Ngoài khả năng tổng hợp các chất góp phần gia tăng khả năng tăng trưởng của thực vật Methylobacterium sp. còn có khả năng tổng hợp nhựa sinh học PHB (Poly- -Hydroxybutyrate). Khả năng này hiện diện ở nhiều vi sinh vật prokaryote bao gồm cả vi khuẩn Methylotrophic có khả năng tích lũy PHB nội bào như một dạng của nguồn cung cấp carbon và năng lượng. Hàm lượng PHB tạo ra phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy và con đường biến dưỡng của vi sinh vật. Vi khuẩn Methylotrophic
sử dụng chu trình serine để khử formaldehyde có thể tích lũy PHB khoảng 80% trọng lượng khô. Trong khi đó, vi khuẩn Methylotrophic sử dụng chu trình Calvin-Benson- Bassham để khử C1 có thể tích lũy PHB khoảng 20% trọng lượng khô. Và ở vi khuẩn sử dụng methanol bắt buộc sử dụng chu trình ribulose monophosphate để khử hợp chất C1 thì không có sự tích lũy PHB được phát hiện. Trong một nghiên cứu khác của Ackermann và ctv (1994), lại cho thấy rằng, vi khuẩn Methylobacterium rhodesianum có thể tổng hợp PHB trong điều kiện giới hạn dinh dưỡng. Trong nghiên cứu này, ông chứng minh được rằng, khi vi khuẩn sinh trưởng trong điều kiện
giới hạn nitrogen thì có thể chúng tích lũy PHB lớn 2% trọng lượng thô của sinh khối sau 20 giờ nuôi cấy, còn trong điều kiện bị giới hạn của phosphate thì sự tích lũy PHB ít hơn và trong điều kiện giới hạn của nguồn cacbon thì PHB được tích lũy nhỏ hơn 2% trọng lượng sinh khối khô của vi khuẩn sau 20 giờ nuôi cấy [10], [65].
Ngoài ra, vi khuẩn Methylobacterium có khả năng sử dụng các chất hữu cơ khác nhau gồm các chất gây ô nhiễm môi trường và tổng hợp các hợp chất có lợi cho chính vi khuẩn cũng như có lợi cho đời sống của con người. Trong nghiên cứu của Van Aken và ctv (2004), chứng minh rằng vi khuẩn PPFM cộng sinh được phân lập từ môi trường nuôi cấy mô cây dương Populus deltoides nigra DN34. Chủng vi khuẩn thuần thuộc Methylobacterium sp. BJ001 có thể chuyển đổi hoàn toàn chất 25mg/l TNT, 20mg/l RDX, 2,5mg/l HMX sau 55 ngày nuôi cấy để tạo ra CO2. Trong khi đó, trong nghiên cứu của Fournier và ctv (2005), cho rằng chủng vi khuẩn
Methylobacterium sp. JS178 có khả năng phân hủy (sử dụng Nitramine 4-Nitro-2,4- Diazabutanal – NDAB – là sản phẩm phân cắt của hợp chất RDX – hexahydro-1,3,5- trinitro-1,3,5-triazine – là hợp chất độc giàu năng lượng) tạo ra khoáng nitramine trong điều kiện hiếu khí. Methylotrophic đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái do chúng có khả năng sử dụng methan-một loại khí gây hiệu ứng nhà kín. Ngoài ra, vi khuẩn Methylobacterium cũng có khả năng phân hủy nhiều hợp chất hữu cơ gây ô nhiễm khác bao gồm methyl chloride, methyl bromide, methyl iodide, dichloromethane, methyl tert-butyl ether, methylated amines, những hợp chất có chứa ethylated sulfur, và cyanate và thiocyanate [28], [36], [88], [89].
Hình 2.4: Sự nhiễm của vi khuẩn Methylobacterium sp. trên cây dương Poplar (P. deltoides _ nigra DN34) trong nuôi cấy mô [88].
Trong lĩnh vực thực phẩm vi khuẩn Methylobacterium cũng có thể góp phần quan trọng và đầy tiềm năng bởi vì chúng vừa có khả năng sử dụng các nguồn
nguyên liệu rẻ tiền vừa có thể tạo ra các sản phẩm có gia trị như protein đơn bào, - carotene, vitamine B12 và nhiều sản phẩm có giá trị khác [27], [90]. Từ những cơ sở này có thể kết luận rằng vi khuẩn PPFM có nhiều tiềm năng ứng dụng không chỉ trong nông nghiệp mà còn trong lĩnh vực môi trường, thực phẩm,
Tuy nhiên, không phải tất cả các loài Methylobacterium đều có lợi mà một loài
Methylobacterium sp. mới phát hiện có khả năng gây bệnh cho con người như
Methylobacterium mesophilicum sống ở thực vật có khả năng gây dị ứng, sốt.
Methylobacterium podarium tồn tại trong miệng có thể gây bệnh hôi miệng và cũng có thể gây bệnh hoa chân (foot flora) [11], [12], [83], [101].
2.4. Phƣơng pháp định danh vi sinh vật
2.4.1. Định danh vi sinh vật bằng phƣơng pháp truyền thống.
Là phương pháp phân loại dựa vào đặc điểm về hình thái, đặc diểm sinh lý, đặc điểm biến dưỡng, và đặc điểm sinh thái. Phương pháp này được Ferdinad Cohn thực hiện lần đầu tiên năm 1987. Mặc dù đây là phương pháp không chính xác nhưng phương pháp này có vai trò quan trọng trong bước đầu nghiên cứu định danh vi sinh vật.
- Đặc điểm hình thái bao gồm: hình dạng, kích thước tế bào, hình dạng màu sắc khuẩn lạc, khả năng di động, …
- Đặc điểm sinh lý và biến dưỡng: là khả năng sử dụng các nguồn cacbon, nitrogen, cách thức biến dưỡng năng lượng, mối quan hệ với oxy, pH, nhiệt độ thích hợp,…
Để định danh vi sinh vật theo phương pháp truyền thống thường phải dựa vào các khóa phân loại (bảng sinh hoá). Khóa phân loại prokaryote đầy đủ nhất, phổ biến nhất, được sử dụng là khóa phân loại Bergey`s [4], [41], [77], [97].
Bảng 2.3: Đặc điểm sử dụng các nguồn carbon của các loài thuộc chi Methylobacterium [41] Chất 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Methylamine + + + + + + + – – + – + + + - Trimethylanine – – – + – – – – – + – – – – + Acetate + + + + + + + + – + + + + + + Citrate – – – – – – + + + – + + + + + + + + – + + Glutamate – – + + – – + + + + + + + + + + + + – + + Glucose + – – – – – + + + – + + – – – + + – – – + Arabinose – – – – – – + + + – + + – – – – – – – + + Fructose + + – + + + + – – + – + – + + + + – + – + Betaine + – + – + – + + – + – nd + + + Tartrate v – – V – – – v Serbacate – – – – – + v + + Ethanol + + + + + V + v + nutrient agar v + + + + + – + + Methane – v – – – – – – chú thích:
1: M.suomiense; 2: M. lusitanum; 3: M. extorquens; 4: M. organophilum; 5: M. rhodesianum; 6: M. zatmanii; 7: M. rhodinum; 8: M. radiotolerans; 9: M. mesophilicum; 10: M. aminovorans; 11: M. fujisawaense; 12:M. thiosyanatum; 13: M. chloromethanicum; 14: M. dichloromethanicum;15: M. hispanium; 16: M. aquaticum; 17: M. variable; 18: M. isbiliense; 19: M. populi;20: M. nodulans. 21 :1019.
+:có sử dụng; -: không sử dụng; ND: không xác định ; v: biến đổi.
2.4.2. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử (dựa vào vật liệu di truyền) truyền)
2.4.2.1. Sơ lƣợc về kỹ thuật sinh học phân tử.
Kỹ thuật sinh học phân tử là thuật ngữ dùng để chỉ một nhóm gồm nhiều kỹ thuật mà có chung đặc điểm là sử dụng các vật liệu nghiên cứu có tính chất phân tử (vật liệu di truyền như: DNA, RNA, protein,....
Là phương pháp hiện đại, đạt kết quả nhanh chóng, và hiệu quả cao. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật và trang thiết bị hiện đại.
+ Sử dụng mẫu dò (probes)
Mẫu dò là một trình tự acid nucleic được sử dụng để xác định sự hiện diện của một trình tự nucleotid đặc trưng của một chủng vi sinh vật đã biết trước. Mẫu dò là
một đoạn mạch đơn của acid nucleic thường là DNA được gắn với một nhân tố nhận biết là phóng xạ hay chất phát huỳnh quang.
+ Khuếch đại trình tự đặc trưng bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
[4], [67], [95].
Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao của các đoạn DNA mà không cần phải qua tạo dòng. Phương pháp này được K. Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Đây là phương pháp được thực hiện hoàn toàn trong ống nghiệm và trong một thời gian ngắn có thể thu rất nhiều bản sao DNA.
Nguyên tắc của phương pháp PCR
Phương pháp này được thực hiện trong ống nghiệm với sự hiện diện của enzyme DNA-polymerase, theo nguyên tắc bán bảo tồn trong nhân bản DNA. Sự khuếch đại được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại. Phản ứng xảy ra nhờ enzyme DNA-polymerase. DNA sẽ tách thành hai mạch và từ 2 mạch DNA thành 4 mạch DNA, 4 mạch DNA thành 8 mạch DNA và cứ như thế nhân lên đến vô cùng.
+ Giải trình tự (sequencing) [5].
Là kỹ thuật xác định tất cả các thành phần nucleotide tạo nên phân tử acid nucleic chuyên biệt nào đó. Phương pháp giải trình tự đầu tiên do Maxam và Gilbert (1977), Sanger và ctv (1977), công bố.
Một số phương pháp giải trình tự đang được sử dụng:
- Phương pháp Maxam và Gilbert
Phương pháp này dựa trên sự phân cắt hóa học tại vi trí đặc biệt của base tạo ra một phân tử DNA có đầu được đánh dấu và hình thành nên một loạt các đoạn DNA có đầu được đánh dấu bằng các loại base khác nhau.
- Phương pháp Sanger
Là phương pháp dùng một DNA polymerase để tổng hợp một bản sao có tính chất bổ sung từ một dây nền của DNA
- Phương pháp giải mã bằng hệ thống tự động (phương pháp PCR trực tiếp)
Nguyên tắc dựa vào việc phát hiện tính hiệu huỳnh quang từ những dNTP được đánh dấu.
2.4.2.2. Ứng dụng PCR và giải trình tự để định danh vi sinh vật.
Ribosome 70S của prokaryote đóng vai trò chính trong tổng hợp protein, được cấu tạo từ protein và 3 loại phân tử rRNA (5S, 16S, 23S). Chúng đảm nhận chức năng
duy nhất ở tất cả các sinh vật, có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn có những vùng trình tự ribonucleotide khác biệt giữa các loài và trình tự đặc trưng cho từng nhóm sinh vật. Do vậy, rRNA được xem là thước đo tiến hóa ở sinh vật và cũng là công cụ hữu ích cho phân loại và định danh vi sinh vật. Kỹ thuật này không chỉ dựa vào rRNA mà còn dựa vào rDNA (trình tự mã hóa cho rRNA), vì DNA là vật liệu di truyền dễ thu nhận và có tính bền cao hơn RNA. Trong các loại rRNA thì rRNA 16S thích hợp nhất cho mục tiêu phân loại vì kích thước nó vừa phải (khoảng 1500 ribonucleotide), một vài vùng trong rRNA 16S của tất cả các prokaryote có tính bảo tồn cao, trong khi đó một số vùng khác lại có một số khác biệt.
Sau khi giải mã thì trình tự của đoạn rRNA đã biết được so sánh với các trình tự rRNA của tất cả các sinh vật trên ngân hàng gen nhờ phần mềm BLAST, hay sử dụng kết hợp các phần mềm để so sánh mức độ tương đồng của các trình tự. Từ những cơ sở dữ liệu này, ta có thể vẽ được cây phát sinh loài thể hiện mối quan hệ tiến hóa của các loài và vi trí của loài vi sinh vật cần định danh. Tuy nhiên, khi sử dụng trình tự rDNA 16S để định danh cần chú ý:
- Kích thước rDNA phải đủ lớn (> 1300nu)
- Sự khác biệt giữa hai trình tự rDNA 16S của hai chủng vi sinh vật nhỏ hơn 0,5%.
Sau khi sử dụng các kiểm tra sinh lý, sinh hóa để định danh các loài thuộc chi
Methylobacterium thì việc sử dụng trình tự 16S rRNA để dịnh danh vi khuẩn
Methylobacterium là rất cần thiết vì các kiểm tra sinh lý, sinh hóa không thể đem lại kết quả chính xác. Phương pháp PCR khuếch đại trình tự 16S rRNA để phát hiện các loài Methylobacterium đã được sử dụng rộng rãi bởi tính chính xác của nó. Ngoài ra, trên ngân hàng gen của NCBI đã lưu trữ tất cả các trình tự gần như nguyên vẹn rDNA 16S (mã hóa cho 16S rRNA). Cho nên chỉ cần so sánh trình tự của chủng vi khuẩn cần định danh với các trình tự có sẵn trên ngân hàng thì có thể định danh được loài vi sinh vật mục tiêu [29], [30], [31], [68].
Phần III: Vật liệu và phƣơng pháp
3.1. Vật liệu
3.1.1. Mẫu thí nghiệm
Mẫu lá, đất, nước được lấy ngẫu nhiên trên ruộng lúa ở Tây Ninh
Thời gian tiến hành thí nghiệm từ ngày 06/ 02/ 2006 đến ngày 18/ 06/ 2006.
Tất cả các thí nghiệm được thực hiện tại Trại thực nghiệm Sinh học và Phòng Công nghệ Sinh học Phân tử, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh.
3.1.2. Thiết bị, dụng cụ
Máy hấp vô trùng autolave Máy lắc tròn 100 vòng/phút
Máy ly tâm Miko 22R (Hettich Zentrifugen) Máy điều nhiệt theo chu kỳ Techine
Bộ điện di ngang Mupid-EX (Advance) Máy đo quang phổ RNA/DNA Gene Quantpro Kính hiển vi (Olympus)
Eppendorf, Pippette,…
Và một số dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Vi Sinh.
3.1.3. Hóa chất
3.1.3.1. Môi trƣờng phân lập và làm thuần vi khuẩn Methylobacterium sp.[34].
Thành phần môi trường Methanol Mineral Salts (MMS):
- K2HPO4 1,2g - KH2PO4 0,62g - CaCl2.6H2O 0,05g - MgSO4.7H2O 0,2g - NaCl 0,1g - FeCl3.6H2O 1mg - (NH4)2SO4 0,5 g - CuSO4.5H2O 5 g - MnSO4.5H2O 10 g - Na2MoO4.2H2O 10 g
- H3BO3 10 g
- ZnSO4.7H2O 70 g
- CoCl2.6H2O 5 g
- Nước cất vừa đủ 1000ml
- pH 7
Môi trường MMS được thanh trùng bằng cách hấp ở nhiệt độ 1210C trong 20 phút. Sau đó, để nguội và bổ sung methanol vào với nồng độ 0,1 – 0,2%. Đối với môi trường rắn thì bổ sung agar 20g/l trước khi hấp vô trùng. Không cần bổ sung vitamine hay các nhân tố tăng trưởng bởi vì các chủng PPFM hầu như không cần thiết trong quá trình tăng sinh. 3.1.3.2. Môi trƣờng giữ giống vi khuẩn Methylobacterium sp.
Thành phần môi trường Glycerol-Peptone Agar:[34].
- Agar 15g
- Glycerol 10g
- Peptone 10g
- Nước vất vừa đủ 1000ml
3.1.3.3. Môi trƣờng khảo sát khả năng sử dụng hợp chất cung cấp nguồn cacbon của vi khuẩn Methylobacterium sp. [4], [6], [34]
Môi trường khảo sát là môi trường MMS. Trong đó, methanol được thay thế bằng 1% các chất cung cấp cung cấp nguồn cacbon.
3.1.3.4. Môi trƣờng nhân sinh khối vi khuẩn [4], [6].
Môi trường khoáng MS bổ sung 30g/l sucrose, 1mg/l glycine, 1mg/l B1, 100mg/l meso inositol, 2g/l cao thịt, 2g/l casein hydrolyase ký hiệu: CMS.
Môi trường cao thịt – peptone (CP) gồm 0,3% cao thịt, 1% peptone, 0,5% NaCl, pH = 6,5.
3.2. Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm
Lấy mẫu Tăng sinh vi khuẩn
Phân lập Làm thuần Xác định hình thái Kiểm tra sinh lý, sinh hóa
Chiết tách DNA Thực hiện PCR Giải trình tự Xử lý kết quả Kết luận 3.2.1. Lấy mẫu
Mẫu được lấy ngẫu nhiên trên ruộng lúa ở ba xã khác nhau:xã Truông Mít (huyện Dương Minh Châu), xã Gia Lộc (huyện Trảng Bàng), xã Bàu Đồn (huyện Gò Dầu) tỉnh Tây Ninh bao gồm các mẫu lá, nước, đất.
Giờ lấy mẫu : sáng từ 7 – 9 giờ.
3.2.2. Tăng sinh vi khuẩn
Đối với mẫu lá, dùng hai phương pháp là: Leaf print trực tiếp trên đĩa môi trường, hoặc qua quá trình tăng sinh trên môi trường chọn lọc.
Sau khoảng 2 – 3 ngày lấy mẫu dùng pippet hút 100 l môi trường tăng sinh cho vào môi trường rắn để tiến hành phân lập vi khuẩn
3.2.3. Phân lập vi khuẩn
- Đối với mẫu đất chúng tôi tiến hành pha loãng ở các nồng độ khác nhau từ 10–1, 10–2,… 10– 6. Sau đó từ mỗi nồng độ hút 100 l cho vào môi trường rắn.
- Đối với mẫu nước chúng tôi tiến hành phân lập trực tiếp không qua quá trình tăng sinh, hút cho vào môi trường rắn mỗi đĩa là 40 l
- Đối với mẫu lá sau khi tăng sinh dùng pipet vô trùng hút 100 l cấy vào môi trường rắn
- Sau khi cấy chuyển vào môi trường rắn đem tất cả các đĩa môi trường đã cấy vi khuẩn nuôi ở nhiệt độ 300C. Sau 2 – 4 ngày xem kết quả và chọn khuẩn lạc hồng đặt trưng để làm thuần.
3.2.4. Làm thuần.
Khuẩn lạc thuần đóng vai trò quan trọng quyết định đến kết quả và độ chính xác trong thử nghiệm sinh hóa cũng như các thử nghiệm khác. Do đó, để có khuẩn lạc thuần phục vụ cho tiến trình thử nghiệm sinh hóa chúng tôi tiến chọn lọc khuẩn lạc có màu hồng đặc trưng trên môi trường phân lập cấy ria trên đĩa môi trường mới nhiều lần (3 – 4 lần), để tạo chủng thuần.
3.2.5. Giữ giống.
Để có chủng vi khuẩn tiến hành các nghiên cứu có liên quan nên chúng tôi dùng vi khuẩn thuần cấy sang môi trường giữ giống GPA và bảo quản giống trong glycerol 50% trong điều kiện đông lạnh.
3.2.6. Khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Được tiến hành với các thử nghiệm chủ yếu sau:
3.2.6.1. Thử nghiệm gram và đo kích thƣớc tế bào [4], [6], [7]
Thử nghiệm Gram là thử nghiệm đầu tiên, đơn giản trong các thử nghiệm sinh hóa nhưng thử nghiệm Gram có ý nghĩa quan trọng trong quá trình định danh vi sinh vật. Để xác định Gram các chủng đã phân lập và làm thuần chúng tôi tiến hành theo hai phương pháp: