Nghiên cứu khoa học " ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM RADIOTOLERANS 1019 LấN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở THỰC VẬT " pdf

Nghiên cứu khoa học ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM RADIOTOLERANS 1019 LấN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở THỰC VẬT ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM RADIOTOLERANS 1019 LấN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở THỰC VẬT Kiều Phương Nam, Đỗ Thị Di Thiện, Trần Minh Tuấn, Bùi Văn Lệ Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. HCM Tóm tắt Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, sự bổ sung vi khuẩn Methylobacterium radiotolerans 1019 sẽ có tác dụng làm thay đổi quá trình phát sinh cơ quan ở thực vật, cụ thể: gia tăng khả năng tạo chồi từ mô lá của cây cà chua, thuốc lá và Saintpaulia trên môi trường MS có bổ sung cytokinin; hạn chế khả năng tạo mô sẹo ở cây cúc, cây thuốc lá nhưng lại kích thích sự hình thành phôi vô tính ở cây cúc và sự hình thành mô sẹo ở cây súp lơ. Đối với quá trình phát sinh rễ, vi khuẩn có hoạt tính kích thích trên cả hai đối tượng là cây hoa cúc và cây hông. Từ khóa: Methylobacterium, Phát sinh hình thái, Nuôi cấy mô Mở đầu Methylobacterium là chi vi khuẩn cư ngụ vùng diệp quyển ở thực vật, chúng sử dụng Methanol từ thực vật tiết ra và tương tác lại với thực vật thông qua nhiều cơ chế khác nhau: sự sinh tổng hợp các phytohorme (Holland M. A. , 1997), tiết ACC deaminase làm giảm lượng ethylene trong cây (Madhaiyan M., Selvaraj P., Jeounghyun R., Tongmin S., 2006b) gia tăng khả năng hấp thu các chất khoáng gia tăng sự kháng bệnh của thực vật (Maliti C. M., 2000). Mặt khác, vi khuẩn Methylobacterium có khả năng kháng với chất khử trùng thông thường (cồn, javel) nên thường xuất hiện trong môi trường nuôi cấy mô và có tác động đến sự sinh trưởng và phát triển của chúng (Kalyaeva M. A., Ivanova E. G., Doronina N. V., Zakharchenko N. S., Trotsenko Yu. A., Buryanov Ya. I., 2003). Chính vì vậy, việc hiểu rõ cách tác động của vi khuẩn này lên từng quá trình nuôi cấy, trên từng loại cây sẽ giúp chúng ta sử dụng loại vi khuẩn này một cách có lợi nhất. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Vật liệu Chủng vi khuẩn 1019 được phân lập từ cây Saintpaulia trồng tại Thành phố Hồ Chí Minh và được định danh bằng trình tự rDNA 16S. Kết quả so sánh 1362 nucleotide cho thấy chủng này có quan hệ họ hàng gần với loài Methylobacterium radiotoleran JCM 2831 T (tương đồng 97,73%) Lá, lóng thân, chồi ngủ của cây Cúc (Chrysanthemum sp.), Thuốc lá (Nicotiana tabacum L. cv Samsun), Saintpaulia ionantha, Cà chua (Lycopersicum esculentum). Mô giữa phiến lá- cuống lá cây hông (Paulonia fortunei) trong điều kiện in vitro. Cuống bông cây Súp lơ (Brassica oleracea var. botrytis). Phương pháp Lớp mỏng tế bào lóng thân (dầy 1-3mm) và phiến lá (2mm x 0,5cm) của các nhóm cây được cấy vào đĩa petri chứa môi trường MS bổ sung BA và NAA có nồng độ khác nhau tùy theo mục tiêu (bảng 1). Cuống hoa cây súp lơ được khử trùng bằng dung dịch javel 1,5% trong thời gian 15 phút sau đó cắt thành lát mỏng có bề dày 1-2mm. Sau khi cấy, bổ sung 1ml dịch vi khuẩn 1019 đã được nuôi cấy lỏng lắc trên môi trường MS sau 4 ngày, mẫu đối chứng không bổ sung dịch vi khuẩn. Kết quả được ghi nhận sau 21 ngày nuôi cấy với các chỉ tiêu tỉ lệ phần trăm mẫu cấy tạo mô sẹo, chồi hay rễ, số cơ quan trung bình/ mẫu và đường kính mô sẹo. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, 30 mẫu cho mỗi nghiệm thức, kết quả được xử lý thống kê bằng chương trình Excel. Bảng 1. Các loại môi trường sử dụng Loài thực vật Môi trường nuôi cấy bổ sung Mục tiêu Tài liệu tham khảo Thuốc lá 0,5 mg/l BA * Cà chua 2,5 mg/l BA và 0,05 mg/l NAA * Saintpaulia 0,4 M NAA và 0,1 M BA Chồi * Thuốc lá 0,1 mg/l 2,4-D * Cúc 0,1 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA Teixeira da Silva J. A., 2003 Súp lơ 1 mg/l 2,4 D Mô sẹo * Cúc 0,1 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA Teixeira da Silva J. A., 2003 Hông 10 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA Rễ * *: Môi trường đã được thử nghiệm và sử dụng tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp. HCM Kết quả và thảo luận Sự phát sinh chồi Vi khuẩn Methylobacterium bổ sung vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đến quá trình hình thành chồi của mẫu cấy. ở cây thuốc lá và cây Saintpaulia, vi khuẩn làm gia tăng số chồi/mẫu, tỉ lệ số mẫu cấy tạo chồi (Bảng 2), thời gian suất hiện chồi cũng sớm hơn so với đối chứng. Tuy nhiên, ở cây cà chua phản ứng của lớp mỏng phiến lá trên môi trường có bổ sung vi khuẩn và không bổ sung vi khuẩn hoàn toàn khác biệt: lớp mỏng phiến lá trên môi trường không bổ sung vi khuẩn tạo thành cụm chồi, trong khi đó lớp mỏng phiến lá trên môi trường có bổ sung vi khuẩn lại tạo mô sẹo. Lớp mỏng lóng thân ở hai nghiệm thức đều tạo mô sẹo sau 7 ngày nuôi cấy nhưng sau 14 ngày tất cả các mô sẹo này đều hoá nâu và không phát triển. Trong đó, tỉ lệ số phiến lá cây cà chua tạo cụm chồi trên môi trường không có bổ sung vi khuẩn là 81,81%, số chồi trung bình trên mẫu là 4,83±0,24; đường kính trung bình khoảng 0,91±0,03, hầu hết là mô sẹo xốp, xuất hiện ở rìa mẫu cấy. Như vậy, chủng vi khuẩn M. radiotolerans 1019 bổ sung vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng mạnh tới sự phát sinh cơ quan ở lớp mỏng phiến lá của cây cà chua. Kết quả này cho thấy: Chính vi khuẩn bổ sung vào môi trường nuôi cấy đã làm thay đổi tỷ lệ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật, qua đó thúc đẩy hay làm thay đổi chiều hướng biệt hoá cơ quan của thực vật nuôi cấy in vitro. Sự khác biệt về kết quả hình thành chồi ở cây thuốc lá, Saintpaulia, cây cà chua và giữa phiến lá với lóng thân cho thấy tác động của vi khuẩn sẽ khác nhau phụ thuộc vào bản chất loại mô và loại thực vật. Bảng 2. ảnh hưởng của chủng vi khuẩn 1019 lên sự phát sinh chồi ở thuốc lá và Saintpaulia ionathna nuôi cấy in vitro Lóng thân Phiến lá Tỉ lệ % mẫu cấy tạo chồi Số chồi trung bình trên mẫu Tỉ lệ % mẫu cấy tạo chồi Số chồi trung bình trên mẫu Loài thực vật Đối chứng Bổ sung Đối chứng Bổ sung Đối chứng Bổ sung Đối chứng Bổ sung Thuốc lá 40,00 94,73 5,38 ± 0,18 8,12 ± 0,19 13,04 82,60 4,50 ± 0,17 18,00 ± 0,28 Saintpaulia ionantha 41,66 87,50 7,45 ± 0,27 11,80 ± 0,25 31,25 90,47 4,12 ±0,17 14,74 ± 0,25 Hình 1. Anh hưởng của chủng 1019 lên sự tạo chồi ở cây thuốc lá (A), ở cây cà chua (B) sau 21 ngày nuôi cấy. Sự phát sinh mô sẹo Các kết quả khảo sát về ảnh hưởng của vi khuẩn lên sự hình thành mô sẹo ở cây thuốc lá, cây cúc và cây súp lơ cho thấy vi khuẩn có ảnh hưởng khác nhau lên quá trình hình thành mô sẹo ở các loại mô hay các loài cây nuôi cấy. Đối với cây cúc vi khuẩn hạn chế sự hình thành mô sẹo nhưng kích thích sự thành lập phôi ở các mô sẹo này, trong khi đó ở cây thuốc lá vi khuẩn lại ức chế quá trình hình thành mô sẹo (bảng 2). Còn ở cây súp lơ vi khuẩn lại có vai trò thúc đẩy quá trình hình thành mô sẹo, cụ thể: sau 14 ngày nuôi cấy, lớp mỏng tế bào cuống hoa trên môi trường đối chứng chưa hình thành mô sẹo, còn trên môi trường có sự hiện điện của vi khuẩn thì 100% mẫu cấy hình thành mô sẹo, nhưng rất nhỏ và chỉ xuất hiện ở rìa mẫu cấy (hình 2 F) . Các kết quả này cùng với ghi nhận ức chế sự hình thành phôi từ mô sẹo ở cây lúa của vi khuẩn Methylobacterium sp. (Madhaiyan M., Selvaraj P., Jeounghyun R., Tongmin S., 2006b) một lần nữa là minh chứng cho sự tác động của vi khuẩn lên quá trình hình thành mô sẹo cũng như phát sinh cơ quan từ mô sẹo này. Bảng 3. Ảnh hưởng của chủng 1019 lên sự hình thành mô sẹo ở cúc và thuốc lá Lóng thân Phiến lá Tỉ lệ % mậu cấy tạo mô sẹo Đường kính trung bình (cm) Tỉ lệ % mẫu cấy tạo mô sẹo Đường kính trung bình (cm) Loài thực vật Đối chứng Bổ sung Đối chứng Bổ sung Đối chứng Bổ sung Đối chứng Bổ sung Hoa cúc 91,66 38,46 0,31± 0,02 0,21 ± 0,01 100 82,60 0,48 ± 0,01 0,37 ± 0,01 * Thuốc lá 41,66 26,31 0,46 ± 0,01 0,39 ± 0,01 58,82 5,26 0,30 ± 0,01 0,24 ± 0,01 * Có sự tạo phôi ở mẫu phiến lá nuôi cấy trên môi trường có bổ sung vi khuẩn sau 14 ngày, 31,25% mẫu cấy hình thành phôi, số phôi trung bình trên mẫu: 8,16±0,23 (hình 2, A,B,C,D) A B Hình 2. ảnh hưởng của chủng 1019 lên sự hình thành mô sẹo ở cây thuốc lá (E); cây súp lơ (F) sau 21 ngày nuôi cấy. Các giai đoạn phát triển của phôi cây cúc hình thành từ mô sẹo trên môi trường có bổ sung vi khuẩn Methylobacterium sp., A: Cụm phôi hình cầu, B: Phôi hình tim, C: Phôi nẩy mầm, D: chồi hoàn chỉnh. Sự phát sinh rễ Qua các thí nghiệm cho thấy, vi khuẩn Methylobacterium cũng có ảnh hưởng tới quá trình phát sinh rễ ở cây cúc và cây hông. Trên môi trường cảm ứng tạo rễ cho hai loại cây này, sự bổ sung vi khuẩn có tác dụng rút ngắn thời gian hình thành rễ, rễ nhiều và dài hơn. Các số liệu được trình bày trong bảng 4 và hình 3. Bảng 4. ảnh hưởng của chủng 1019 lên sự hình thành rễ ở cây hoa cúc và cây hông Lóng thân Phiến lá Tỉ lệ % tạo rễ Số rễ trung bình Tỉ lệ % tạo rễ Số rễ trung bình Loài thực vật Đối chứng Bổ sung Đối chứng Bổ sung Đối chứn g Bổ sung Đối chứng Bổ sung Hoa cúc * 30,76 9,09 1,96±0,1 2 0,87±0,13 32,50 96,66 1,96±0,21 3,19±0,1 9 Mô giữa phiến lá và cuống lá Tỉ lệ % mẫu tạo rễ Số rễ trung bình trên mẫu Đối chứng Bổ sung Đối chứng Bổ sung Hông 12,50 83,33 2,11± 0,02 4,34 ± 0,01 * có sự hình thành chồi sau 30 ngày nuôi cấy (hình 3, A). Hình 3. ảnh hưởng của chủng 1019 lên sự hình thành rễ ở cây cúc (A) và cây hông sau 21 ngày đồng nuôi cấy (B). E F E F Có bổ sung Đối chứng vi khuẩn A B Từ lâu nay, điều kiện vô trùng được xem là một yêu cầu tiên quyết trong kỹ thuật vi nhân giống thực vật. Vô hình chung, chúng ta đã bỏ qua mối quan hệ tương hỗ giữa thực vật và vi sinh vốn đã hiện hữu từ lâu trong quá trình tiến hoá. Thực tế, một số nghiên cứu đã cho thấy các chủng vi sinh ngoại nhiễm đang là vấn đề ở các phòng thí nghiệm, nhưng chúng cũng đưa đến các cơ hội để tìm kiếm các loài vi sinh vật có ích, chẳng hạn như loài Methylovorus mays được sử dụng để kích thích tạo cây thuốc lá chuyển gen ipt trên môi trường không có bổ sung hormone (Kalyaeva M. A., Zacharchenko N. S., Doronina N. V., Rukavtsova E. B., Ivanova E. G., Alekseeva V. V., Trotsenko Yu. A., Bur’yanov Ya. I., 2000). Việc xác định vi khuẩn Methylobacterium có khả năng sinh tổng hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật: auxin (Omer Z. S., Tombolini R., Broberg A., Gerhardson B., 2004), cytokinin (Holland M. A. , 1997,Long R. L. G., Morris R. O., Polacco J. C., 2002), ACC deaminase (Madhaiyan M., Selvaraj P., Jeounghyun R., Tongmin S., 2006b) là một trong những bằng chứng để giải thích sự ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacterium lên thực vật. Tuy nhiên, vẫn còn rất nhiều vấn đề chưa được sáng tỏ về mối quan hệ tương tác này chẳng hạn như thực vật có tác động ngược trở lại đối với vi khuẩn Methylobacterium hay không và theo cơ chế nào? Các nghiên cứu trước đây chứng minh vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật như sự tăng trưởng ở rêu (Hornschuh M., Grotha R., Kutschera U., 2002), lúa (Maliti C. M., 2000), cải dầu (Madhaiyan M., Selvaraj P., Jeounghyun R., Tongmin S., 2006b); sự gia tăng năng suất ở lúa 9Madhaiyan M., Ponguzhali S., Senthilkumar M., Seshdri S., Chung H., Yang J., Sundaram S, SA T., 2004) hay mía (Madhaiyan M., Poonguzhali S., Sundaram S.P., Tongmin Sa., 2006a). Còn các kết quả của đề tài cùng với kết quả của một số ít công trình nghiên cứu như ảnh hưởng của vi khuẩn Methanotrophic lên sự phát sinh cơ quan ở lúa mì (Kalyaeva M. A., Ivanova E. G., Doronina N. V., Zakharchenko N. S., Trotsenko Yu. A., Buryanov Ya. I., 2003), cản sự hình thành phôi ở cây lúa của vi khuẩn Methylobacterium (Maliti C. M., 2000) lại góp phần chứng minh tiềm năng sử dụng vi khuẩn Methylobacterium để điều khiển và gia tăng hiệu quả quá trình phát sinh hình thái của thực vật trong điều kiện in vitro. Việc áp dụng vi khuẩn Methylobacterium sẽ gia tăng hiệu quả nhân giống, giảm thời gian nuôi cấy và cuối cùng dẫn tới giảm giá thành cây giống. Còn trong nghiên cứu chuyển gen thì việc gia tăng khả năng tái sinh sẽ giúp cho việc chọn lọc cây chuyển gen thuận lợi và nhanh chóng hơn. Bên cạnh đó, sự tương tác cạnh tranh giữa vi khuẩn Methylobacterium và Agrobacterium rất có thể mở ra một ứng dụng khác là dùng vi khuẩn Methylobacterium để loại vi khuẩn Agrobacterium ra khỏi mẫu cấy sau khi chuyển gen đồng thời tăng tính phục hồi và khả năng tái sinh của mẫu cấy. Những kết quả đạt được cho thấy một định hướng, một khẳng định về việc ứng dụng loài vi khuẩn này trong nuôi cấy mô-tế bào thực vật. Tuy nhiên, để áp dụng trong từng trường hợp cụ thể thì cần phải có những nghiên cứu sâu hơn, cụ thể trên từng đối tượng. Kết luận Chủng vi khuẩn Methylobacterium radiotolerans 1019 có ảnh hưởng tới sự phát sinh cơ quan ở thực vật: gia tăng sự hình thành chồi, rễ ở cây thuốc lá, cây hoa cúc và cây hông, ức chế sự tạo mô sẹo ở thuốc lá, sự hình thành chồi ở cây cà chua và tăng cường sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo của cây cúc. Hiệu quả và chiều hướng tác động của vi khuẩn phụ thuộc vào bản chất loại mô và loại thực vật. Tài liệu tham khảo Holland M. A. , 1997. Are cylokinin produced by plant? Plant Physiology, Vol. 115, pp 865-868. Hornschuh M., Grotha R., Kutschera U., 2002. Epiphytic bacteria associated with the bryophyte Funaria hygrometrica: effects of Methylobacterium strains on protonema development. Plant biol (Stuttg) Vol. 4, pp 682-687. Kalyaeva M. A., Ivanova E. G., Doronina N. V., Zakharchenko N. S., Trotsenko Yu. A., Buryanov Ya. I., 2003. Stimulation of wheat morphogenesis in vitro by Methanotrophic bacteria. Doklady Biological Sciences, Vol. 388, pp 76–78, Translated from Doklady Akademii Nauk, Vol. 388, No. 6, pp 847–849. Kalyaeva M. A., Zacharchenko N. S., Doronina N. V., Rukavtsova E. B., Ivanova E. G., Alekseeva V. V., Trotsenko Yu. A., Bur’yanov Ya. I., 2000, “Plant growth and morphogenesis in vitro is promoted by associative methylotrophic bacteria”, Russian Journal of Plant Physiology, Vol. 48, No. 4, pp. 514-517. Translated from Fiziologiya Rastenii, Vol. 48, No. 4, pp. 596-599. Long R. L. G., Morris R. O., Polacco J. C., 2002. tRNA is the source of low-level trans-zeatin production in Methylobacterium spp. Journal of Bacteriology, Vol. 184, No. 7, pp 1832-1842. Madhaiyan M., Ponguzhali S., Senthilkumar M., Seshdri S., Chung H., Yang J., Sundaram S, SA T., 2004. Growth promotion and induction of systemic resistance in rice cultivar Co-47 (Oryza sativa L.) by Methylobacterium spp. Bot. Bull. Acad. Sin., Vol. 45, pp 315-324. Madhaiyan M., Poonguzhali S., Sundaram S.P., Tongmin Sa., 2006a. A new insight into foliar applied methanol influencing phylloplane methylotrophic dynamics and growth promotion of cotton (Gossypium hirsutum L.) and sugarcane (Saccharum officinarum L.). Environmental and Experimental Botany, 57(1-2); pp 168-176. Madhaiyan M., Selvaraj P., Jeounghyun R., Tongmin S., 2006b. Regulation of ethylene levels in canola (Brassica campestris) by 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase-containing Methylobacterium fujisawaense. Planta, pp 268-278. Maliti C. M., 2000. Physiological and biochemical effects of Methylobacterium sp. strains and foliar-applied methanol on growth and development of rice Oryza sativa L., Ph. D. thesis, The city University of New York, USA. Omer Z. S., Tombolini R., Broberg A., Gerhardson B., 2004. Indole-3-acetic acid production by pink-pigmented facultative methylotrophic bacteria. Plant Growth Regulation, Vol. 43, pp 93-96. Teixeira da Silva J. A., 2003. Thin cell layer technology in ornamental plant micropropagation and biotechnology. African Jounal of Biotechnology, Vol. 2, No. 12, pp 683-691. Effect of Methylobacterium radiotolerans 1019 on plant morphology Kieu Phuong Nam, Do Thi Di Thien, Tran Minh Tuan, Bui Van Le Faculty of Biology, Ho Chi Minh City National University - The University of Science SUMMARY Introduction of Methylobacterium radiotolerans 1019 into in vitro culture would change the process of morphological formation in plants: increase the ability of shoots forming from leaf tissue of Lycopersicum esculentum, Nicotiana tabacum and Saintpaulia ionatha on MS - cytokinin medium; inhibition of calluses forming in Chrysanthemum spp., Nicotiana tabacum; and stimulation of somatic embryos forming in Chrysanthemum spp. and calluses forming in Brassica oleracea var. botrytis. The bacterium had the effect of stimulating root formation on both Chrysanthemum spp. and Paulonia fortunei. Key words: Methylobacterium, Morphology formation, Tissue culture . Nghiên cứu khoa học ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM RADIOTOLERANS 1019 LấN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở THỰC VẬT ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM RADIOTOLERANS. Chủng vi khuẩn Methylobacterium radiotolerans 1019 có ảnh hưởng tới sự phát sinh cơ quan ở thực vật: gia tăng sự hình thành chồi, rễ ở cây thuốc lá, cây hoa cúc và cây hông, ức chế sự tạo. động của vi khuẩn sẽ khác nhau phụ thuộc vào bản chất loại mô và loại thực vật. Bảng 2. ảnh hưởng của chủng vi khuẩn 1019 lên sự phát sinh chồi ở thuốc lá và Saintpaulia ionathna nuôi cấy in vitro