Hầu hết các loài Methylobacterium sp. thường có hình que kích thước 0,8 – 1 x 1 – 8 m. Tế bào thường có hình dạng phân nhánh hay có những dạng bất thường khác, đặc biệt thường xuất hiện ở pha cuối của quá trình tăng trưởng. Vi khuẩn
Methylobacterium thường ở dạng tế bào đơn hay kết đôi lại theo dạng hoa hồng [34],[86].
Hầu hết các chủng Methylobacterium sp. đều có khả năng di động nhờ một tiêm mao ở cực hay gần cực. Tuy nhiên, vài loài thì không. Đa số các loài vi khuẩn
Methylobacterium sp. là vi khuẩn gram âm, một số có gram biến đổi. Vi khuẩn
Methylobacterium thường tăng sinh chậm, khuẩn lạc có màu hồng đậm hay đỏ cam, một vài chủng không tăng trưởng trên môi trường nutrient agar. Sắc tố hồng vi khuẩn
Methylobacterium không tan trong nước và là hợp chất carotenoid. Ở môi trường lỏng, nuôi cấy tỉnh vi khuẩn Methylobacterium tạo thành một lớp mỏng trên bề mặt, đều này cho thấy hầu hết các chủng đều là hiếu khí bắt buộc. Chúng có phản ứng oxydase dương tính yếu, catalase âm tính hay dương tính tùy thuộc vào loài vi khuẩn.
Methylobacterium sp. là những vi khuẩn dị hóa sinh dưỡng có khả năng sử dụng các hợp chất methyl. Do vây, tất cả các loài có khả năng tăng trưởng trên môi trường có bổ sung formaldehyde ở nồng độ thấp, formate và methanol, một vài loài có khả năng sử dụng hợp chất methylamine chỉ có một loài duy nhất là M. organophilum có thể sử dụng methan là nguồn cung cấp cacbon và năng lượng. Ngoài ra, M. chloromethanicum có thể sử dụng chloromethane và M. thiocinatum có thể sử dụng thiocinate. Một số loài có khả năng lên men lactose, có phản ứng LDC, Urease dương tính. Một số loài có khả năng sinh indole và một số loài có khả năng khử nitrate thành nitrite [10], [24], [25], [29], [30], [31], [34], [41], [57].
Phương thức chuyển hóa các hợp chất một cacbon ở tất cả các loài vi khuẩn
Methylobacterium đều theo chu trình serine. Trong đó có sự gắn kết giữa chu trình serine và chu trình tricarboxylic (TCA) để tạo ra các sản phẩm hữu cơ cuối cùng cho vi khuẩn sử dụng. Ngoài ra, các chu trình này còn gắn kết với chu trình PHB để tạo ra các sản phẩm dự trữ cho vi khuẩn (poly – – hydroxybutyrate). Một số chủng có khả năng tổng hợp hormone thực vật (phytohormone) trong môi trường nuôi cấy, một số loài có khả năng tổng hợp vitamine B12 và một số chất khác [10], [24], [55], [58], [61], [68],[84], [90]. chú thích: 1, crotonyl-CoA reductase 2, L-crotonase 3, NADH-linked acetoacetyl-CoA reductase 4, D-crotonase. 5, b-ketothiolase 6, NADPH-linked acetoacetyl-CoA reductase 7, PHB synthase 8, PHB depolymerase 9, -hydroxybutyrate dehydrogenase 10, acetoacetate–succinyl-CoA transferase.
Hình 2.3: Sự gắn kết giữa chu kỳ serine và chu kỳ PHB trong quá trình biến dưỡng [52].
Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của các loài thuộc chi Methylobacterium
biến thiên từ 25 – 300C. Một vài loài có thể phát triển ở nhiệt độ 370C hay 510C. Đa số các loài đều tăng trưởng trong khoảng pH trung tính, một số loài vẫn có khả năng phát triển ở các giá trị pH từ 4 – 10 [34].
Vi khuẩn Methylobacterium có tính kháng cao với chất khử, nhiệt độ lạnh, Cl- , tia UV, phóng xạ ion, và nhiệt độ cao. Phần lớn các loài trong chi Methylobacterium
đều nhạy cảm với kháng sinh như: kanamycine, albamycine T, streptomycine, framycine và tetracycline. Trong đó, tetracycline có ức chế mạnh đối với vi khuẩn
Methylobacterium. Ngoài ra, các loài Methylobacterium sp. có khả năng đề kháng với nhiều chất kháng sinh như: cephalothine, acid nalidicic, penicyline, bacitracine, carbenicillin, colestin sulfate, polymycine B và nitrofurantoin [29], [34], [37], [102].
Khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ cung cấp nguồn cacbon và năng lượng của chủng vi khuẩn PPFM thuộc chi Methylobacterium rất đặc trưng. Hầu hết các chủng có khả năng sử dụng betaine, trimethylamine, serbactae,…Trong khi một số loài khác có khả năng sử dụng cyanate, thiocianate, formaldehyde, TNT (2,4,6- trinitrotoluene), HMX (octahydro-1,3,5,7-tetranitro-1,3,5,7tetrazicine hay high- melting-point explosive), RDX (hexahydro-trinitro-1,3,5-triazine hay royal explosive),…Do vậy, có thể phân biệt các loài vi khuẩn Methylobacterium sp. nhờ căn cứ vào khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ của các chủng vi khuẩn này [9],[25], [28], [34],[58],[89].
Một vài loài vi khuẩn Methylobacterium sp. còn có bacterochlorophyll trong vài điều kiện nuôi cấy đặc biệt, từ đó cho thấy khả năng tự dưỡng của một vài loài vi khuẩn Methylobacterium sp. [34].
2.3. Sự tƣơng tác giữa vi sinh vật và thực vật
2.3.1. Sơ lƣợc về tƣơng tác giữa vi sinh vật và thực vật.
Giữa thực vật và vi sinh vật có mối quan hệ mật thiết với nhau, và đây là mối quan hệ rất phức tạp. Trong mối quan hệ đó, vi sinh vật có thể là tác nhân có lợi và cũng có thể là tác nhân có hại cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Sự định cư của vi sinh vật trên thực vật rất đa dạng có thể trên thân, lá, rễ và cả ở cơ quan sinh sản như hoa, quả, hạt. [9],[13], [14], [17], [18], [19], [21], [33], [32], [35], [38], [43], [44],… Theo Hirano và ctv (1983), cho rằng lá là nơi hổ trợ cho sự phát triển của nhiều loài vi sinh vật và phần lớn trong số đó là vi sinh vật gây bệnh. Pseudomonas
syringae là một ví dụ cụ thể cho trường hợp trên và chúng có thể gây bệnh cho nhiều loài thực vật khác nhau [9], [38].
Ngoài ra, có nhiều vi sinh vật gây bệnh khác cũng đã được ghi nhận trên nhiều loài thực vật khác nhau như: nấm Phytophthora, Xanthomonas,…[82]. Tuy nhiên, bên cạnh các vi sinh vật có hại cũng tồn tại nhiều vi sinh vật có lợi cho thực vật. Cơ chế tạo ra ảnh hưởng có lợi của vi sinh vật lên thực vật rất đa dạng. Trong trường hợp của vi khuẩn sống ở rễ chúng có thể biến dưỡng nitrogen từ khí quyển thành nitrate, ammonia, tạo các chất trung gian để cô lập các chất khoáng cho thực vật, tổng hợp các phytohormone, hay tổng hợp các chất trung gian để cô lập các chất khoáng cần thiết cho vi sinh vật gây bệnh, làm cho vi sinh vật gây bệnh không thể sử dụng được các chất khoáng này hay tổng hợp các chất kháng vi sinh vật gây bệnh cho thực vật như các chất kháng sinh, các enzyme thủy phân vách tế bào, các hydrogen cyanide để ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh hay kích thích tạo tính kháng bệnh của thực vật [19], [33], [50], [74]. Trong đó, nấm Trichoderma là nấm hiện diện trên nhiều thực vật, trên nhiều cơ quan khác nhau và chúng là nấm có lợi, không những chúng có khả năng gia tăng tăng trưởng, gia tăng năng suất mà còn gia tăng khả năng kháng bệnh của cây đối với các bệnh gây hại do Fusarium, Alternaria, Cochliobolus heterostrophus, Rhizoctonia solani,… [17], [35], [44], [56]. Trong mối quan hệ đó, sự cộng sinh giữa cây họ đậu và vi khuẩn đất được cho là nhân tố quan trọng cho môi trường và trong nông nghiệp đã được nghiên cứu từ rất sớm. Vi khuẩn rễ có thể tìm thấy trong hầu hết 18.000 loài của họ đậu Leguminosae (thực vật hai lá mầm), ở rễ cây mía (thực vật một lá mầm) và nhiều loài thực vật khác [9], [70], [87], [97].
Cơ chế ảnh hưởng lên sự phát triển của thực vật bởi vi sinh vật trong điều kiện
in vitro cũng đã được nghiên cứu và chứng minh. Một số vi sinh vật có khả năng kích thích sự phát triển hình thái và tăng trưởng của thực vật. Vi khuẩn Methanotrophic là một ví dụ điển hình, có khả năng kích thích sự hình thành callus (mô sẹo) của hạt lúa mì và gia tăng khả năng tạo rễ trong môi trường nuôi cấy, vì vậy làm cho tỷ lệ tái sinh cây cũng đạt hiệu quả và rút ngắn được thời gian. Sự gia tăng khả năng tạo callus (mô sẹo) và tạo rễ cũng được ghi nhận khi thí nghiệm đối với phôi hạt bắp [47], [48].
Từ những cơ sở trên, có thể khẳng định rằng, sự tương tác giữa vi sinh vật với thực vật không những chỉ là mối quan hệ gây hại cho nhau mà đôi khi quan hệ này lại
tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của thực vật trong điều kiện in vivo cũng như trong điều kiện in vitro.
2.3.2. Sự tƣơng tác giữa Methylobacterium với thực vật.
Vi khuẩn PPFM (pink-pigmented facultative methylotrophic) là nhóm vi khuẩn đặc trưng thuộc chi Methylobacterium được phân lập ở hơn 100 loài thực vật từ rêu, địa y, thực vật hạt trần và thực vật hạt kín. Methylobacterium sp. là loài tồn tại lâu dài và chiếm tỷ lệ lớn nhất trên bề mặt lá được rửa sạch. Holland và ctv (1994), cho rằng việc khử trùng thông thường trong việc chuẩn bị mẫu cho nuôi cấy mô không loại được vi khuẩn Methylobacterium. Đây là nhóm vi khuẩn phong phú và phổ biến trên thực vật, phân bố chủ yếu ở lá, đặt biệt ở lá non. Ngoài ra, Methylobacterium còn sống ở rễ và hạt. Mật độ của PPFM trong khoảng 104 – 107 cfu (colony forming unit) trên mỗi gram trong lượng tươi của mô thực vật và ở hạt đậu nành khô thì mật độ khoảng 105 cfu/gram [40], [59], [60].
Mặc dù vi khuẩn PPFM tăng trưởng rất chậm so với các chủng vi khuẩn khác trên bề mặt lá, nhưng chúng vẫn có khả năng tồn tại với số lượng lớn và có khả năng tạo khuẩn lạc là do chúng sử dụng nguồn dinh dưỡng khác thường – methanol (chỉ thích hợp với một số vi khuẩn). Methanol thường được tạo ra trong quá trình phân hủy pectin từ mô, đặc biệt là ở mô đang hoạt động sinh trưởng [55], [71], [72].
Mối quan hệ giữa vi khuẩn PPFM với thực vật không phải là mối quan hệ một chiều, mà cùng với việc hấp thu các chất tiết ra thực vật thì vi khuẩn PPFM có thể tổng hợp và tiết ra các chất khác nhau có lợi cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Chủng PPFM đầu tiên được phân lập bởi Basile và ctv (1969), có khả năng kích thích sinh trưởng của cây địa tiền (liverwort, Scapania nemorosa) trong môi trường nuôi cấy in vitro. Sau đó, Corpe và Basile (1982), chứng minh rằng PPFM gia tăng khả năng tạo callus (mô sẹo), gia tăng khả năng tái sinh cây từ mô cây anh thảo (cây báo xuân) Streptocarpus prolixus. Corpe và Basile (1982), cũng chứng minh được rằng vi khuẩn PPFM có khả năng tổng hợp vitamine B12 (cyanocobalamine) và kích thích sinh trưởng, phát triển của cây rêu Jungermannia leiantha và Gymnocolea inflata
[39], [40], [51], [84].
Các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh được rằng, vi khuẩn PPFM có khả năng tương tác với cây đậu nành trong việc chuyển hóa nicken, PPFM có khả năng gia tăng tỷ lệ nẩy mầm của hạt, cũng như gia tăng năng suất cây đậu nành. Khả
năng kích thích tăng trưởng, gia tăng năng suất của thực vật khi xử lý PPFM trên lá cũng được ghi nhận trên cây bông (Gossypium hirsutum L.) và cây mía (Saccharum officinarum L.). Trong nghiên cứu của Maliti (2000), thì một số chủng PPFM có khả năng gia tăng khả năng tạo callus (mô sẹo) từ phôi hạt lúa, trong khi một số chủng khác lại có khả năng kích thích sinh trưởng và phát triển của các cơ quan như lá, rễ, thân lúa. Nhưng một số chủng khác lại ức chế phát triển của rễ lúa. Trong nghiên cứu của Madhaiyan và ctv (2005), đã chỉ ra rằng tất cả các chủng vi khuẩn
Methylobacterium sp. trong nghiên cứu có khả năng kích thích sự nẩy mầm của hạt lúa, kích thích tăng trưởng, gia tăng tỷ lệ tạo nhánh, gia tăng khả năng kháng bệnh và giảm tỷ lệ cây bệnh với Rhizoctonia solani, cũng như góp phần làm gia tăng năng suất lúa (hơn 55,44g/ lỗ) [40], [59], [60], [61].
2.3.3. Sự tạo các hoạt chất thứ cấp bởi Methylobacterium có lợi cho thực vật
Mặc dù có nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng kích thích sinh trưởng của PPFM lên thực vật. Tuy nhiên, cơ chế của khả năng kích thích này chưa được hiểu rõ và thống nhất vẫn còn có nhiều giả thuyết khác nhau đó là:
- Sự cô lập, chuyển hóa các khoáng dinh dưỡng (bao gồm khoáng vi hay đa lượng) từ môi trường hoặc từ đất cho cây. Cơ chế cô lập các khoáng dinh dưỡng liên quan đến sự tổng hợp các phân tử có lợi cho quá trình hấp thu những ion. Cơ chế này đã được chỉ ra ở vi khuẩn rễ ở một số thực vật [46], [61], [93]. - Sự tổng hợp các phytohormone hay các hợp chất tương tự phyohormone được
phóng thích vào môi trường hay vào hệ thống mạch của thực vật. Cơ chế này bao gồm sự tổng hợp cytokinin, auxin và hợp chất tương tự auxin bởi một vài chủng PPFM [24], [39], [40], [55], [71], [72].
- Sự tổng hợp và giải phóng các enzyme tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sinh hóa hay sinh lý của mô thực vật. Sự tổng hợp enzyme urease bởi vi sinh vật đã được chỉ ra ở nhiều chủng PPFM. Urease rất cần thiết trong quá trình biến dưỡng nitrogen ở thực vật [40], [61].
- Cơ chế thứ tư góp phần gia tăng sự tăng trưởng của cây lúa nói riêng và các cây trồng khác nói chung có thể là do sự tổng hợp và phóng thích vitamine B12 hoặc những hợp chất tương tự. Nghiên cứu của Basile và ctv (1985), đã chứng minh rằng việc bổ sung vitamine B12 nồng độ thấp có thể gia tăng sự tăng trưởng của hai loài địa tiền - liverwort in vitro [61], [84].
Khả năng tổng hợp các phytohormone không chỉ hiện diện ở thực vật mà còn diễn ra ở cả vi sinh vật. Khả năng tổng hợp các phytohormone đã được xác định ở nhiều vi sinh vật. Những vi khuẩn sống trong đất và vi khuẩn quan hệ với thực vật có khả năng tổng hợp phytohormone bao gồm vi khuẩn gram âm, gram dương, vi khuẩn gây bệnh cho thực vật, vi khuẩn cộng sinh và vi khuẩn biến dưỡng nitrogen. Nhiều loài vi khuẩn trong nhóm này có thể tổng hợp và tiết vào môi trường nuôi cấy nhiều hơn một hormone. Chủng Rhizobium có thể tổng hợp gibberellins (GA) và auxin, Azotobacter spp. có thể tổng hợp GA, auxin và cytokinins, Acetobacter và Herbaspirillum có thể tổng hợp IAA và GA. Nên chúng có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật trong điều kiện in vivo
cũng như in vitro [24], [71].
Sự tổng hợp IAA của một số PPFM cũng đã được ghi nhân. Sự tạo indole và dẫn xuất của chúng từ L- tryptophan là môt đặc trưng phân biệt của những vi khuẩn gram âm hiếu khí. Trong nghiên cứu của Ivanova và ctv (2001), bằng cách sử dụng những thuốc thử Salkowski và Van Urk đã chỉ ra rằng 4 loài Methylobacteria
là Methylobacterium mesophilicum, Aminobacter aminovorans, Methylovorus mays
và Paracoccus kondratievae có thể tạo IAA. Trong nghiên cứu của Omer và ctv (2004), chứng minh rằng vi khuẩn hiếu khí Methylobacteria có thể tổng hợp auxin (chủ yếu là IAA) từ L-tryptophan ngoại bào. PPFM cũng có thể tổng hợp lượng nhỏ IAA trong môi trường với peptone là nguồn cacbon và nitrogen. Trong nghiên cứu khác của Omer và ctv (2004), chỉ ra rằng ba trong số 16 chủng PPFM được kiểm tra trong môi trường nuôi cấy lỏng có thể tổng hợp IAA. Ba chủng tạo IAA đã tích lũy phytohormone với khối lượng biến thiên trong khoảng 6 – 13,3mg/l trong môi trường bổ sung L-tryptophan và 1,1 – 2,4mg/l khi không bổ sung L-tryptophan vào môi trường nuôi cấy, đến 12 ngày sau thì hàm lượng IAA tạo ra trong môi trường có bổ sung L-tryptophan cao gấp 6 lần so với nuôi cấy không có L-tryptophan [24], [26], [71].
Cytokinins được tạo ra bởi vi khuẩn bằng ít nhất hai con đường. Con đường đầu tiên là tổng hợp de novo, là dạng chuyển đổi trực tiếp đồng phân (isopentenylation) của AMP (adenine monophosphate) bởi enzyme dimethylallyl transferase (DMAT), được ghi nhận đầu tiên ở vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Con đường thứ hai của quá trình tạo cytokinins bởi vi khuẩn là quá trình chuyển đổi của tRNA tương tự như
cơ chế hoạt động ở thực vật bậc cao. Sự tạo cytokinins bởi vi khuẩn PPFMs đã được Koenig và ctv (2001), kiểm tra. Tất cả các chủng kiểm tra điều tạo được cytokinins ở mức độ đủ đáp ứng và phát hiện được. Lượng cytokinins quan sát được là 15,2 và 19,6ng/mg. Bốn chủng Methylobacterium khác nhau hiện diện trên bề mặt lá và một chủng của Methylobacterium extorquens đều có khả năng tạo cytokinin trans-zeatin với mức độ thấp và tiết vào trong môi trường nuôi cấy [32], [33], [35], [39], [40], [57], [58].
Trong những nghiên cứu về những hợp chất để tạo nên hương dâu tây (Fragaria ananassa) cho thấy rằng vi khuẩn Methylobacterium cần thiết cho quá trình tổng hợp tiền chất của 2,5-dimethyl-4-hydroxy-2Hfuran- 3-one (DMHF) và 2,5-dimethyl-4- methoxy-2H-furan-3-one (mesifuran). Khi callus (mô sẹo) dâu tây đồng nuôi cấy với vi khuẩn PPFM thì hàm lượng DMHF là 5g/860,5g mô tươi và 11g/357,97g ở