Mục tiêu này được thực hiện bằng các thí nghiệm sau:
3.3.1. Tính hệ số tƣơng đồng di truyền
Hệ số tương đồng di truyền Jaccard (Sj) cho phép xác định mức độ giống nhau của hai loài vi khuẩn. Vì vậy, để xác định mối quan hệ họ hàng của các chủng
LM2, TS7, TN10 và TD15 với các loài Methylobacterium sp. đã được công bố thì việc tính toán hệ số di truyền Jaccard là cần thiết.
Hệ số di truyền Jaccard được tình theo công thức sau:
Sj = a/(a +b). Trong đó:
a: tổng số các đặc điểm tương đồng của hai loài sinh vật b: tổng số các đặc điểm khác biệt giữa hai loài sinh vật.
Hệ số Sj thay đổi trong khoảng từ 0 – 1 (0% - 100%). Nếu hai loài sinh vật có hệ số Sj lớn hơn 0,8 (80%) thì chúng có khả năng cùng một loài.
3.3.2. Ly trích DNA vi khuẩn
Quy trình ly trích DNA bộ gen của các chủng Methylobacterium sp. theo quy trình của Rogers S.O. và ctv (1994), quy trình CTAB [78]. Bao gồm các bước sau:
Ly tâm thu sinh khối.
Bổ sung 600 l CATB nóng, vortex, ủ 650C trong 60 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút thu dịch nổi. Biến tính bằng 500 l dung dịch phenol – chloroform (1:1). Ly tâm 13000 vòng/phút, 5 phút thu dịch nổi.
Biến tính lần hai bằng 500 l dung dịch phenol – chloroform, lắc nhẹ. Tủa DNA bằng 1ml cồn tuyệt đối lạnh, ly tâm 13000 vòng/phút ở 40
C thu tủa.
Ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 phút ở 40C để thu tủa DNA. Rửa tủa bằng 250 l cồn 700.
Phơi mẫu cho khô cồn.
Hòa tan tủa trong 20 l dung dịch TE 0,1X.
Bổ sung 20 l dung dịch RNase (1mg/ml), ủ 370 trong 60 phút. Giữ ở 40
C
Sản phẩm DNA bộ gen đã ly trích được đánh giá tính nguyên vẹn khi điện di trên gel agarose 1% và độ tinh sạch được đánh giá thông qua tỷ số OD260nm/OD280nm.
Sản phẩm DNA bộ gen ly trích bao gồm bốn chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. đã phân nhóm và DNA chủng đối chứng là vi khuẩn E.coli.
3.3.3. Tiến hành phản ứng PCR.
3.3.3.1. Thành phần cho một phản ứng PCR.
Buffer 10X ... 2,5 l Mg++ 25mM ... 1,5 l dNTP 2mM ... 2,5 l Mồi xuôi (FPGS6 hay 2F) 10pmol/ l ... 1 l Mồi ngược (FPGS1509 hay 2R) 10pmol/ l 1 l DNA khuôn ... 0,5 l Taq polymerase 1U/ l ... 0,5 l
Nước ... vừa đủ 25 l 3.3.3.2. Các primer sử dụng [9], [68] FPGS1509: 5` ... AAGGAGGGGATCCAGCCGCA...3`. FPGS6: 5`... GGAGAGTTAGATCTTGGCTCAG ...3` 2F: 5`... GATCGGCCCGCGTCTGATTAG ...3`. 2R: 5`... CCGTCATTATCGTCCCGGACA ...3`.
Hình 3.1: Vị trí bắt cặp của các mồi trên vùng 16S rDNA.
Để định danh các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. đã phân lập được chúng tôi tiến hành các phản ứng như sau:
- Định tính vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium bằng phản ứng PCR với cặp mồi 2R và 2F với sản phẩm tạo ra là đoạn DNA có kích thước khoảng 234bp. Với chu trình nhiệt như sau:
Hình 3.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng với mồi 2F với 2R.
- Khuếch đại trình tự rDNA 16S nguyên vẹn của vi khuẩn Methylobacterium
phân lập được bằng cặp mồi FPGS6 và FPGS1509 và phối hợp sử dụng chung cặp mồi 2R và 2F. Với kích thước đoạn DNA tạo ra là khoảng 500base và 1200base. Với chu trình nhiệt như sau:
Hình 3.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng với cặp mồi FPGS6 với 2R và FPGS1509 với 2F