nhanh như các vi khuẩn vùng lá khác trên môi trường giàu dinh dưỡng nhưng chúng vẫn có khả năng cạnh tranh tạo khuẩn lạc trên lá Một số tác giả cho rằng dinh dưỡng methyl tuỳ ý ở PPFM là một phần

lý do duy trì mối quan hệ giữa chúng với thực vật Bằng cách sử dụng nguồn thức

ăn khác thường là methanol, PPFM có thể loại bỏ chất độc này khỏi mô thực vật

và có được chỗ cư ngụ trong lá (môi trường chỉ thích hợp với một vài loài vi khuẩn) [44], [50]

Bên cạnh tính phổ biến và tồn tại lâu dài, còn nhiều bằng chứng cho thấy mặc dù PPFM thu nhận chất dinh dưỡng từ cây chủ nhưng không phải là mối quan

hệ một chiều Các vi khuẩn này sử dụng nguồn carbon và khoáng chất từ cây, đồng thời tham gia vào các quá trình sinh hoá và chuyển hoá quan trọng ở cây chủ

Methylobacterium sp nổi bật vì nhiều đặc tính quan trọng như khả năng tổng hợp

amino acid, PHB (Poly- -Hydrobutyrate); tổng hợp carotenoid, tăng cường tạo hương vị ở dâu tây; tăng khả năng nảy mầm của hạt; khả năng phân hủy các hợp chất 2,4,6-trinitrotoluene, nitramine…; khả năng phân hủy và chuyển hóa một số

cơ chất không cần thiết ở thực vật thành sản phẩm có giá trị [35]

Chủng PPFM đầu tiên được Basile và cộng sự (1969) phát hiện kích thích

sinh trưởng ở cây địa tiền (Scapania nemorosa) trong điều kiện in vitro [9]

Kalyaeva và cộng sự (2000, 2003) phát hiện việc nhiễm vi khuẩn

Methylovorus mays và Methylomonas methanica vào môi trường nuôi cấy in vitro

tạo mối liên kết bền vững giữa vi khuẩn và mô thực vật Thuốc lá, cây lanh và khoai tây khi nhiễm khuẩn tăng trưởng mạnh hơn (số chồi tăng, rễ phát triển mạnh) [39], [40]

Năm 1994, Holland và cộng sự công bố về khả năng tương tác của vi khuẩn

Methylobacterium sp và cây đậu nành trong việc chuyển hoá nickel [35]

Cây lúa (Oryza sativa) cũng là một loại cây có mối quan hệ mật thiết với

các vi khuẩn PPFM Nhiều nhà nghiên cứu cũng đã chứng tỏ vi khuẩn

Methylobacterium sp có tác động tích cực lên sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa cả trong điều kiện in vitro lẫn in vivo

Maliti (2000) nghiên cứu, đánh giá ảnh hưởng của một số chủng

Methylobacterium sp đối với sự tăng trưởng và phát triển của cây lúa ở 3 mức độ: nuôi cấy mô, cây con trong điều kiện in vitro và cây trưởng thành trong môi trường nhà kính Kết quả cho thấy: vi khuẩn Methylobacterium sp có khả năng

làm gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt, tăng trọng lượng tươi, chiều cao cây mạ trong

điều kiện in vitro [46]

Năm 2004, Madhaiyan và cộng sự cũng đã tiến hành các thí nghiệm gây nhiễm PPFM lên hạt lúa hay phun lên lá và kết quả cho thấy: vi khuẩn

Methylobacterium sp có hoạt tính kích thích tăng trưởng, gia tăng khả năng đẻ

nhánh của lúa góp phần gia tăng năng suất lúa từ 22,1 đến 24,1% Ngoài ra, các vi

khuẩn Methylobacterium sp còn có vai trò ức chế các chủng vi khuẩn gây bệnh

trên cây lúa, góp phần làm giảm tỷ lệ cây bệnh từ 17,8-23,7% Công trình của Madhaiyan và cộng sự (2004) cũng đã chứng tỏ mối tương quan giữa khả năng

kháng bệnh của cây lúa khi xử lý với vi khuẩn Methylobactreium sp và sự gia

tăng polyphenol oxidase trong cây [47]

Qua các kết quả khảo sát về ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobactreium sp

lên sự hình thành mô sẹo ở cây thuốc lá và cây cúc cho thấy: vi khuẩn có ảnh hưởng khác nhau lên quá trình hình thành mô sẹo ở các loại mô hay các loại cây

nuôi cấy Đối với Chrysanthenum sp vi khuẩn hạn chế sự hình thành mô sẹo nhưng kích thích sự hình thành phôi ở các mô sẹo này, trong khi đó ở Nicotiana tabacum vi khuẩn lại ức chế quá trình hình thành mô sẹo ở mô phiến lá và mô lóng thân Như vậy, vi khuẩn Methylobacterium sp có khả năng tác động lên quá

trình biệt hóa cơ quan ở thực vật Ngoài vai trò tác động của vi khuẩn thì bản chất của mô và loài thực vật cũng quyết định đến khả năng và chiều hướng phát sinh cơ

quan của nuôi cấy invitro Bên cạnh đó các kết quả thí nghiệm còn cho thấy rằng

vi khuẩn Methylobacterium sp còn có khả năng tăng cường quá trình hình thành

rễ ở P fortunei và Chrysanthemum sp., so với đối chứng ở nghiệm thức có bổ

sung vi khuẩn mẫu cấy thành lập rễ sớm hơn, nhiều hơn [9]

Ngoài PPFM, còn có những nghiên cứu sử dụng các loài vi khuẩn có lợi khác như khảo sát sự tăng trưởng và phát triển của cây hoa Cúc, cây hoa Bi Bi và

cây Địa Lan có sự hiện diện của Bacillus spp trong nuôi cấy in vitro [5] cho kết quả: tuỳ theo từng loại cây mà Bacillus spp có tác dụng khác nhau như tăng chiều cao, số lượng rễ, trọng lượng tươi Vi khuẩn Methanotropic có ảnh hưởng đến sự

hình thành callus của hạt lúa mì, gia tăng sự tạo rễ, đồng thời gia tăng sự tái sinh

cây [40] Với sự hiện diện của vi khuẩn Methylovorus mays trên môi trường nuôi cấy làm tăng khả năng tái sinh chồi của cây thuốc lá chuyển gen ipt [39] Từ

những kết quả này chứng tỏ giữa thực vật và vi sinh vật có mối quan hệ tương hỗ

có lợi tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển và tăng trưởng của thực vật trong

điều kiện in vitro và in vivo

2.5.4.2 Sinh tổng hợp auxin và cytokinin

Không chỉ có thực vật mà vi sinh vật cũng có thể tổng hợp auxin và cytokinin, đối với các vi khuẩn có lợi và vi khuẩn tương tác với thực vật thì đây có thể là nguyên nhân kích thích cây phát triển

Omer và cộng sự (2004) đã khảo sát sự hiện diện của IAA trong môi trường chứa dịch nổi của PPFM bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp kết hợp với phân tích phổ NMR (Nuclear Mangnetic Radiation: cộng hưởng từ hạt nhân) đã chứng

tỏ vi khuẩn PPFM có khả năng tổng hợp hormone thực vật là IAA [50]

Holland và cộng sự (1994) kiểm tra mối quan hệ giữa PPFM, cytokinin và sự phát triển của thực vật đã cho thấy PPFM có ảnh hưởng đến lượng cytokinin có trong mô tế bào thực vật [35]

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian : từ tháng 3/2006 đến tháng 7/2006

Địa điểm : phòng thí nghiệm sinh học phân tử - khoa Sinh học - trường Đại học Khoa học Tự nhiên

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Thí nghiệm được thực hiện trên giống lúa VĐ20 được cung cấp từ Công ty

cổ phần giống cây trồng Miền Nam

* Đặc tính nông học

Giống lúa VĐ 20: là giống lúa cao sản ngắn ngày, thời gian sinh trưởng 95-

100 ngày, cây cao 85- 90 cm, năng suất 6- 8 tấn/ ha Dạng hình khá, bông to, ít lép, chín sớm, nhiễm bệnh vàng lá, chịu phèn trung bình Hạt gạo thon dài, không bạc bụng, cơm thơm dẻo (Công ty cổ phần giống cây trồng Miền Nam)

Chủng vi khuẩn Methylobacterium sp 1019 do phòng thí nghiệm sinh học

phân tử - khoa Sinh học - trường Đại học Khoa học Tự nhiên phân lập cung cấp

* Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của chủng 1019 [9]

Đặc điểm hình thái, sinh lý

Chủng 1019 là những vi khuẩn có màu hồng, hình que ngắn, có khả năng di động, Gram âm, nhiệt độ tăng trưởng thích hợp từ 25-35oC

Hình dạng tế bào Dấu phẩy, phình to ở hai đầu

Trong giới hạn nồng độ các chất điều hòa tăng trưởng thực vật thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật, thì nồng độ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật không ảnh hưởng tới sự phát triển của chủng 1019, do vậy việc bổ sung hormone vào môi trường nuôi cấy thực vật sẽ không ảnh hưởng đến

sự tăng trưởng của vi khuẩn

Chủng 1019 tăng trưởng tối đa sau 30 giờ nuôi cấy do đó thời gian thích hợp để thu nhận sinh khối tế bào là từ 12 đến 32 giờ sau nuôi cấy

Đồ thị 3: Đường cong tăng trưởng của chủng 1019

Đặc điểm sinh hóa

Chủng có hoạt tính catalase dương tính và hoạt tính oxidase yếu