Luận văn : KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN Methylobacterium sp. TRÊN LÚA (Oryza sativa L.) Ở TÂY NINH part 3 pps

43 Hình 4.2: Tế bào vi khuẩn trong thử nghiệm Gram vật kính 100X. 4.2.2. Mối quan hệ với oxy: Trong thí nghiệm khảo sát mối quan hệ với oxy của các chủng phân lập được. Trong tổng số 26 khuẩn lạc (chủng) vi khuẩn đều cho phản ứng catalase dương tính. Từ đó, có thể kết luận rằng các chủng vi khuẩn đã phân lập được là vi khuẩn hiếu khí. Ngoài ra, trong bốn chủng đại diện cho nhóm đều cho phản ứng oxydase dương tính cũng cho phép chúng tôi xác nhận một lần nữa các chủng này là vi khuẩn hiếu khí. Kết quả này phù hợp với các công trình nghiên cứu của Green (1992), trước đây [34]. 4.2.3. Khả năng đi động Kết quả thử nghiệm khả năng di động trong bốn chủng kiểm tra đều có khả năng di động (mọc lan ra khỏi đường cấy). Từ đó chúng tôi cũng có thể kết luận răng bốn chủng có roi (hay tiêm mao). 4.2.4. Kết quả khả năng sử dụng các chất cung cấp nguồn cacbon Kết quả thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn cung cấp carbon và năng lượng các khuẩn lạc thuần được tóm tắt trên bảng 4.2. Bảng 4.2: Kết quả thử nghiệm khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn. Arabinose Fructose ethanol methylamine trimethylamine Betaine serbacate Glutamate Acetate nutrient agar Catalase Citrate Mannitol Maltose Sucrose LM1 – – + + – + – – + + + + + + + LM2 – – + + – + – – + + + + + + + 44 LM3 – – + + – + – – + + + + + + + BS16 – – + + – + – – + + + + + + + BS17 – – + + – + – – + + + + + + + BS18 – – + + – + – – + + + + + + + BN21 – – + + – + – – + + + + + + + TS9 + – – – – – – – – + + + + + + BD11 + – – – – – – – + + + + + + + TN12 + – – – – – – – + + + + + + + TN13 + – – – – – – – + + + + + + + TD15 + – – – – – – – + + + + + + + GN19 + – – – – – – – + + + + + + + GS22 + – – – – – – – + + + + + + + GS23 + – + + – – – – + + + + + + + GD26 + – + + – – – – + + + + + + + TN10 + + + – – – + + – + + + + + + GD14 + + + – – – + + – + + + + + + LM4 – + – – – + – + – + + – + + + LB5 – + – – – + – + – + + – + + + TS6 – + – – – + – + – + + – + + + TS7 – + – – – + – + – + + – + + + TS8 – + – – – + – + – + + – + + + GS24 – + – – – + – + – + + – + + + GN25 – + – – – + – + – + + – + + + BN20 – + – – – + – + – + + – + + + Từ các thử nghiệm sinh hóa này chúng tôi tiến hành phân nhóm các khuẩn lạc có đặc điểm sinh hóa giống nhau. Các khuẩn lạc có đặc điểm sinh hóa giống nhau được xếp vào cùng một nhóm và từ mỗi nhóm này chỉ dùng một đại diện để tiến hành tính hệ số tương đồng Jaccard so với đặc điểm sinh hóa của các chủng đã được công bố. Có tất cả 4 nhóm và bốn đại diện cho bốn nhóm được sử dụng trong tính toán hệ số tương đồng là: LM2, TS7, TN10, TD15. 45 Hình 4.3: Kết quả khảo sát khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn. Chú thích: 1: arabinose, 2: betaine, 3: citrate, 4: glucose, 5: ethanol, 6: fructose, 7: glutamate, 8: acetate, 9: methylamine, 10: serbacate, 11: trimethylamine, 12: lactose, DC: đối chứng âm. 4.2.5. Bộ thử nghiệm IDS 14GRN Từ các chủng vi khuẩn đại diện cho nhóm theo các đặc điểm sinh lý, sinh hóa để có thể khảo sát đầy đủ hơn một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của bốn chủng vi khuẩn chúng tôi tiến hành dùng bộ thử nghiệm sinh hóa định danh vi khuẩn gram âm để khảo sát một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác. Kết quả bộ thử nghiệm định danh IDS 14GNR được tóm tắt trên bảng 4.4 Bảng 4.4: Kết quả bộ thử nghiệm sinh hóa IDS14GNR. LM2 DS7 DS15 DN10 Oxydase + + + + ONPG – – + – Nitrate – – – – Citrate + – + + Indole + + + + PAD – – – – Malonate – – – – LDC + + + + Di động + + + + Glucose – – – + 46 Esculin – – – – Urease + + – + H 2 S – – – – VP – – + – 4.2.6. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển của vi khuẩn Hình 4.4: Đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ tế bào. Các chủng trong thí nghiệm đều có khả năng tăng trưởng tốt trên môi trường trong khoảng nhiệt độ biến thiên từ 20 – 30 0 C. Trong đó, nhiệt độ tối ưu cho ba chủng LM2, TS7, TD15 là 25 0 C và chủng TN10 là 30 0 C. kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Green và ctv (1992), [34]. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của các dòng vi khuẩn được biểu diễn trên hình Hình 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của vi khuẩn. y = 1.2566x + 7.165 R 2 = 0.9814 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 OD log (N/ml) 47 Hình 4.6: Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển của vi khuẩn. Trong khi đó, từ biểu đồ (hình 4.6) chúng tôi nhận thấy rằng các chủng đều có thể tăng trưởng tốt trong khoảng pH 5,0 – 7.5, tối ưu trong khoảng 6,5 – 7. Chủng TS7 có thể tăng trưởng trong khoảng pH từ aicd đến trung tính. Ngược lai, chủng TD15 lại có thể tăng trưởng trong khoảng pH từ acid đến pH hơi kiềm. 4.2.7. Đƣờng cong tăng trƣởng Dựa vào đường cong tăng trưởng (Hình 4.7)chúng tôi nhận thấy rằng các chủng tăng trưởng chậm trên môi trường nuôi cấy. Và theo Green và ctv (1992), thì vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium tăng trưởng chậm. Thời gian để vi khuẩn tăng trưởng tới pha ổn định có thay đổi giữa các dòng vi khuẩn. Dòng LM2 là 32 giờ, dòng TS7 là 40 giờ, dòng TN10 là 44 giờ và dòng TD15 là 36 giờ. Từ những dữ liệu này chúng tôi cho rằng thời gian tốt nhất để thu hoạch tế bào là sau 24 giờ. 48 Hình 4.7: Đường cong tăng trưởng của các chủng vi khuẩn. Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng được tóm tắt trong bảng 4.4 Bảng 4.4: Tổng hợp các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn. LM2 TS7 TN10 TD15 Acetate + - - + Arabinose - - + + Betaine + + - - Catalase + + + + Citrate + - + + Di dộng + + + + Esculine - - - - Ethanol + - + - Fructose - + + - Glucose - - + - Glutamate - + + - H 2 S - - - - Indole + + + + Lactose - - - + 49 LDC + + + + Malonate + + + + Maltose + + + + Manitol + + + + Methylamine + - - - Nitrate - - - - Oxidase + + + + PAD - - - - Serbacate - - + - Sucrose + + + + Trimethylamine - - + - Urea + + - + Kích thước khuẩn lạc 1 – 3mm 1 – 3mm 1 - 3mm 2 – 5mm Kích thước tế bào 0,99-1,45µm 0,99-1,98µm 0,99-2,19µm 1,32-2,64µm Màu sắc khuẩn lạc Pl Pl Pr P Hình dạng khuẩn lạc Tròn, lồi Tròn, lồi Tròn, lồi Tròn, lồi Nhiệt độ tối ưu (t 0 C) 25 25 30 25 pH tối ưu 6,5 6,5 6,5 6,5 Gram biến đổi Âm biến đổi Âm Chú thích: +: có sử dụng hay dương tính, -: không sử dụng hoặc âm tính, Pl: hồng nhạt, P: hồng, Pr: hồng đỏ. 4.3. Định danh vi khuẩn 4.3.1. Hệ số tƣơng đồng di truyền-Jaccard. Bảng 4.5: Hệ số tương đồng Jaccard từ 0 – 1 của các loài. Thứ tự Loài LM2 TS7 TN10 TD15 01 M. aminovorans 0,600 0,600 0,400 0,400 02 M. aquaticum 0,333 0,667 0,667 0,167 03 M. chloromethanicum 0,889 0,556 0,222 0,667 04 M. dichloromethanicum 0,778 0,545 0,273 0,364 05 M. extorquens 0,750 0,583 0,167 0,500 50 06 M. fujisawaense 0,333 0,333 0,667 0,583 07 M. hispanicum 0,667 0,667 0,667 0,333 08 M. isbiliense 0,833 0,500 0,500 0,667 09 M. lusitanum 0,727 0,545 0,273 0,727 10 M. mesophilicum 0,333 0,333 0,667 0,417 11 M. nodulans 0,667 0,333 0,500 0,667 12 M. organophilum 0,455 0,545 0,455 0,455 13 M. populi 0,667 0,667 0,333 0,500 14 M. radiotolerans 0,500 0,333 0,583 0,500 15 M. rhodesianum 0,727 0,636 0,273 0,545 16 M. rhodinum 0,545 0,455 0,636 0,545 17 M. suomiense 0,727 0,545 0,273 0,545 18 M. thiocynatum 0,400 0,333 0,500 0,500 19 M. variabile 0,333 0,667 0,667 0,167 20 M. zatmanii 0,667 0,583 0,333 0,667 21 1019 0,462 0,385 0,769 0,385 22 LM2 1,000 0,615 0,615 0,615 23 TS7 0,615 1,000 0,462 0,462 24 TN10 0,615 0,642 1,000 0,385 25 TD15 0,615 0,642 0,385 1,000 Từ hệ số tương đồng Jaccard chúng tôi có thể kết luận rằng chủng TS7 có quan hệ gần với bốn loài: M. variabile, M. populi, M. hispanicum và M. aquaticum. Chủng TD15 có quan hệ gần với loài M. hispanicum. Chủng LM2 rất có thể thuộc loài M. chloromethanicum. Chủng TN10 có quan hệ gần với chủng 1019, loài M. variabile, M. fujisawaense, M. aquaticum, M. hispanicum. M. mesophilicum. Tuy nhiên, kết quả định danh dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa chưa thể định danh chính xác các chủng có thuộc chi Methylobacterium hay không và phương pháp định danh bằng sinh lý, sinh hóa cũng không thể định danh các dòng vi khuẩn đã phân lập thuộc loài nào. Nên việc định danh vi khuẩn đã phân lập bằng các kỹ thuật sinh học phân tử là rất cần thiết. 51 300 base 234 base 4.3.2. Kết quả PCR 4.3.2.1. Kết quả định tính vi khuẩn chi Methylobacterium Khi khuếch đại DNA bộ gen bằng cặp mồi 2R và 2F các chủng điều tạo ra đoạn DNA đăc trưng khoảng 234base. Trong khi đó, theo nghiên cứu của Nishio và ctv (1997), [68] cho rằng cặp mồi 2F và 2R cho kết quả dương tính với 7 chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. Ngoài ra, ở chủng E.coli đối chứng âm không có đoạn DNA đặc trưng. Từ đó, chúng tôi có thể kết luận rằng các chủng đã phân lập thuộc chi Methylobacterium. Hình 4.8: Kết quả điện di trên gel sản phẩm PCR với cặp mồi 2F và 2R Chú thích: 1: E.coli, 2: LM2, 3: TS7, 4: TN10, 5: TD15, M: thang chuẩn (Ladder). 4.3.2.2. Kết quả khuếch đại trình tự 16S rDNA nguyên vẹn Do kết quả đoạn DNA đặc trưng chỉ có thể định danh các dòng vi khuẩn có thuộc chi Methylobacterium hay không, mà không cho kết quả định danh đến mức độ loài. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục khuếch đại trình tự 16S rDNA nguyên vẹn của vi khuẩn bằng cặp mồi FPGS6 và FPGS1509 [9]. Tuy nhiên, cặp mồi này tạo ra trình tự tương đối lớn gây khó khăn cho quá trình giải trình tự, nên chúng tôi sử dụng phối hợp với cặp mồi 2F và 2R sản phẩm tạo ra là hai đoạn khoảng 500base và 1200base (hình 4.9). 52 1200 base 500 base Chú thích: 1: LM2, 2: TS7, 3: TN10, 4: TD15, M: Ladder (Thang DNA chuẩn). Hình 4.9: Sản phẩm điện di trên gel với cặp mồi FPGS6 với 2R và FPGS1509 với 2F. 4.3.3. Kết quả giải trình tự và so sánh độ tƣơng đồng của các chủng với các loài Methylobacterium đã công bố. Kết quả giải trình tự được xác định độ chính xác bằng phần mềm fastPCR. Kết quả cho thấy rằng trong các mẫu giải trình tự chỉ có hai mẫu chính xác ở mức tinh cậy được là đoạn DNA 500base của mẫu LM2 và TN10, còn các mẫu còn lại có sự sai sót đáng kểtrong quá trình giải trình tự do mẫu chưa được tinh sạch. Do đó, chúng tôi chỉ tiến hành lấy hai trình tự đúng để so sánh với trình tự trên ngân hàng gen của BCBI. Kết quả so sánh trình tự với dữ lệu trên ngân hàng gene của NCBI (Mỹ). Bảng 4.6: Hệ số tương đòng Sj của chủng TN10 so với các chủng công bố Tên loài Độ tương đồng DNA (%) Độ tương đồng sinh hóa (Sj) M. aminovorans 96 0,400 M. chloromethanicum 96 0,222 M. dichlorometanicum 96 0,273 M. extorquens 96 0,167 M. jeotgali 96 N M. organophilum 96 0,455 M. podarium 96 N [...]... 53 M rhodesianum 96 0,2 73 M rhodinum 96 0, 636 M soumiense 96 0,2 73 M thiocyanatum 96 0,500 M zatmanii 96 0 ,33 3 1019 0,769 chú thích: Hệ số Sj được tính trong khoảng 0 – 1(0% - 100%), N: không xác định Bảng 4. 7: Hệ số tương đồng của chủng LM2 với các chủng đã công bố Tên loài Mức độ tương đồng DNA (%) Độ tương... khả năng kích thích sinh trưởng của thực vật ở điều kiện in vivo cũng như trong điều kiện in vitro của các loài thuộc chi Methylobacterium trên để có thể ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh dùng trong nông nghiệp, sử dụng làm nguyên liệu trong nuôi cấy mô tế bào và trong các lĩnh vực khác 58 Phần V: Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng vi t [1] Bùi Huy Đáp Một số vấn đề về cây lúa, NXB Nông Nghiệp, 1999 [2]... responses”, Pesq Agropec Bras., Brasília, Vol 35 , No 7, pp 134 3- 134 8 60 [19] Bloemberg, G V., and Lugtenberg, B J J 2001 Molecular basis of plant growth promotion and biocontrol by rhizobacteria Plant Biol 4 :3 43- 350 [20] Chistoserdova L., Chen S.-W., Lapidus A., Lidstrom M E., (20 03) “Methylotrophy in Methylobacterium extorquens AM1from a genomic point of view”, Journal of Bacteriology, Vol 185, No... of Sevilla, Spain”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol 55, pp 233 3- 233 7 [30 ] Gallego V., García T M.,Ventosa A (2005a) Methylobacterium hispanicum sp nov and Methylobacterium aquaticum sp nov., isolated from drinking water”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol.55, pp 281-287 [31 ] Gallego V., García T M.,Ventosa A (2005b) Methylobacterium. .. Microbiology Ecology, Vol 47, pp 31 9 -32 6 [ 73] Patten C L., Glick B R (2002) “Role of Pseudomonas putida indoleacetic acid in development of the host plant root system”, Applied and Environmental Microbiology, Vol 68, No 8, pp 37 95 -38 01 [74] Persello-Cartieaux F., Nussaume L., and Robaglia, C 20 03 Tales from the underground: Molecular plant-rhizobacteria interactions Plant Cell Environ 2 6:1 89-199 2004 [75] Picard... [ 83] Sanders J W., Martin J W., Hooke M., Hooke J (2000) “Methylobacterrium mesophylicum injection: case report and literature review of an unusual opportunistic pathogen”, Clinical Infectious Diseases, Vol 30 , pp 936 - 938 [84] Sato K., Ueda S., Shimizu S., (1977) “Form of vitamine B12 and its rolein a methanol utilizing bacterium, Protaminobacter ruber”, Applied and Enviromental Microbiology, Vol 33 ,... thuộc chi Methylobacterium có khả năng tổng hợp PHB Từ kết quả này chúng tôi có thể kết luận rằng, tất cả các chủng đã thử nghiệm có khả năng tổng hợp PHB Với các hạt sáng khác nhau chúng tôi cũng có thể khẳng định rằng các chủng có thể tổng hợp PHB ở nồng độ khác nhau Chú thích: DC: Mẫu đối chứng chủng E.coli Hình 4.1 2: Sự phát sáng của các hạt PHB dưới kính hiển vi huỳnh quang 57 Phần V: Kết luận và... Thị Hồng Tƣơi Thực tập vi sinh vật học NXB Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh, 2001 [7] Lê Duy Linh, Trần Thị Hƣờng, Trịnh Thị Hồng, Lê Duy Thắng Thực tập vi sinh cơ sở NXB Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh 2001 [8] Lê Thị Thuỳ Trâm 2006 Nghiên cứu thu nhận nhựa phân huỹ sinh học poly- -hydroxybutyrate (PHB) từ vi khuẩn Methylobacterium sp phân lập tại Vi t Nam luận văn thạc sĩ sinh hóa, Đại... No. 2: pp: 439 -471 [37 ] Hiraishi A., Furuhata K., Matsumoto A., Koike K A., Fukuyama M and Tabuchi K (1995) “Phenotypic and genetic diversity of chrorineresistant Methylobacterium strains isolated from various enviroment”, Applied and Enviromental Microbiobiology, Vol 61, No 6, pp 20992107 [38 ] Hirano S.S., and C D Upper 2000 Bacteria in the leaf cosystem with emphasis on Pseudomonas syringae: a pathogen,... biệt lớn với chủng 1019 và các loài Methylobacterium sp đã công bố nên chúng tôi cho rằng có thể hai chủng LM2 và TN10 là hai chủng mới Tuy nhiên, những kết luận này chưa chính xác 100% bởi vì trình tự 500 base chỉ có thể định danh vi khuẩn Methylobacterium tới mức độ chi và các đặc điểm sinh hóa cũng không thể định danh chính xác đến mức độ loài 55 4.4 Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp các hoạt chất . International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol. 55, pp. 233 3- 233 7. [30 ] Gallego V., García T. M.,Ventosa A. (2005a). Methylobacterium hispanicum sp. nov. and Methylobacterium. 0,667 0 ,33 3 08 M. isbiliense 0, 833 0,500 0,500 0,667 09 M. lusitanum 0,727 0,545 0,2 73 0,727 10 M. mesophilicum 0 ,33 3 0 ,33 3 0,667 0,417 11 M. nodulans 0,667 0 ,33 3 0,500. kết luận rằng các chủng đã phân l p thuộc chi Methylobacterium. Hình 4. 8: Kết quả điện di trên gel sản phẩm PCR với cặp mồi 2F và 2R Chú thích: 1: E.coli, 2: LM2, 3: TS7, 4: TN10, 5: TD15, M: