Khảo sát vi khuẩn Methylobacterium sp. trên lúa ở tây ninh

Khảo sát vi khuẩn Methylobacterium sp. trên lúa ở tây ninh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

* * * * *

KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN Methylobacterium sp TRÊN LÚA (Oryza sativa L.) Ở TÂY NINH

LUẬN VĂN KỸ SƯ

CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS BÙI VĂN LỆ BIỆN TUẤN AN Th.S KIỀU PHƯƠNG NAM KHÓA: 2002 - 2006

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY

* * * * *

INVESTIGATING Methylobacterium sp IN RICE (Oryza sativa

L.) AT TAY NINH PROVINCE

GRADUATION OF THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY

Professor: Student:

Assoc.Prof.PhD BUI VAN LE BIEN TUAN AN

HCMC, 8/2006

iv

LỜI CẢM ƠN

Em vô cùng biết ơn PGS TS Bùi Văn Lệ, Th.S Kiều Phương Nam, cùng toàn thể các

thầy cô, các anh, chị, và các bạn cùng làm việc trong Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ dẫn và giúp đỡ em trong suốt khóa thực tập tốt nghiệp tại trường Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu, cùng toàn thể giáo viên của trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ dẫn và dạy dỗ em trong suốt thời gian em học ở trường

Em vô cùng biết ơn các thầy cô của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Nông Lâm đã giúp đỡ em trong thời gian em học tại trường và trong khóa thực tập tốt nghiệp này

Cảm ơn các thành viên của lớp Công nghệ sinh học khóa 28 mến thương, đã cùng tôi chia sẽ những kỷ niệm buồn vui trong suốt thời gian học tập

Cảm ơn Bà Ngoại, cha mẹ và gia đình luôn ở bên con, luôn quan tâm đến con và nuôi con khôn lớn cho đến ngày hôm nay

Cảm ơn dì, dượng, cậu, mợ, đã động viên và giúp đỡ cho con

Cảm ơn toàn thể các thầy cô những người đã dạy dỗ con từ khi con vừa cắp sách đến trường

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006 Sinh viên thực hiện

Biện Tuấn An

v

TÓM TẮT

Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh tháng 8 năm 2005, đề tài nghiên cứu:

“Khảo sát hệ vi khuẩn Methylobacterium sp trên lúa (Oryza sativa L.) ở Tây

Ninh”

Đề tài do Biện Tuấn An thực hiện dưới sự hướng dẫn của: PGS.TS Bùi Văn Lệ

Th.S Kiều Phương Nam

Vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium là vi khuẩn có sắc tố hồng dinh dưỡng methyl

tuỳ ý (pink pigmented facultative methylotrophic – PPFM) có khả năng sử dụng nhiều hợp chất khác nhau từ một cacbon đến nhiều cacbon Là vi khuẩn có tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vự khác nhau vì chúng có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có lợi cho thực vật và con người

Mục đích của đề tài nhằm định danh các loài vi khuẩn Methylobacterium sp trên lúa

và khảo sát khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của vi khuẩn Được thực hiện qua các bước sau:

- Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp trên ruộng lúa

- Khảo sát các đặc điểm sinh lý sinh, sinh hóa của các chủng đã phân lập và làm thuần

- Định danh vi khuẩn đã khân lập bằng phương pháp PCR và giải trình tự vùng rDNA 16S nguyên vẹn của các chủng

- Khảo sát khă năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của các chủng đã định danh

- Định danh được các chủng đã phân lập thuộc chi Methylobacterium bằng

phương pháp PCR và giải trình tự Qua đó, kết luận sơ bộ mối quan hệ của các chủng so với các loài đã công bố

vi

- Khảo sát được khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp, trong đó có hai chủng có khả năng sinh tổng hợp auxin và bốn chủng có khả năng tích lũy PHB

Những kết quả trong nghiên cứu này đạt được nhờ sử dụng phối hợp phương pháp cổ điển và phương pháp hiện đại – là phương pháp phù hợp với những nghiên cứu vi sinh vật trong thời đại ngày nay

Kết quả của nghiên cứu này đã góp thúc đẩy những nghiên cứu về vi khuẩn

Methylobacterium có lợi, để có thể ứng dụng tạo chế phẩm vi sinh dùng trong nông

nghiệp, ứng dụng trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào và trong các lĩnh vực khác

2.2.2.1 Đặc điểm sinh thái và phân bố 12

2.2.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 13

2.3 Sự tương tác giữa thực vật và vi sinh vật 16

2.3.1 Sơ lược sự tương tác giữa vi sinh vật và thực vật 16

2.3.2 Sự tương tác giữa Methylobacterium với thực vật 17

2.3.3 Sự tạo các hợp chất thứ cấp bởi vi khuẩn Methylobacterium 19

2.3.4 Các ứng dụng khác của vi khuẩn Methylobacterium 21

2.4 Phương pháp định danh vi sinh vật 23

2.4.1 Định dang vi sinh vật bằng phương pháp truyền thống 23

2.4.2 Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử 24

2.4.2.1 Sơ lược kỹ thuật sinh học phân tử 24

2.4.2.2 Ứng dụng PCR và giải trình tự để định danh vi sinh vật 26

Phần III: Vật liệu và phương pháp 28

3.1 Vật liệu 28

viii

3.1.1 Mẫu thí nghiệm 28

3.1.2 Thiết bị, dụng cụ 28

3.1.3 Hóa chất 28

3.1.3.1 Môi trường phân lập và làm thuần 28

3.1.3.2 Môi trường giử giống vi khuẩn 29

3.1.3.3 Môi trường khảo sát khả năng sử dụng hợp chất cung cấp nguồn cacbon của vi khuẩn 29

3.1.3.4 Môi trường nhân sinh khối vi khuẩn 29

3.1.3.5 Bộ thử nghiệm sinh hóa định danh trực khuẩn gram âm IDS 14GNR 29

3.2 Phương pháp tiến hành thí nghiệm 30

3.2.6 Khảo sát các đặc điểm sinh lý sinh hóa 31

3.2.6.1 Thử nghiệm gram và đo kích thước tế bào 32

3.2.6.2 Mối quan hệ với oxy 33

3.2.6.3 Khả năng di động 34

3.2.6.4 Thử nghiệm khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn 34

3.2.6.5 Các thử nghiệm trong bộ thử nghiệm IDS 14GNR 34

3.2.6.6 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH 37

3.2.6.7 Xác định đường cong tăng trưởng của vi khuẩn 38

ix

3.3.5 Xử lý kết quả giải trình tự 41

3.4 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp 42

3.4.1 Định tính khả năng sinh tổng hợp auxin 42

3.4.2 Định tính khả năng sinh tổng hợp PHB 42

Phần IV: Kết quả và biện luận 44

4.1 Kết quả phân lập và làm thuần 44

4.2 Kết quả khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa 46

4.2.1 Kết quả thử nghiệm gram và đo kích thước tế bào 46

4.2.2 Mối quan hệ với oxy 46

4.2.3 Khă năng di động 47

4.2.4 Khả năng sử dụng chất cung cấp nguồn cacbon 47

4.2.5 Bộ thử nghiệm IDS 14GNR 49

4.2.6 Kết quả thử nghiệm nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn 50

4.2.7 Đường cong tăng trưởng tế bào 52

4.3 Kết quả định danh vi khuẩn 55

4.3.1 Hệ số tương đồng di truyền 55

4.3.2 Kết quả PCR 56

4.3.2.1 Kết quả định tính vi khuẩn chi Methylobacterium 56

4.3.2.2 Kết quả khuếch đại trình tự 16S rDNA nguyên vẹn 57

4.3.3 Kết quả giải trình tự và so sánh độ tương đồng của các chủng với các loài đã công bố 58

4.4 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp một số hợp chất thứ cấp 61

DMHF: 2,5-dimethyl-4-hydroxy-2Hfuran-3-one IAA: indole-3-acetic acid

MMS:môi trường methanol mineral salts

NCBI: National Center for Biotechnology Imformation OD: optical density

PCR: polymerase chain reaction PHB: poly- -hydroxybutyrate

PPFM: pink pigmented facultative methylotrophic rDNA: trình tự DNA mã hóa cho rRNA

RNA: ribonucleotide rRNA: RNA ribosome tRNA: RNA vận chuyển UV: ultraviolet

Zeatin: 4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine

xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Kiểu gen và phân bố của một số loài trong chi Oryza 6

Bảng 2.2: Các loài trong chi Methylobacterium được đặt tên 8

Bảng 2.3: Đặc điểm sử dụng các nguồn cacbon các loài trong chi Methylobacterium 24 Bảng 3.1: Hướng dẫn đọc kết quả bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR 36

Bảng 4.1: Danh sách các khuẩn lạc được phân lập và làm thuần 44

Bảng 4.2: Khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn 47

Bảng 4.3: Kết quả bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR 49

Bảng 4.4: Tổng hợp các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn 53

Bảng 4.5: Hệ số tương đồng di truyền Jaccard 55

Bảng 4.6: Hệ số tương đồng của chủng TN10 với các loài đã công bố 58

Bảng 4.7: Hệ số tương đồng của chủng LM2 với các loài đã công bố 59

xii

DANH SÁCH CÁC HÌNH-SƠ ĐỒ

Hình 2.1: Hình thái cây lúa 5

Hình 2.2: Hình dạng khuẩn lạc trên cỏ ba lá và tế bào vi khuẩn Methylobacterium dưới

kính hiển vi điện tử 13

Hình 2.3: sự gắn kết giữa chu trình serine và chu trình PHB trong quá trình biến dưỡng 15

Hình 2.4: Sự nhiễm của Methylobacterium sp ở cây dương nuôi cấy mô 22

Hình 3.1: Vị trí bắt cặp của các mồi trên vùng 16S rDNA 40

Hình 3.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng với cặp mồi 2F và 2R 40

Hình 3.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng với cặp mồi FPGS6 với 2R và FPGS1509 với 2F 41

Hình 4.1: Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường MMS 45

Hình 4.2: Hình dạng tế bào trong thử nghiệm gram với vật kính 100X 46

Hình 4.3: Khả năng sử dụng nguồn cacbon của vi khuẩn 48

Hình 4.4: Đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ tế bào 50

Hình 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tăng trưởng của vi khuẩn 50

Hình 4.6: Ảnh hưởng của pH đến sự tăng trưởng của vi khuẩn 51

Hình 4.7: Đường cong tăng trưởng của vi khuẩn 52

Hình 4.8: Kết quả điện di trên gel sản phẩm PCR với cặp mồi 2F và 2R 57

Hình 4.9: Kết quả điện di trên gel sản phẩm PCR với cặp mồi FPGS6 với 2R Và FPGS1509 với 2F 58

Hình 4.10: Cây phát sinh loài 60

Hình 4.11: Kết quả định tính auxin 61

Hình 4.12: Sự bắt sáng của các hạt PHB dưới kính hiển vi huỳnh quang 62

Phần I: Phần mở đầu

1.1 Đặt vấn đề

Cây lúa là cây lương thực chủ yếu của các nước châu Á và Việt Nam Cùng với sự gia tăng dân số trên toàn thế giới thì nhu cầu về lương thực nói chung và nhu cầu lúa gạo nói riêng đang ngày một tăng lên Vì vậy, một nhu cầu cấp thiết đặt ra là phải gia tăng diện tích gieo trồng và năng suất lúa Trong đó, việc gia tăng năng suất là chủ yếu Để gia tăng năng suất lúa thì việc áp dụng các thành tựu khoa học kỹ thuật, việc sử dụng hóa chất để khống chế sự phá hại của sinh vật gây bệnh cũng như để gia tăng sự phát triển của thực vật đem lại những hiệu quả nhất định Tuy nhiên, biện pháp sử dụng hóa chất đã và đang làm cho môi trường bị ô nhiễm nghiêm trọng Bên cạnh đó, lượng khí methan tạo ra do canh tác lúa nước là nguyên nhân gây ra hiệu ứng nhà kính Cho nên, kiến tạo một nền nông nghiệp bền vững là xu hướng chung hiện nay của thế giới cũng như ở Việt Nam Phương pháp này là dùng các nguyên liệu có nguồn gốc từ tự nhiên để kích thích sự phát triển của thực vật cũng như trong phòng trị bệnh và kiểm soát các tác nhân có hại mà không ảnh hưởng đến môi trường Một trong những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng là vi sinh vật Vì vi sinh vật không những có khả năng tạo ra các chất khác nhau, các hormone góp phần điều chỉnh sự tăng trưởng ở thực vật, mà còn có khả năng tạo ra tính kháng của thực vật với tác nhân gây hại Ngoài ra, vi sinh vật còn có khả năng biến dưỡng các chất có hại trong môi trường thành chất không có hại và thực vật có thể hấp thu dễ dàng Vi khuẩn

Methylobacterium cũng thuộc nhóm này, đây là nhóm vi khuẩn có sắc tố hồng dinh

dưỡng methyl tùy ý có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau và cũng có khả năng kích thích tính kháng cũng như tạo các chất có lợi, các hormon điều hòa sinh

trưởng của thực vật Theo Maliti (2000), một số chủng Methylobacterium sp có khả năng làm gia tăng tỷ lệ nẩy mầm, gia tăng chiều cao cây lúa non,… trong điều kiện in

vitro Năm 2004, Madhaiyan và ctv đã tiến hành thí nghiệm xử lý Methylobacterium

bằng cách trộn với hạt và phun trên lá, kết quả làm gia tăng sự đẻ nhánh của cây lúa, gia tăng năng suất lúa từ 22,1 – 24,1% Ngoài ra, cũng theo báo cáo này thì các chủng

Methylobacterium sp còn có vai trò giảm tỷ lệ cây bệnh từ 17,8 – 23,7% Từ những cơ

sở đó, để có thể hiểu rõ hơn về các chủng vi khuẩn Methylobacterium trên cây lúa và

mối quan hệ của vi khuẩn này với cây lúa Được sự chấp nhận của Bộ môn Công nghệ

Sinh học nên chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Khảo sát hệ vi khuẩn

Methylobacterium sp trên lúa (Oryza sativa L.) ở Tây Ninh” với sự hướng dẫn của

PGS.TS Bùi Văn Lệ và ThS Kiều Phương Nam

1.2 Mục đích và yêu cầu

Mục đích: Định danh và khảo sát một vài đặc điểm của vi khuẩn

Methylobacterium sp trên ruộng lúa

Yêu cầu:

Phân lập, làm thuần và định danh các chủng vi khẩn Methylobacterium sp bằng

phương pháp phân tích các đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa và trình tự rDNA 16S

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp một vài các hợp chất thứ cấp

Phần II: Tổng quan tài liệu

là lúa trồng xuất hiện cách đây 6000 năm, đối với lúa trồng châu Phi (Oryza

glaberrima) đã xuất hiện cách đây 3500 năm Còn một số tác giả khác cho là lúa trồng

châu Phi xuất hiện rất muộn, chỉ sau công nguyên, cách đây khoảng 1800 – 1900 năm [1],[23]

Về mặt phân bố thì cây lúa là loài thực vật có diện tích phân bố rộng, loài O

sativa phân bố kéo dài từ vĩ độ 35 độ Nam đến 50 độ Bắc trên 110 quốc gia Nhưng

khoảng 90% lượng gạo được sản xuất và tiêu thụ ở châu Á Diện tích gieo trồng chiếm khoảng 10% diện tích đất nông nghiệp trên thế giới (144 triệu ha) Lúa gạo được trồng từ độ cao bằng mực nước biển đến độ cao 3000m so với mực nước biển Lúa được trồng từ vùng ôn đới đến vùng nhiệt đới Lúa gạo có thể được trồng trên nhiều loại đất khác nhau đất chua, đất kiềm, đất nhiễm phèn [23]

Những dòng lúa có thể được phân chia thành 3 nhóm sinh thái, Indica (ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới), Javanica ( được trồng ở Indonesia) và Japonica (vùng ôn đới) Có hai dòng được canh tác nhiều nhất là Indica và Japonica [1], [2],[23]

2.1.2 Đặc điểm và phân loại 2.1.2.1 Đặc diểm chung

Lúa là loại thực vật cổ xưa, có tính đa dạng di truyền và hình thái hơn một số loại cây trồng khác Trong ngân hàng gen lúa thế giới (The International Rice Gene

Bank) đang giữ khoảng 100000 dòng lúa khác nhau, hầu hết thuộc O sativa [23] Lúa trồng O sativa có kích thước genome lưỡng bội (2n = 24) nhỏ (430 triệu

bp) Đây là genome nhỏ nhất trong số tất cả các genome của các cây lương thực khác

Và xấp xỉ 50% genome bao gồm những trình tự lặp lại Hầu hết các loài Oryza khác

cũng có nhiễm sắc thể lưỡng bội, tuy nhiên cũng có vài loài là tứ bội (2n= 48) [1], [23]

Cây lúa trồng châu Á O Sativa là cây thân thảo, có hệ thống rễ chùm, sống

hằng năm, có thời gian sinh trưởng thay đổi tùy theo giống lúa, vụ trồng, nơi trồng và các điều kiện sinh thái và kéo dài trong khoảng từ 75 – 250 ngày Cây lúa mọc thẳng đứng hay mọc nghiên rồi bò dài (lúa nổi), lúa sống ở cạn, đất cao hay nước ngập chân hoặc một phần thân hay trong nước sâu 2 – 4m Thân cao từ 70 – 150cm, một số giống lúa nổi có thân cao 2 – 3m, hay 5 – 6m (lúa nổi ở Bangladesh) Đốt thân nhẳn và cách nhau bởi những dóng dài, ngắn khác nhau Phiến lá thẳng hình đều, đầu lá nhọn, bề mặt phiến lá và mép lá đều ráp Bẹ lá có thìa lìa, lá dìa hình mũi mác hay chẻ đôi, các đầu chẻ đều nhọn Lúa thường tạo thành nhiều nhánh (dảnh lúa tillers), bao gồm cọng và lá có hoặc không có bông (panical) Lá mọc liên tiếp trên thân bao gồm bẹ lá bao lấy thân và phiến lá Cổ lá nối giữa phiến lá và bẹ lá có một lưỡi bẹ và hai thìa lìa từ cổ lá Bông mọc trên đốt trên cùng của thân từ bên trong lá cờ và mang nhiều hoa trong một bông con Cụm hoa là một chùm thưa, thẳng, hẹp, đầu hơi cong xuống dài 15 – 30cm hoặc dài hơn Hoa nhỏ hình thuôn dài, mày hoa thuôn dài hình mũi mác, hoa màu hồng vàng hay màu tím Lúa có hoa lưỡng tính, là hoa tự thụ phấn Hoa có sáu nhị đực mảnh, bao phấn dài, bầu hoa có vòi, nhụy ngắn và hai đầu nhụy có lông tơ [1], [2], [23]

Hình 2.1: Hình thái cây lúa [23]

Có ba giai đoạn chính trong quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa theo viện nghiên cứu lúa quốc tế (International Rice Research Institution, 2002):

- Nẩy mầm và sinh trưởng sinh dưỡng - Giai đoạn phát triển cơ quan sinh sản - Giai đoạn hạt chín [23]

2.1.2.2 Phân loại

Chi Oryza thuộc bộ Oryzeae của họ Poaceae Có 12 giống bên trong bộ

Oryzeae Chi Oryza bao gồm khoảng 22 loài trong đó có 20 loài lúa hoang và hai loài

lúa trồng là: O Sativa và O glaberrima Oryza sativa được trồng khắp nơi bao gồm châu Á, Bắc và Nam Mỹ, châu Âu, Trung Đông và châu Phi Còn O glaberrima được

trồng chủ yếu ở các nước Tây Phi [23]

Bảng 1.1: Kiểu gen và vùng phân bố của một số loài trong chi oryza [23]

Loài oryza Kiểu gen châu Phi Trung và Nam Mỹ

châu Á châu Đại Dương

O sativa complex

O sativa O glaberrima O barthii O glumaepatula O longistaminata O meridionalis O nivara O rufipogon

O officinalis complex

O punctata O alampuzhaensis O minuta

O eichingeri O officinalis O rhizomatis O alta

O grandiglumis O latifolia O australiensis

O brachyantha O granulata complex

O granulata O meyeriana

O ridleyi complex

O longiglumis O ridleyi

O schlechteri

AA AA AA AA AA AA AA AA

BB,BBCC BBCC BBCC CC CC CC CCDD CCDD CCDD EE FF

GG GG

HHJJ HHJJ ??

+ + +

+

+ +

+ + + + +

+ +

Chú thích: AA, BB, BBCC, CC, CCDD, EE, FF, GG, HHJJ: là các kiểu gen; ??: chưa biết kiểu gen; +: có phân bố

2.2 Vi khuẩn Methylobacterium

2.2.1 Lịch sử phát hiện và phân loại

Chi Methylobacterium bao gồm nhiều loài vi khuẩn có sắc tố hồng dinh dưỡng

methyl tùy ý (pink – pigmented facultatively methylotrophic; PPFM) Chúng là những vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường có chứa hợp chất một cacbon như: formate, formaldehyde và methanol Hầu hết các loài có thể phát triển trên môi trường nutrient agar, một số loài có khả năng phát triển trên môi trường có bổ sung

methylamine Chỉ một loài M organophilum được cho là có thể sử dụng methan như

nguồn cacbon chủ yếu [34]

Loài Methylobacterium được mô tả và phân lập đầu tiên do Bassalik năm 1913 từ giun đất và được đặt tên là Baccillus extorquens Trong giai đoạn trước năm 1960, nhiều loài vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium đã được phân lập nhưng do không có

đầy đủ thông tin nên các loài này được phân loại vào các chi vi khuẩn khác nhau:

Pseudomonas, Flavobacterium, Protaminobacter, Arthrobacter, Corynbacterium,

…[34]

Mãi đến năm 1974, Patt và ctv phân lập được loài vi khuẩn PPFM đầu tiên có

khả năng sử dụng methan, loài này được xếp vào một chi mới là Methylobacterium với tên loài là M organophilum Tuy nhiên, chi này mô tả chỉ dựa trên khả năng sử dụng methan của một loài vi khuẩn duy nhất là M organophilum nên đã gây nhiều khó khăn

cho những nghiên cứu phân loại sau này [34]

Đến năm 1982, Green và Bousfield đã nhận thấy rằng loài M organophilum có

nhiều đặc điểm giống với các loài PPFM đã được công bố trước đây (tuy là chúng không có khả năng sử dụng methan) Tất cả 149 loài đã được nghiên cứu nhờ 140 đặc

điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái của chúng so với loài M organophilum cho thấy

rằng sự tương đồng giữa chúng là 70% Từ kết quả này Green và Bousfield đã đề nghị

xếp loài vi khuẩn PPFM vào chi Methylobacterium [34]

Đến ngày 10 tháng 7 năm 2006 đã có 24 loài Methylobacterium sp được đặt tên

dựa trên các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và trình tự rDNA 16S khác biệt giữa các loài

khác nhau Trong đó có những loài mới có những đặc điểm đặc biệt như M

chloromethanicum có khả năng sử dụng chloromethane (đặc trưng duy nhất chỉ có ở

loài này), M thiocianatum có khả năng sử dụng thiocyanate hay cyanase là nguồn

cung cấp nitrogen,…[63], [99], [104]

Bảng 2.2: Các loài trong chi Methylobacetrium đã được đặt tên

Số thứ tự

adhaesivum sp nov., a methylotrophic bacterium isolated

from drinking water Int J Syst Evol Microbiol., 2006, 56,

339-342

2 M aminovorans Urakami, Araki, Suzuki And Komagata: Further studies

of the genus Methylobacterium and description of

Methylobacterium aminovorans sp nov Int J Syst

Bacteriol., 1993, 43, 504-513

hispanicum sp nov and Methylobacterium aquaticum sp

nov., isolated from drinking water Int J Syst Evol

Microbiol., 2005, 55, 281-287

4 M chloromethanicum McDonald, Doronina, Trotsenko, Mcanulla and Murrell:

Hyphomicrobium chloromethanicum sp nov and

Methylobacterium chloromethanicum sp nov., chloromethane-utilizing bacteria isolated from a polluted

environment Int J Syst Evol Microbiol., 2001, 51,

119-122

5 M dichloromethanicum Doronina, Trotsenko , Tourova , Kuznetsov and Leisinger: Methylopila helvetica sp nov and

Methylobacterium dichloromethanicum sp nov a novel

aerobic facultatively methylotrophic bacteria utilizing

dichloromethane Syst Appl Microbiol., 2000, 23, 210-218

6 M extorquens Bousfield and Green: Reclassification of bacteria of the

genus Protomonas Urakami and Komagata 1984 in the genus Methylobacterium (Patt, Cole, and Hanson) emend

Green and Bousfield 1983 Int J Syst Bacteriol., 1985, 35,

209

7 M fujisawaense Green, Bousfield And Hood: Three new Methylobacterium

species: M rhodesianum sp nov., M zatmanii sp nov., and

M fujisawaense sp nov Int J Syst Bacteriol., 1988, 38,

description of Methylobacterium goesingense sp nov." Sys

Appl Microbiol (in press as of 20 February 2006)

hispanicum sp nov and Methylobacterium aquaticum sp

nov., isolated from drinking water Int J Syst Evol

Microbiol., 2005, 55, 281-287

9 M isbiliense Gallego, García And Ventosa: Methylobacterium isbiliense

sp nov., isolated from the drinking water system of Sevilla,

Spain Int J Syst Evol Microbiol., 2005, 55, 2333-2337

Biological Sciences, KAIST, Daejeon 305-701, S Korea

Salkinoja-Salonen: Methylobacterium suomiense sp nov

and Methylobacterium lusitanum sp nov., aerobic, pigmented, facultatively methylotrophic bacteria Int J

pink-Syst Evol Microbiol., 2002, 52, 773-776

12 M mesophilicum Green and Bousfield: Emendation of Methylobacterium

Patt, Cole, and Hanson 1976; Methylobacterium rhodinum (Heumann 1962) comb nov corrig.; Methylobacterium

radiotolerans (Ito and Iizuka 1971) comb nov., corrig.; and Methylobacterium mesophilicum (Austin and Goodfellow

1979) comb nov Int J Syst Bacteriol., 1983, 33, 875-877

13 M nodulans Jourand, Giraud, Béna, Sy, Willems, Gillis , Dreyfus

And De Lajudie: Methylobacterium nodulans sp nov., for a

group of aerobic, facultatively methylotrophic, legume

root-nodule-forming and nitrogen-fixing bacteria Int J Syst

Evol Microbiol., 2004, 54, 2269-2273

14 M organophilum Skerman, Mcgowan And Sneath (editors): Approved Lists

of Bacterial Names Int J Syst Bacteriol., 1980, 30, 420 Patt, Cole and Hanson: Methylobacterium, a new

225-genus of facultatively methylotrophic bacteria International

Journal of Systematic Bacteriology, 1976, 26, 226-229.]

15 M podarium Anesti, Vohra, Goonetilleka, McDonald, Straubler, Stackebrandt, Kelly and Wood Molecular detection and

isolation of facultatively methylotrophic bacteria, including

Methylobacterium podarium sp nov., from the human foot

microflora Environ Microbiol 6 (8), 820-830 (2004) 16 M populi Van Aken, Peres, Lafferty Doty , Yoon And Schnoor:

Methylobacterium populi sp nov., a novel aerobic,

pink-pigmented, facultatively methylotrophic, methane-utilizing

bacterium isolated from poplar trees (Populus deltoides x

nigra DN34) Int J Syst Evol Microbiol., 2004, 54,

1191-1196

17 M radiotolerans Green And Bousfield: Emendation of Methylobacterium

Patt, Cole, and Hanson 1976; Methylobacterium rhodinum (Heumann 1962) comb nov corrig.; Methylobacterium

radiotolerans (Ito and Iizuka 1971) comb nov., corrig.; and Methylobacterium mesophilicum (Austin and Goodfellow

1979) comb nov Int J Syst Bacteriol., 1983, 33, 875-877

18 M rhodesianum Green, Bousfield And Hood: Three new Methylobacterium

species: M rhodesianum sp nov., M zatmanii sp nov., and

M fujisawaense sp nov Int J Syst Bacteriol., 1988, 38,

124-127

19 M rhodinum Green And Bousfield: Emendation of Methylobacterium Patt, Cole, and Hanson 1976; Methylobacterium rhodinum

(Heumann 1962) comb nov corrig.; Methylobacterium

radiotolerans (Ito and Iizuka 1971) comb nov., corrig.; and Methylobacterium mesophilicum (Austin and Goodfellow

1979) comb nov Int J Syst Bacteriol., 1983, 33, 875-877

21 M soumiense Doronina, N.V., Trotsenko, Y.A., Kuznetsov, B.B., Tourova, T.P and Salkinoja-Salonen, M.S

"Methylobacterium suomiense sp nov and

Methylobacterium lusitanum sp nov., aerobic,

pink-pigmented, facultatively methylotrophic bacteria." Int J

Syst Evol.Microbiol (2002) 52:773-776

22 M thiocyanatum Wood, Kelly, McDonald, Jordan, Morgan, Khan, Murrell and Borodina:A novel pink-pigmented facultative

methylotroph, Methylobacterium thiocyanatum sp nov.,

capable of growth on thiocyanate or cyanate as sole nitrogen

sources Arch Microbiol., 1998, 169, 148-158

23 M variabile Gallego, García And Ventosa: Methylobacterium variabile

sp nov., a methylotrophic bacterium isolated from an

aquatic environment Int J Syst Evol Microbiol., 2005, 55,

1429-1433

24 M zatmanii Green, Bousfield And Hood: Three new Methylobacterium

species: M rhodesianum sp nov., M zatmanii sp nov., and

M fujisawaense sp nov Int J Syst Bacteriol., 1988, 38,

124-127

Vị trí phân loại chi Methylobacterium trong giới vi sinh vật như sau [41]:

Giới: Bacteria

Ngành: Proteobacterium Lớp: Alphaproteobacteria Bộ: Rhizobiales

Họ: Methylobacteriaceae

2.2.2 Đặc điểm chung

2.2.2.1 Đặc điểm sinh thái và phân bố

Vi khuẩn Methylobacterium phân bố rộng trong tự nhiên, hiện hiện ở nhiều

môi trường khác nhau: môi trường đất, nước, không khí, băng ở hai cực, bề mặt lá cây, nốt sần rễ thực vật, ở hạt, thực phẫm, mỹ phẫm, môi trường bệnh viện, dung dịch ngâm xác động vật, có ở miệng và bề mặt da người, trong máu bệnh nhân nhiễm HIV [9], [11], [25], [29], [30], [31], [34],[94]

Sự hiện diện của vi khuẩn PPFM trên thực vật rất đa dạng chúng đã được phân lập từ hơn 100 loài thực vật khác nhau, từ dương xỉ và các loại rêu đến thực vật

hạt trần và thực vật hạt kín Hirano và Upper (1992), tìm thấy Methylobacterium chiếm hơn 90% của hệ vi khuẩn hiếu khí trên cây Phaseolus vulgaris trong suốt các

mùa khác nhau Năm 1978, Austin và Googfellow đã phân lập Methylobacterium từ lá

cây Lolium perenne Pirttila và ctv (2000), đã chứng minh rằng vi khuẩn

Methylobacterium sp hiện diện bên trong chồi của cây thông (Pinus sylvestris) hay

nằm trong các bó mạch của cây họ cam chanh (Citrus) Vi khuẩn Methylobacterium

còn hiện diện trên hạt Vi khuẩn PPFMs định cư trên bề mặt lá ở dạng kết hợp lại và trong giữa các tế bào biểu bì Omer và ctv (2004) Sự định cư của vi khuẩn

Methylobacterium trên rễ cũng đã được ghi nhận trên nhiều loài thực vật khác nhau

Hình 2.2: Hình dạng khuẩn lạc trên cỏ ba lá (A, C) và tế bào (B) vi khuẩn

Methylobacterium 0

2.2.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

Hầu hết các loài Methylobacterium sp thường có hình que kích thước 0,8 –

1 x 1 – 8 m Tế bào thường có hình dạng phân nhánh hay có những dạng bất thường khác, đặc biệt thường xuất hiện ở pha cuối của quá trình tăng trưởng Vi khuẩn

Methylobacterium thường ở dạng tế bào đơn hay kết đôi lại theo dạng hoa hồng

[34],[86]

Hầu hết các chủng Methylobacterium sp đều có khả năng di động nhờ một

tiêm mao ở cực hay gần cực Tuy nhiên, vài loài thì không Đa số các loài vi khuẩn

Methylobacterium sp là vi khuẩn gram âm, một số có gram biến đổi Vi khuẩn Methylobacterium thường tăng sinh chậm, khuẩn lạc có màu hồng đậm hay đỏ cam,

một vài chủng không tăng trưởng trên môi trường nutrient agar Sắc tố hồng vi khuẩn

Methylobacterium không tan trong nước và là hợp chất carotenoid Ở môi trường lỏng,

nuôi cấy tỉnh vi khuẩn Methylobacterium tạo thành một lớp mỏng trên bề mặt, đều này

cho thấy hầu hết các chủng đều là hiếu khí bắt buộc Chúng có phản ứng oxydase dương tính yếu, catalase âm tính hay dương tính tùy thuộc vào loài vi khuẩn

Methylobacterium sp là những vi khuẩn dị hóa sinh dưỡng có khả năng sử dụng các

hợp chất methyl Do vây, tất cả các loài có khả năng tăng trưởng trên môi trường có bổ sung formaldehyde ở nồng độ thấp, formate và methanol, một vài loài có khả năng sử

dụng hợp chất methylamine chỉ có một loài duy nhất là M organophilum có thể sử dụng methan là nguồn cung cấp cacbon và năng lượng Ngoài ra, M

chloromethanicum có thể sử dụng chloromethane và M thiocinatum có thể sử dụng

thiocinate Một số loài có khả năng lên men lactose, có phản ứng LDC, Urease dương tính Một số loài có khả năng sinh indole và một số loài có khả năng khử nitrate thành nitrite [10], [24], [25], [29], [30], [31], [34], [41], [57]

Phương thức chuyển hóa các hợp chất một cacbon ở tất cả các loài vi khuẩn

Methylobacterium đều theo chu trình serine Trong đó có sự gắn kết giữa chu trình

serine và chu trình tricarboxylic (TCA) để tạo ra các sản phẩm hữu cơ cuối cùng cho vi khuẩn sử dụng Ngoài ra, các chu trình này còn gắn kết với chu trình PHB để tạo ra các sản phẩm dự trữ cho vi khuẩn (poly – – hydroxybutyrate) Một số chủng có khả năng tổng hợp hormone thực vật (phytohormone) trong môi trường nuôi cấy, một số loài có khả năng tổng hợp vitamine B12 và một số chất khác [10], [24], [55], [58], [61], [68],[84], [90]

chú thích:

1, crotonyl-CoA reductase 2, L-crotonase

3, NADH-linked acetoacetyl-CoA reductase

4, D-crotonase 5, b-ketothiolase

6, NADPH-linked acetoacetyl-CoA reductase

7, PHB synthase 8, PHB depolymerase

9, -hydroxybutyrate dehydrogenase 10, acetoacetate–succinyl-CoA transferase

Hình 2.3: Sự gắn kết giữa chu kỳ serine và chu kỳ PHB trong quá trình biến dưỡng [52]

Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của các loài thuộc chi Methylobacterium

biến thiên từ 25 – 300C Một vài loài có thể phát triển ở nhiệt độ 370C hay 510C Đa số các loài đều tăng trưởng trong khoảng pH trung tính, một số loài vẫn có khả năng phát triển ở các giá trị pH từ 4 – 10 [34]

Vi khuẩn Methylobacterium có tính kháng cao với chất khử, nhiệt độ lạnh, Cl, tia UV, phóng xạ ion, và nhiệt độ cao Phần lớn các loài trong chi Methylobacterium đều nhạy cảm với kháng sinh như: kanamycine, albamycine T, streptomycine,

-framycine và tetracycline Trong đó, tetracycline có ức chế mạnh đối với vi khuẩn Methylobacterium Ngoài ra, các loài Methylobacterium sp có khả năng đề kháng với

nhiều chất kháng sinh như: cephalothine, acid nalidicic, penicyline, bacitracine,

carbenicillin, colestin sulfate, polymycine B và nitrofurantoin [29], [34], [37], [102]

Khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ cung cấp nguồn cacbon và năng lượng

của chủng vi khuẩn PPFM thuộc chi Methylobacterium rất đặc trưng Hầu hết các

chủng có khả năng sử dụng betaine, trimethylamine, serbactae,…Trong khi một số loài khác có khả năng sử dụng cyanate, thiocianate, formaldehyde, TNT (2,4,6-trinitrotoluene), HMX (octahydro-1,3,5,7-tetranitro-1,3,5,7tetrazicine hay high-melting-point explosive), RDX (hexahydro-trinitro-1,3,5-triazine hay royal

explosive),…Do vậy, có thể phân biệt các loài vi khuẩn Methylobacterium sp nhờ căn

cứ vào khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ của các chủng vi khuẩn này [9],[25], [28], [34],[58],[89]

Một vài loài vi khuẩn Methylobacterium sp còn có bacterochlorophyll trong

vài điều kiện nuôi cấy đặc biệt, từ đó cho thấy khả năng tự dưỡng của một vài loài vi

khuẩn Methylobacterium sp [34]

2.3 Sự tương tác giữa vi sinh vật và thực vật

2.3.1 Sơ lược về tương tác giữa vi sinh vật và thực vật

Giữa thực vật và vi sinh vật có mối quan hệ mật thiết với nhau, và đây là mối quan hệ rất phức tạp Trong mối quan hệ đó, vi sinh vật có thể là tác nhân có lợi và cũng có thể là tác nhân có hại cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Sự định cư của vi sinh vật trên thực vật rất đa dạng có thể trên thân, lá, rễ và cả ở cơ quan sinh sản như hoa, quả, hạt [9],[13], [14], [17], [18], [19], [21], [33], [32], [35], [38], [43], [44],… Theo Hirano và ctv (1983), cho rằng lá là nơi hổ trợ cho sự phát triển của

nhiều loài vi sinh vật và phần lớn trong số đó là vi sinh vật gây bệnh Pseudomonas

syringae là một ví dụ cụ thể cho trường hợp trên và chúng có thể gây bệnh cho nhiều

loài thực vật khác nhau [9], [38]

Ngoài ra, có nhiều vi sinh vật gây bệnh khác cũng đã được ghi nhận trên

nhiều loài thực vật khác nhau như: nấm Phytophthora, Xanthomonas,…[82] Tuy

nhiên, bên cạnh các vi sinh vật có hại cũng tồn tại nhiều vi sinh vật có lợi cho thực vật Cơ chế tạo ra ảnh hưởng có lợi của vi sinh vật lên thực vật rất đa dạng Trong trường hợp của vi khuẩn sống ở rễ chúng có thể biến dưỡng nitrogen từ khí quyển thành nitrate, ammonia, tạo các chất trung gian để cô lập các chất khoáng cho thực vật, tổng hợp các phytohormone, hay tổng hợp các chất trung gian để cô lập các chất khoáng cần thiết cho vi sinh vật gây bệnh, làm cho vi sinh vật gây bệnh không thể sử dụng được các chất khoáng này hay tổng hợp các chất kháng vi sinh vật gây bệnh cho thực vật như các chất kháng sinh, các enzyme thủy phân vách tế bào, các hydrogen cyanide để ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh hay kích thích tạo tính kháng bệnh của

thực vật [19], [33], [50], [74] Trong đó, nấm Trichoderma là nấm hiện diện trên nhiều

thực vật, trên nhiều cơ quan khác nhau và chúng là nấm có lợi, không những chúng có khả năng gia tăng tăng trưởng, gia tăng năng suất mà còn gia tăng khả năng kháng

bệnh của cây đối với các bệnh gây hại do Fusarium, Alternaria, Cochliobolus

heterostrophus, Rhizoctonia solani,… [17], [35], [44], [56] Trong mối quan hệ đó, sự cộng sinh giữa cây họ đậu và vi khuẩn đất được cho là nhân tố quan trọng cho môi trường và trong nông nghiệp đã được nghiên cứu từ rất sớm Vi khuẩn rễ có thể tìm

thấy trong hầu hết 18.000 loài của họ đậu Leguminosae (thực vật hai lá mầm), ở rễ cây

mía (thực vật một lá mầm) và nhiều loài thực vật khác [9], [70], [87], [97]

Cơ chế ảnh hưởng lên sự phát triển của thực vật bởi vi sinh vật trong điều kiện

in vitro cũng đã được nghiên cứu và chứng minh Một số vi sinh vật có khả năng kích

thích sự phát triển hình thái và tăng trưởng của thực vật Vi khuẩn Methanotrophic là

một ví dụ điển hình, có khả năng kích thích sự hình thành callus (mô sẹo) của hạt lúa mì và gia tăng khả năng tạo rễ trong môi trường nuôi cấy, vì vậy làm cho tỷ lệ tái sinh cây cũng đạt hiệu quả và rút ngắn được thời gian Sự gia tăng khả năng tạo callus (mô sẹo) và tạo rễ cũng được ghi nhận khi thí nghiệm đối với phôi hạt bắp [47], [48]

Từ những cơ sở trên, có thể khẳng định rằng, sự tương tác giữa vi sinh vật với thực vật không những chỉ là mối quan hệ gây hại cho nhau mà đôi khi quan hệ này lại

tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của thực vật trong điều kiện in vivo cũng như trong điều kiện in vitro

2.3.2 Sự tương tác giữa Methylobacterium với thực vật

Vi khuẩn PPFM (pink-pigmented facultative methylotrophic) là nhóm vi

khuẩn đặc trưng thuộc chi Methylobacterium được phân lập ở hơn 100 loài thực vật từ rêu, địa y, thực vật hạt trần và thực vật hạt kín Methylobacterium sp là loài tồn tại lâu

dài và chiếm tỷ lệ lớn nhất trên bề mặt lá được rửa sạch Holland và ctv (1994), cho rằng việc khử trùng thông thường trong việc chuẩn bị mẫu cho nuôi cấy mô không loại

được vi khuẩn Methylobacterium Đây là nhóm vi khuẩn phong phú và phổ biến trên thực vật, phân bố chủ yếu ở lá, đặt biệt ở lá non Ngoài ra, Methylobacterium còn sống

ở rễ và hạt Mật độ của PPFM trong khoảng 104 – 107 cfu (colony forming unit) trên mỗi gram trong lượng tươi của mô thực vật và ở hạt đậu nành khô thì mật độ khoảng 105 cfu/gram [40], [59], [60]

Mặc dù vi khuẩn PPFM tăng trưởng rất chậm so với các chủng vi khuẩn khác trên bề mặt lá, nhưng chúng vẫn có khả năng tồn tại với số lượng lớn và có khả năng tạo khuẩn lạc là do chúng sử dụng nguồn dinh dưỡng khác thường – methanol (chỉ thích hợp với một số vi khuẩn) Methanol thường được tạo ra trong quá trình phân hủy pectin từ mô, đặc biệt là ở mô đang hoạt động sinh trưởng [55], [71], [72]

Mối quan hệ giữa vi khuẩn PPFM với thực vật không phải là mối quan hệ một chiều, mà cùng với việc hấp thu các chất tiết ra thực vật thì vi khuẩn PPFM có thể tổng hợp và tiết ra các chất khác nhau có lợi cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật Chủng PPFM đầu tiên được phân lập bởi Basile và ctv (1969), có khả năng

kích thích sinh trưởng của cây địa tiền (liverwort, Scapania nemorosa) trong môi trường nuôi cấy in vitro Sau đó, Corpe và Basile (1982), chứng minh rằng PPFM gia

tăng khả năng tạo callus (mô sẹo), gia tăng khả năng tái sinh cây từ mô cây anh thảo

(cây báo xuân) Streptocarpus prolixus Corpe và Basile (1982), cũng chứng minh được

rằng vi khuẩn PPFM có khả năng tổng hợp vitamine B12 (cyanocobalamine) và kích

thích sinh trưởng, phát triển của cây rêu Jungermannia leiantha và Gymnocolea inflata

[39], [40], [51], [84]

Các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh được rằng, vi khuẩn PPFM có khả năng tương tác với cây đậu nành trong việc chuyển hóa nicken, PPFM có khả năng gia tăng tỷ lệ nẩy mầm của hạt, cũng như gia tăng năng suất cây đậu nành Khả

năng kích thích tăng trưởng, gia tăng năng suất của thực vật khi xử lý PPFM trên lá

cũng được ghi nhận trên cây bông (Gossypium hirsutum L.) và cây mía (Saccharum

officinarum L.) Trong nghiên cứu của Maliti (2000), thì một số chủng PPFM có khả

năng gia tăng khả năng tạo callus (mô sẹo) từ phôi hạt lúa, trong khi một số chủng khác lại có khả năng kích thích sinh trưởng và phát triển của các cơ quan như lá, rễ, thân lúa Nhưng một số chủng khác lại ức chế phát triển của rễ lúa Trong nghiên cứu của Madhaiyan và ctv (2005), đã chỉ ra rằng tất cả các chủng vi khuẩn

Methylobacterium sp trong nghiên cứu có khả năng kích thích sự nẩy mầm của hạt

lúa, kích thích tăng trưởng, gia tăng tỷ lệ tạo nhánh, gia tăng khả năng kháng bệnh và

giảm tỷ lệ cây bệnh với Rhizoctonia solani, cũng như góp phần làm gia tăng năng suất

lúa (hơn 55,44g/ lỗ) [40], [59], [60], [61]

2.3.3 Sự tạo các hoạt chất thứ cấp bởi Methylobacterium có lợi cho thực vật

Mặc dù có nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng kích thích sinh trưởng của PPFM lên thực vật Tuy nhiên, cơ chế của khả năng kích thích này chưa được hiểu rõ và thống nhất vẫn còn có nhiều giả thuyết khác nhau đó là:

- Sự cô lập, chuyển hóa các khoáng dinh dưỡng (bao gồm khoáng vi hay đa lượng) từ môi trường hoặc từ đất cho cây Cơ chế cô lập các khoáng dinh dưỡng liên quan đến sự tổng hợp các phân tử có lợi cho quá trình hấp thu những ion Cơ chế này đã được chỉ ra ở vi khuẩn rễ ở một số thực vật [46], [61], [93] - Sự tổng hợp các phytohormone hay các hợp chất tương tự phyohormone được

phóng thích vào môi trường hay vào hệ thống mạch của thực vật Cơ chế này bao gồm sự tổng hợp cytokinin, auxin và hợp chất tương tự auxin bởi một vài chủng PPFM [24], [39], [40], [55], [71], [72]

- Sự tổng hợp và giải phóng các enzyme tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sinh hóa hay sinh lý của mô thực vật Sự tổng hợp enzyme urease bởi vi sinh vật đã được chỉ ra ở nhiều chủng PPFM Urease rất cần thiết trong quá trình biến dưỡng nitrogen ở thực vật [40], [61]

- Cơ chế thứ tư góp phần gia tăng sự tăng trưởng của cây lúa nói riêng và các cây trồng khác nói chung có thể là do sự tổng hợp và phóng thích vitamine B12 hoặc những hợp chất tương tự Nghiên cứu của Basile và ctv (1985), đã chứng minh rằng việc bổ sung vitamine B12 nồng độ thấp có thể gia tăng sự tăng trưởng của

hai loài địa tiền - liverwort in vitro [61], [84]

Khả năng tổng hợp các phytohormone không chỉ hiện diện ở thực vật mà còn diễn ra ở cả vi sinh vật Khả năng tổng hợp các phytohormone đã được xác định ở nhiều vi sinh vật Những vi khuẩn sống trong đất và vi khuẩn quan hệ với thực vật có khả năng tổng hợp phytohormone bao gồm vi khuẩn gram âm, gram dương, vi khuẩn gây bệnh cho thực vật, vi khuẩn cộng sinh và vi khuẩn biến dưỡng nitrogen Nhiều loài vi khuẩn trong nhóm này có thể tổng hợp và tiết vào môi

trường nuôi cấy nhiều hơn một hormone Chủng Rhizobium có thể tổng hợp gibberellins (GA) và auxin, Azotobacter spp có thể tổng hợp GA, auxin và cytokinins, Acetobacter và Herbaspirillum có thể tổng hợp IAA và GA Nên chúng có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật trong điều kiện in vivo cũng như in vitro [24], [71]

Sự tổng hợp IAA của một số PPFM cũng đã được ghi nhân Sự tạo indole và dẫn xuất của chúng từ L- tryptophan là môt đặc trưng phân biệt của những vi khuẩn gram âm hiếu khí Trong nghiên cứu của Ivanova và ctv (2001), bằng cách sử

dụng những thuốc thử Salkowski và Van Urk đã chỉ ra rằng 4 loài Methylobacteria là Methylobacterium mesophilicum, Aminobacter aminovorans, Methylovorus mays và Paracoccus kondratievae có thể tạo IAA Trong nghiên cứu của Omer và ctv (2004), chứng minh rằng vi khuẩn hiếu khí Methylobacteria có thể tổng hợp auxin

(chủ yếu là IAA) từ L-tryptophan ngoại bào PPFM cũng có thể tổng hợp lượng nhỏ IAA trong môi trường với peptone là nguồn cacbon và nitrogen Trong nghiên cứu khác của Omer và ctv (2004), chỉ ra rằng ba trong số 16 chủng PPFM được kiểm tra trong môi trường nuôi cấy lỏng có thể tổng hợp IAA Ba chủng tạo IAA đã tích lũy phytohormone với khối lượng biến thiên trong khoảng 6 – 13,3mg/l trong môi trường bổ sung L-tryptophan và 1,1 – 2,4mg/l khi không bổ sung L-tryptophan vào môi trường nuôi cấy, đến 12 ngày sau thì hàm lượng IAA tạo ra trong môi trường có bổ sung L-tryptophan cao gấp 6 lần so với nuôi cấy không có L-tryptophan [24], [26], [71]

Cytokinins được tạo ra bởi vi khuẩn bằng ít nhất hai con đường Con đường đầu

tiên là tổng hợp de novo, là dạng chuyển đổi trực tiếp đồng phân (isopentenylation)

của AMP (adenine monophosphate) bởi enzyme dimethylallyl transferase (DMAT),

được ghi nhận đầu tiên ở vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Con đường thứ hai của

quá trình tạo cytokinins bởi vi khuẩn là quá trình chuyển đổi của tRNA tương tự như

cơ chế hoạt động ở thực vật bậc cao Sự tạo cytokinins bởi vi khuẩn PPFMs đã được Koenig và ctv (2001), kiểm tra Tất cả các chủng kiểm tra điều tạo được cytokinins ở mức độ đủ đáp ứng và phát hiện được Lượng cytokinins quan sát được là 15,2 và

19,6ng/mg Bốn chủng Methylobacterium khác nhau hiện diện trên bề mặt lá và một chủng của Methylobacterium extorquens đều có khả năng tạo cytokinin trans-zeatin

với mức độ thấp và tiết vào trong môi trường nuôi cấy [32], [33], [35], [39], [40], [57], [58]

Trong những nghiên cứu về những hợp chất để tạo nên hương dâu tây (Fragaria

ananassa) cho thấy rằng vi khuẩn Methylobacterium cần thiết cho quá trình tổng hợp

tiền chất của hydroxy-2Hfuran- 3-one (DMHF) và methoxy-2H-furan-3-one (mesifuran) Khi callus (mô sẹo) dâu tây đồng nuôi cấy với

2,5-dimethyl-4-vi khuẩn PPFM thì hàm lượng DMHF là 5g/860,5g mô tươi và 11g/357,97g ở mesifuran, không gram ở mẫu đối chứng Sự gia tăng hàm lượng của DMHF và mesifuran là do vi khuẩn PPFM có khả năng oxy hóa 1,2-propanediol thành lactaldehyde Vì lactaldehyde được tạo ra từ vi khuẩn được sử dụng bởi những tế bào dâu tây trong quá trình sinh tổng hợp hai furanones trên [100]

2.3.4 Các ứng dụng khác của vi khuẩn Methylobacterium

Ngoài khả năng tổng hợp các chất góp phần gia tăng khả năng tăng trưởng

của thực vật Methylobacterium sp còn có khả năng tổng hợp nhựa sinh học PHB

(Poly- -Hydroxybutyrate) Khả năng này hiện diện ở nhiều vi sinh vật prokaryote

bao gồm cả vi khuẩn Methylotrophic có khả năng tích lũy PHB nội bào như một dạng

của nguồn cung cấp carbon và năng lượng Hàm lượng PHB tạo ra phụ thuộc vào môi

trường nuôi cấy và con đường biến dưỡng của vi sinh vật Vi khuẩn Methylotrophic

sử dụng chu trình serine để khử formaldehyde có thể tích lũy PHB khoảng 80% trọng

lượng khô Trong khi đó, vi khuẩn Methylotrophic sử dụng chu trình

Calvin-Benson-Bassham để khử C1 có thể tích lũy PHB khoảng 20% trọng lượng khô Và ở vi khuẩn sử dụng methanol bắt buộc sử dụng chu trình ribulose monophosphate để khử hợp chất C1 thì không có sự tích lũy PHB được phát hiện Trong một nghiên cứu khác

của Ackermann và ctv (1994), lại cho thấy rằng, vi khuẩn Methylobacterium

rhodesianum có thể tổng hợp PHB trong điều kiện giới hạn dinh dưỡng Trong

nghiên cứu này, ông chứng minh được rằng, khi vi khuẩn sinh trưởng trong điều kiện

giới hạn nitrogen thì có thể chúng tích lũy PHB lớn 2% trọng lượng thô của sinh khối sau 20 giờ nuôi cấy, còn trong điều kiện bị giới hạn của phosphate thì sự tích lũy PHB ít hơn và trong điều kiện giới hạn của nguồn cacbon thì PHB được tích lũy nhỏ hơn 2% trọng lượng sinh khối khô của vi khuẩn sau 20 giờ nuôi cấy [10], [65]

Ngoài ra, vi khuẩn Methylobacterium có khả năng sử dụng các chất hữu cơ

khác nhau gồm các chất gây ô nhiễm môi trường và tổng hợp các hợp chất có lợi cho chính vi khuẩn cũng như có lợi cho đời sống của con người Trong nghiên cứu của Van Aken và ctv (2004), chứng minh rằng vi khuẩn PPFM cộng sinh được phân lập

từ môi trường nuôi cấy mô cây dương Populus deltoides nigra DN34 Chủng vi khuẩn thuần thuộc Methylobacterium sp BJ001 có thể chuyển đổi hoàn toàn chất

25mg/l TNT, 20mg/l RDX, 2,5mg/l HMX sau 55 ngày nuôi cấy để tạo ra CO2 Trong khi đó, trong nghiên cứu của Fournier và ctv (2005), cho rằng chủng vi khuẩn

Methylobacterium sp JS178 có khả năng phân hủy (sử dụng Nitramine

4-Nitro-2,4-Diazabutanal – NDAB – là sản phẩm phân cắt của hợp chất RDX – trinitro-1,3,5-triazine – là hợp chất độc giàu năng lượng) tạo ra khoáng nitramine

hexahydro-1,3,5-trong điều kiện hiếu khí Methylotrophic đóng vai trò quan trọng hexahydro-1,3,5-trong hệ sinh thái

do chúng có khả năng sử dụng methan-một loại khí gây hiệu ứng nhà kín Ngoài ra,

vi khuẩn Methylobacterium cũng có khả năng phân hủy nhiều hợp chất hữu cơ gây ô

nhiễm khác bao gồm methyl chloride, methyl bromide, methyl iodide,

dichloromethane, methyl tert-butyl ether, methylated amines, những hợp chất có chứa

ethylated sulfur, và cyanate và thiocyanate [28], [36], [88], [89]

Hình 2.4: Sự nhiễm của vi khuẩn Methylobacterium sp trên cây dương Poplar (P deltoides _ nigra DN34) trong nuôi cấy mô [88]

Trong lĩnh vực thực phẩm vi khuẩn Methylobacterium cũng có thể góp phần

quan trọng và đầy tiềm năng bởi vì chúng vừa có khả năng sử dụng các nguồn

nguyên liệu rẻ tiền vừa có thể tạo ra các sản phẩm có gia trị như protein đơn bào, carotene, vitamine B12 và nhiều sản phẩm có giá trị khác [27], [90] Từ những cơ sở này có thể kết luận rằng vi khuẩn PPFM có nhiều tiềm năng ứng dụng không chỉ trong nông nghiệp mà còn trong lĩnh vực môi trường, thực phẩm,

-Tuy nhiên, không phải tất cả các loài Methylobacterium đều có lợi mà một loài

Methylobacterium sp mới phát hiện có khả năng gây bệnh cho con người như Methylobacterium mesophilicum sống ở thực vật có khả năng gây dị ứng, sốt Methylobacterium podarium tồn tại trong miệng có thể gây bệnh hôi miệng và cũng

có thể gây bệnh hoa chân (foot flora) [11], [12], [83], [101]

2.4 Phương pháp định danh vi sinh vật

2.4.1 Định danh vi sinh vật bằng phương pháp truyền thống

Là phương pháp phân loại dựa vào đặc điểm về hình thái, đặc diểm sinh lý, đặc điểm biến dưỡng, và đặc điểm sinh thái Phương pháp này được Ferdinad Cohn thực hiện lần đầu tiên năm 1987 Mặc dù đây là phương pháp không chính xác nhưng phương pháp này có vai trò quan trọng trong bước đầu nghiên cứu định danh vi sinh vật

- Đặc điểm hình thái bao gồm: hình dạng, kích thước tế bào, hình dạng màu sắc khuẩn lạc, khả năng di động, …

- Đặc điểm sinh lý và biến dưỡng: là khả năng sử dụng các nguồn cacbon, nitrogen, cách thức biến dưỡng năng lượng, mối quan hệ với oxy, pH, nhiệt độ thích hợp,…

Để định danh vi sinh vật theo phương pháp truyền thống thường phải dựa vào các khóa phân loại (bảng sinh hoá) Khóa phân loại prokaryote đầy đủ nhất, phổ biến nhất, được sử dụng là khóa phân loại Bergey`s [4], [41], [77], [97]

Bảng 2.3: Đặc điểm sử dụng các nguồn carbon của các loài thuộc chi

Methylobacterium [41]

Chất 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Methylamine + + + + + + + – – + – + + + - Trimethylanine – – – + – – – – – + – – – – +

Citrate – – – – – – + + + – + + + + + + + + – + + Glutamate – – + + – – + + + + + + + + + + + + – + + Glucose + – – – – – + + + – + + – – – + + – – – + Arabinose – – – – – – + + + – + + – – – – – – – + + Fructose + + – + + + + – – + – + – + + + + – + – +

+:có sử dụng; -: không sử dụng; ND: không xác định ; v: biến đổi

2.4.2 Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử (dựa vào vật liệu di truyền)

2.4.2.1 Sơ lƣợc về kỹ thuật sinh học phân tử

Kỹ thuật sinh học phân tử là thuật ngữ dùng để chỉ một nhóm gồm nhiều kỹ thuật mà có chung đặc điểm là sử dụng các vật liệu nghiên cứu có tính chất phân tử (vật liệu di truyền như: DNA, RNA, protein,

Là phương pháp hiện đại, đạt kết quả nhanh chóng, và hiệu quả cao Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật và trang thiết bị hiện đại

+ Sử dụng mẫu dò (probes)

Mẫu dò là một trình tự acid nucleic được sử dụng để xác định sự hiện diện của một trình tự nucleotid đặc trưng của một chủng vi sinh vật đã biết trước Mẫu dò là

một đoạn mạch đơn của acid nucleic thường là DNA được gắn với một nhân tố nhận biết là phóng xạ hay chất phát huỳnh quang

+ Khuếch đại trình tự đặc trưng bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

[4], [67], [95]

Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao của các đoạn DNA mà không cần phải qua tạo dòng Phương pháp này được K Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988 Đây là phương pháp được thực hiện hoàn toàn trong ống nghiệm và trong một thời gian ngắn có thể thu rất nhiều bản sao DNA

Nguyên tắc của phương pháp PCR

Phương pháp này được thực hiện trong ống nghiệm với sự hiện diện của enzyme DNA-polymerase, theo nguyên tắc bán bảo tồn trong nhân bản DNA Sự khuếch đại được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại Phản ứng xảy ra nhờ enzyme DNA-polymerase DNA sẽ tách thành hai mạch và từ 2 mạch DNA thành 4 mạch DNA, 4 mạch DNA thành 8 mạch DNA và cứ như thế nhân lên đến vô cùng

+ Giải trình tự (sequencing) [5]

Là kỹ thuật xác định tất cả các thành phần nucleotide tạo nên phân tử acid nucleic chuyên biệt nào đó Phương pháp giải trình tự đầu tiên do Maxam và Gilbert (1977), Sanger và ctv (1977), công bố

Một số phương pháp giải trình tự đang được sử dụng:

- Phương pháp Maxam và Gilbert

Phương pháp này dựa trên sự phân cắt hóa học tại vi trí đặc biệt của base tạo ra một phân tử DNA có đầu được đánh dấu và hình thành nên một loạt các đoạn DNA có đầu được đánh dấu bằng các loại base khác nhau

- Phương pháp Sanger

Là phương pháp dùng một DNA polymerase để tổng hợp một bản sao có tính chất bổ sung từ một dây nền của DNA

- Phương pháp giải mã bằng hệ thống tự động (phương pháp PCR trực tiếp)

Nguyên tắc dựa vào việc phát hiện tính hiệu huỳnh quang từ những dNTP được đánh dấu

2.4.2.2 Ứng dụng PCR và giải trình tự để định danh vi sinh vật

Ribosome 70S của prokaryote đóng vai trò chính trong tổng hợp protein, được cấu tạo từ protein và 3 loại phân tử rRNA (5S, 16S, 23S) Chúng đảm nhận chức năng

duy nhất ở tất cả các sinh vật, có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn có những vùng trình tự ribonucleotide khác biệt giữa các loài và trình tự đặc trưng cho từng nhóm sinh vật Do vậy, rRNA được xem là thước đo tiến hóa ở sinh vật và cũng là công cụ hữu ích cho phân loại và định danh vi sinh vật Kỹ thuật này không chỉ dựa vào rRNA mà còn dựa vào rDNA (trình tự mã hóa cho rRNA), vì DNA là vật liệu di truyền dễ thu nhận và có tính bền cao hơn RNA Trong các loại rRNA thì rRNA 16S thích hợp nhất cho mục tiêu phân loại vì kích thước nó vừa phải (khoảng 1500 ribonucleotide), một vài vùng trong rRNA 16S của tất cả các prokaryote có tính bảo tồn cao, trong khi đó một số vùng khác lại có một số khác biệt

Sau khi giải mã thì trình tự của đoạn rRNA đã biết được so sánh với các trình tự rRNA của tất cả các sinh vật trên ngân hàng gen nhờ phần mềm BLAST, hay sử dụng kết hợp các phần mềm để so sánh mức độ tương đồng của các trình tự Từ những cơ sở dữ liệu này, ta có thể vẽ được cây phát sinh loài thể hiện mối quan hệ tiến hóa của các loài và vi trí của loài vi sinh vật cần định danh Tuy nhiên, khi sử dụng trình tự rDNA 16S để định danh cần chú ý:

- Kích thước rDNA phải đủ lớn (> 1300nu)

- Sự khác biệt giữa hai trình tự rDNA 16S của hai chủng vi sinh vật nhỏ hơn 0,5%

Sau khi sử dụng các kiểm tra sinh lý, sinh hóa để định danh các loài thuộc chi

Methylobacterium thì việc sử dụng trình tự 16S rRNA để dịnh danh vi khuẩn Methylobacterium là rất cần thiết vì các kiểm tra sinh lý, sinh hóa không thể đem lại

kết quả chính xác Phương pháp PCR khuếch đại trình tự 16S rRNA để phát hiện các

loài Methylobacterium đã được sử dụng rộng rãi bởi tính chính xác của nó Ngoài ra,

trên ngân hàng gen của NCBI đã lưu trữ tất cả các trình tự gần như nguyên vẹn rDNA 16S (mã hóa cho 16S rRNA) Cho nên chỉ cần so sánh trình tự của chủng vi khuẩn cần định danh với các trình tự có sẵn trên ngân hàng thì có thể định danh được loài vi sinh vật mục tiêu [29], [30], [31], [68]

Phần III: Vật liệu và phương pháp

3.1 Vật liệu

3.1.1 Mẫu thí nghiệm

 Mẫu lá, đất, nước được lấy ngẫu nhiên trên ruộng lúa ở Tây Ninh

 Thời gian tiến hành thí nghiệm từ ngày 06/ 02/ 2006 đến ngày 18/ 06/ 2006

 Tất cả các thí nghiệm được thực hiện tại Trại thực nghiệm Sinh học và Phòng Công nghệ Sinh học Phân tử, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh

 Eppendorf, Pippette,…

Và một số dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Vi Sinh

3.1.3 Hóa chất

3.1.3.1 Môi trường phân lập và làm thuần vi khuẩn Methylobacterium sp.[34]

Thành phần môi trường Methanol Mineral Salts (MMS):

trình tăng sinh 3.1.3.2 Môi trường giữ giống vi khuẩn Methylobacterium sp

Thành phần môi trường Glycerol-Peptone Agar:[34]

3.1.3.3 Môi trường khảo sát khả năng sử dụng hợp chất cung cấp nguồn cacbon

của vi khuẩn Methylobacterium sp [4], [6], [34]

Môi trường khảo sát là môi trường MMS Trong đó, methanol được thay thế bằng 1% các chất cung cấp cung cấp nguồn cacbon

3.1.3.4 Môi trường nhân sinh khối vi khuẩn [4], [6]

Môi trường khoáng MS bổ sung 30g/l sucrose, 1mg/l glycine, 1mg/l B1, 100mg/l meso inositol, 2g/l cao thịt, 2g/l casein hydrolyase ký hiệu: CMS

Môi trường cao thịt – peptone (CP) gồm 0,3% cao thịt, 1% peptone, 0,5% NaCl, pH = 6,5

3.1.3.5 Bộ thử nghiệm sinh hóa định danh trực khuẩn gram âm IDS14GR

3.2 Phương pháp tiến hành thí nghiệm

Giờ lấy mẫu : sáng từ 7 – 9 giờ

3.2.2 Tăng sinh vi khuẩn

Đối với mẫu lá, dùng hai phương pháp là: Leaf print trực tiếp trên đĩa môi trường, hoặc qua quá trình tăng sinh trên môi trường chọn lọc