Được tiến hành với các thử nghiệm chủ yếu sau:
3.2.6.1. Thử nghiệm gram và đo kích thƣớc tế bào [4], [6], [7]
Thử nghiệm Gram là thử nghiệm đầu tiên, đơn giản trong các thử nghiệm sinh hóa nhưng thử nghiệm Gram có ý nghĩa quan trọng trong quá trình định danh vi sinh vật. Để xác định Gram các chủng đã phân lập và làm thuần chúng tôi tiến hành theo hai phương pháp:
Phương pháp này dựa vào khả năng tạo nhầy giữa sinh khối của vi khuẩn với dung dịch KOH 3%. Dưới tác dụng của dung dịch kiềm loãng vách tế bào vi khuẩn Gram âm bị phân hủy làm giải phóng DNA và tạo dịch nhầy khi phản ứng với KOH. String dương (dương tính) khi giữa que cấy và dung dịch có sợi nhầy mảnh, tức là vi khuẩn Gram âm, ngược lại khi String âm thì vi khuẩn là Gram dương.
+ Phương pháp nhuộm Gram Nguyên tắc:
Phương pháp nhuộm Gram dựa vào khả năng lưu giữ crystal violet của thành tế bào các dòng vi khuẩn sau khi bị tẩy bằng cồn. Cấu tạo thành tế bào vi khuẩn bắt màu Gram dương gồm các thành phần peptidoglycan nhiều hơn ở thành tế bào vi khuẩn bắt màu Gram âm, ngược lại thành phần lipid của chúng lại thấp hơn. Iod được thêm vào như một chất cắn màu để tạo thành hợp chất crystal violet-iodine bền với cồn. Giai đoạn này là giai đoạn cố định màu. Ở giai đoạn rửa cồn, lớp chất béo ở vi khuẩn gram âm bị cồn hòa tan dẫn đến chất nhuộm ban đầu bị hòa tan vào dung môi. Ngược lại, ở vi khuẩn gram dương chất nhuộm ban đầu bao bọc thành tế bào thành lớp dày và hợp chất violet-iodine không bị phai ra môi trường xung quanh. Do đó, vi khuẩn gram dương vẫn giữ được màu nhuộm ban đầu.
Vi khuẩn gram âm sau khi nhuộm có màu hồng đỏ còn vi khuẩn gram dương có màu tím.
Tiến hành:
- Cho sinh khối vi khuẩn lên lam kính sạch để khô tự nhiên.
- Hơ mặt dưới của lam trên ngọn lửa 2 – 3 lần (tránh để tiêu bản quá nóng). - Phủ dung dịch Crystal violet lên lam kính trong một phút.
- Đổ bỏ dịch Crystal violet và rửa bằng nước cất.
- Phủ dung dịch lugol để một phút sau đó đổ bỏ lugol và rửa nhẹ bằng nước. - Tẩy màu bằng cồn trong khoảng 10 – 15 giây.
- Rửa lại bằng nước.
- Phủ dịch fuschin lên lam kính trong khoảng 30 giây. Đổ bỏ fuschin và rửa bằng nước.
- Dùng giấy thấm để thấm hay để khô tự nhiên.
- Xem kết quả dưới kính hiển vi độ phóng đại của vật kính 100X với một giọt dầu
Các chủng vi khuẩn trong thí nghịêm được thử nghiệm sau 2, 4, 6, 8 ngày nuôi cấy trên môi trường CMS.
+ Đo kích thước tế bào
Sau khi nhuộm gram, quan sát dưới khính hiển vi độ phóng đại vật kính 100X và đo kích thước tế bào.
3.2.6.2. Mối quan hệ với oxi
Được tiến hành qua thử nghiệm catalase và hoạt tính oxidase trong bộ thử nghiệm IDS14GR.
+ Thử nghiệm catalase
Nguyên tắc: Nhằm xác định sự có mặt của enzyme catalase trong vi khuẩn. Phương pháp thử:
- Thử trên lam: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc thuần đặt lên lam kính sạch. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên vi sinh vật trên lam.
- Thử trong ống nghiệm: Nhỏ trực tiếp 1ml H2O2 30% lên dòng thuần vi sinh vật cấy dày đặt trên mặt thạch nghiêng.
Kết quả: Thử nghiệm dương tính khi có bóng khí xuất hiện, âm tính khi không có bóng khí.
+ Thử nghiệm oxidase:
Nguyên tắc: nhằm xác định hoạt tính cytochrome oxidase trong các loài sinh vật hiếu khí hay hiếu khí tùy ý.
Phương pháp: dàn điều sinh khối vi khuẩn lên đĩa giấy có tẩm dung dịch tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride (TMPD) quan sát sự xuất hiện màu xanh dương trong khoảng một phút.
3.2.6.3. Khảo sát khả năng di động
Khả năng di động của vi khuẩn được ghi nhận khi thử nghiệm cấy vi khuẩn trong thạch mềm. Nếu vi khuẩn chỉ phát triển xung quanh đường cấy thì vi khuẩn không di động nếu vi khuẩn mọc lan rộng khỏi đường cấy thì vi khuẩn có khả năng di động.
Môi trường thử nghiệm là môi trường thạch mềm LDC (trong IDS14GR)
3.2.6.4. Thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn cacbon của vi khuẩn.
Nguyên tắc: Trong quá trình biến dưỡng vi khuẩn sử dụng các nguồn cacbon để tăng trưởng, đồng thời tiết ra các chất làm thay đổi pH môi trường. Do đó, khi sử
dụng chất chỉ thị pH là bromothymol blue thì khả năng sử dụng các nguồn cacbon của vi khuẩn được ghi nhận bằng sự thay đổi màu của môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Ở pH trung tính thì màu môi trường là xanh lá cây, acid là màu vàng và màu xanh dương khi pH kiềm. Phản ứng dương khi màu môi trường thay đổi so với màu môi trường đối chứng âm (màu xanh lá cây, không cấy vi khuẩn).
Mục đích: Nhằm sàng lọc và xác định các nhóm khuẩn lạc đã phân lập theo các đặc tính sinh hóa, tạo tiền đề thuận lợi cho các thử nghiệm định danh sau này nên chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả năng sử dụng nguồn cacbon của các khuẩn lạc thuần phân lập được.
Vật liệu: Các khuẩn lạc thuần đã phân lập.
Tiến hành: Pha môi trường MMS hấp vô trùng, sau đó bổ sung 1% chất cung cấp nguồn cacbon và chất chỉ thị pH 2ml/l vào môi trường điều chỉnh pH môi trường ở 7 2 bằng KOH 1N và HCl 1N. Sau đó cho môi trường vào các lổ của microplate
1ml/lỗ, cấy vi khuẩn vào các lỗ ngoài trừ lỗ đối chứng.
Các chất cung cấp nguồn cacbon đã thử nghiệm: L-arabinose, fructose, ethanol, L- glutamate, acetate, methylamine, trimethylamine, serbacate, D-glocose, sucrose, manitol, maltose, betaine, citrate, lactose và môi trường nutrient agar tổng hợp (Merk).
3.2.6.5. Các thử nghiệm trong bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR.
Để có thể định danh chính xác hơn các dòng vi khuẩn đã phân lập và thử nghiệm ở trên, nên chúng tôi tiếp tục khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác bằng bộ thử nghiệm sinh hóa định danh vi khuẩn gram âm IDS 14GNR của công ty Nam Khoa.
Các thử nghiệm trong bộ thử nghiệm IDS 14GNR bao gồm: + Khả năng lên men glucose (MR)
Nhằm kiểm tra khả năng của vi sinh vật lên men glucose tạo các sản phẩm cuối mang tính acid và vượt qua khả năng ổn định pH của môi trường. Đây là phép thử định tính về khả năng sinh acid (xác định pH) do một số vi sinh vật sinh acid nhiều hơn các vi sinh vật khác.
+ Khả năng khử nitrate
Xác định sự hiện diện của enzyme nitratreductase ở vi sinh vật, và chúng có khả năng sử dụng nitrate làm nguồn thức ăn nitơ. Ngoài ra, một số vi sinh vật có khả
năng sử dụng nitrate làm chất nhận electron hay H+
trong hô hấp kị khí để oxy hóa các hợp chất hữu cơ
NO3- + 2e- + 2H+ NO2- + H2O.
+ Khả năng sinh tổng hợp galactosidase (thử nghiệm ONPG, o-nitrophenyl-β -D- galactopyranoside)
Nhằm xác định sự có mặt của enzyme β-galactosidase có ở vi sinh vật nhờ sự hiện diện của cơ chất ONPG. Khi vi khuẩn có enzyme này thì nó sẽ phân cắt ONPG làm giải phóng nitrophenyl làm môi trường xuất hiện màu vàng.
Mục đích: Phân biệt vi khuẩn có khả năng sử dụng lactose.
+ Khả năng tạo urease
Xác định khả năng của vi sinh vật phân giải urea tạo ra hai phân tử ammonia do tác dụng của enzyme urease làm kiềm hóa môi trường
+ Khả năng tạo phenylalanine deaminase (PAD)
Nhằm xác định sự hiện diện của enzyme PDA ở vi khuẩn và khử nhóm amine của phenylalanine.
+ Khả năng sử dụng citrate
Nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sử dụng citrate như nguồn cacbon duy nhất cho hoạt động trao đổi chất và làm kiềm hóa môi trường.
+ Khả năng thủy giải Esculin
Nhằm xác định khả năng thủy phân glycoside esculin thành glucose và esculetin của một số vi khuẩn, trong điều kiện có sự hiện diện của 40% muối mật.
+ Khả năng sinh H2S
Xác định khả năng của vi sinh vật có khả năng sinh H2S từ các acid amin chứa lưu huỳnh tạo chất tủa màu đen.
+ Thử nghiệm Voges – Proskauer
Nhằm xác định khả năng của vi sinh vật có khả năng tạo sản phẩm cuối cùng mang tính trung tính là acetoin (acetylmethylcarbinol – AMC) do lên men glucose.
+ LDC (lysin decarboxylase)
Mục đích: Phát hiện vi khuẩn có khả năng phân giải lysin trong môi trường bằng cách khử nhóm carboxyl nhờ enzyme lysin decarboxylase.
Nhằm khảo sát khả năng của vi khuẩn sử dụng sodium malonate làm nguồn cacbon. Khi vi khuẩn sử dụng malonate sẽ sinh ra phản ứng kiềm, và làm biến đổi màu môi trường.
+ Khả năng sinh indole
Mục đích: Khảo sát khả năng thủy giải tryptophan trong môi trường tạo nhân indole
Tất cả các hóa chất của phản ứng sinh hóa được tẩm trong các đĩa giấy, sau đó cho vào các giếng được đánh số. Khi sử dụng lấy sinh khối vi khuẩn trên môi trường thạch, huyền phù vào nước muối sinh lý, sau đó cho 200μl dịch huyền phù này cho vào mỗi giếng ủ 36 giờ và đọc kết quả theo bảng sau:
Bảng 3.1: Hướng dẫn đọc kết quả bộ thử nghiệm sinh hoá IDS14GNR. Stt Phản ứng sinh hóa Thuốc thử Dương tính Âm tính
1 Lên men glucose Không vàng Tím
2 Khử nitrate 1 giấy tìm nitrate đỏ Vàng lợt
3 Galactosidase Không Vàng không màu
4 Urease Không đỏ cánh sen Đỏ nhạt/vàng
5 PDA 1 giọt FeCl3 xanh lá đậm Vàng lợt
6 Citrate Không xanh biển Xanh lá/vàng
7 Esculin Không Đen Không
8 Sinh H2S Không Đen Không
9 Sinh indole Kovac Chuyển màu
đỏ
Không đổi màu
10 Voges – Poskauer 1 giọt KOH, 1 giọt naphthol
Đỏ Vàng nhạt
11 Sử dụng malonate Không Xanh biển Vàng/ xanh lá
12 LDC Không Tím Vàng
3.2.6.6. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH
Bao gồm các thí nghiệm:
+ Xác định đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ tế bào [3], [6], [7]
Vi khuẩn nuôi cấy sau 48 giờ sau đó pha loãng thành các độ đục khác nhau có OD lân cận 0,1, 0,2; 0,4; 0,5.
Từ các độ đục tiến hành pha loãng đến 10-5
; 10-6; 10-7. Từ mỗi độ pha loãng cấy 0,1ml vào mỗi đĩa môi trường rắn CP. Ủ 300C trong 48 giờ đếm khuẩn lạc ở các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 20 – 300.
Tính số lượng tế bào trên ml mẫu bằng công thức: Ndi = A x 10 x di. Trong đó: - Ndi: số lượng tế bào ở độ pha loãng di
- A: số khuẩn lạc đếm được trên đĩa. - d: số lần pha loãng i.
Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa OD và log(N/ml) bằng phần mềm excel.
+ Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của vi khuẩn
Mục đích: Nhằm xác định nhiệt độ thích hợp cho sử phát triển của các chủng đã phân lập phục vụ cho những nghiên cứu ứng dụng sau này.
Vật liệu: Bốn chủng vi khuẩn đã phân nhóm ở những thí nghiệm trên được nuôi cấy trên môi trường cao-pep lỏng ở 20, 25, 30, 35, và 400C và đo OD ở bước sóng 610nm sau ba ngày.
+ Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi khuẩn
Mục đích: Nhằm xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển của các chủng phân lập được để làm cơ sở cho những nghiên cứu ứng dụng sau này.
Tiến hành:
Cấy vi khuẩn vào các ống nghiệm chứa môi trường cao thịt-peptone lỏng với các khoảng pH từ 4,0 – 8,5 (cách nhau 0,5). Nuôi cấy lắc 100vòng/phút, sau ba ngày ghi nhận độ đục OD610nm.
3.2.6.7. Xác định đƣờng cong tăng trƣởng của vi khuẩn
Nhằm xác định thời gian thích hợp để thu sinh khối và các hoạt chất do vi khuẩn tiết ra.
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy lắc ở 250C trong môi trường CMS và tiến hành đo OD610nm 4 giờ/lần trong vòng 48 giờ.
3.3. Định danh vi khuẩn
Mục tiêu này được thực hiện bằng các thí nghiệm sau:
3.3.1. Tính hệ số tƣơng đồng di truyền
Hệ số tương đồng di truyền Jaccard (Sj) cho phép xác định mức độ giống nhau của hai loài vi khuẩn. Vì vậy, để xác định mối quan hệ họ hàng của các chủng
LM2, TS7, TN10 và TD15 với các loài Methylobacterium sp. đã được công bố thì việc tính toán hệ số di truyền Jaccard là cần thiết.
Hệ số di truyền Jaccard được tình theo công thức sau:
Sj = a/(a +b). Trong đó:
a: tổng số các đặc điểm tương đồng của hai loài sinh vật b: tổng số các đặc điểm khác biệt giữa hai loài sinh vật.
Hệ số Sj thay đổi trong khoảng từ 0 – 1 (0% - 100%). Nếu hai loài sinh vật có hệ số Sj lớn hơn 0,8 (80%) thì chúng có khả năng cùng một loài.
3.3.2. Ly trích DNA vi khuẩn
Quy trình ly trích DNA bộ gen của các chủng Methylobacterium sp. theo quy trình của Rogers S.O. và ctv (1994), quy trình CTAB [78]. Bao gồm các bước sau:
Ly tâm thu sinh khối.
Bổ sung 600 l CATB nóng, vortex, ủ 650C trong 60 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút thu dịch nổi. Biến tính bằng 500 l dung dịch phenol – chloroform (1:1). Ly tâm 13000 vòng/phút, 5 phút thu dịch nổi.
Biến tính lần hai bằng 500 l dung dịch phenol – chloroform, lắc nhẹ. Tủa DNA bằng 1ml cồn tuyệt đối lạnh, ly tâm 13000 vòng/phút ở 40
C thu tủa.
Ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 phút ở 40C để thu tủa DNA. Rửa tủa bằng 250 l cồn 700.
Phơi mẫu cho khô cồn.
Hòa tan tủa trong 20 l dung dịch TE 0,1X.
Bổ sung 20 l dung dịch RNase (1mg/ml), ủ 370 trong 60 phút. Giữ ở 40
C
Sản phẩm DNA bộ gen đã ly trích được đánh giá tính nguyên vẹn khi điện di trên gel agarose 1% và độ tinh sạch được đánh giá thông qua tỷ số OD260nm/OD280nm.
Sản phẩm DNA bộ gen ly trích bao gồm bốn chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. đã phân nhóm và DNA chủng đối chứng là vi khuẩn E.coli.
3.3.3. Tiến hành phản ứng PCR.
3.3.3.1. Thành phần cho một phản ứng PCR.
Buffer 10X ... 2,5 l Mg++ 25mM ... 1,5 l dNTP 2mM ... 2,5 l Mồi xuôi (FPGS6 hay 2F) 10pmol/ l ... 1 l Mồi ngược (FPGS1509 hay 2R) 10pmol/ l 1 l DNA khuôn ... 0,5 l Taq polymerase 1U/ l ... 0,5 l
Nước ... vừa đủ 25 l 3.3.3.2. Các primer sử dụng [9], [68] FPGS1509: 5` ... AAGGAGGGGATCCAGCCGCA...3`. FPGS6: 5`... GGAGAGTTAGATCTTGGCTCAG ...3` 2F: 5`... GATCGGCCCGCGTCTGATTAG ...3`. 2R: 5`... CCGTCATTATCGTCCCGGACA ...3`.
Hình 3.1: Vị trí bắt cặp của các mồi trên vùng 16S rDNA.
Để định danh các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. đã phân lập được chúng tôi tiến hành các phản ứng như sau:
- Định tính vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium bằng phản ứng PCR với cặp mồi 2R và 2F với sản phẩm tạo ra là đoạn DNA có kích thước khoảng 234bp. Với chu trình nhiệt như sau:
Hình 3.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng với mồi 2F với 2R.
- Khuếch đại trình tự rDNA 16S nguyên vẹn của vi khuẩn Methylobacterium
phân lập được bằng cặp mồi FPGS6 và FPGS1509 và phối hợp sử dụng chung cặp mồi 2R và 2F. Với kích thước đoạn DNA tạo ra là khoảng 500base và 1200base. Với chu trình nhiệt như sau:
Hình 3.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng với cặp mồi FPGS6 với 2R và FPGS1509 với 2F
3.3.3.3. Điện di và xem kết quả.
Sản phẩm sau khi khuếch đại bằng PCR được điện di trên gel agarose 2% ở điện thế 50V trong 40 phút.
Sản phẩm điện di được ghi nhận bằng cách nhuộm ethidiumbromide và chiếu dưới đèn UV(ultra-violet).
3.3.4. Giải trình tự.
Nhằm định danh chính xác và chi tiết hơn các chủng vi khuẩn
Methylobacterium sp. đã phân lập được, nên chúng tôi tiến hành giải trình tự để so sánh với trình tự trên ngân hàng gen của NCBI (Mỹ).
Trình tự DNA của sản phẩm PCR của vi khuẩn được đọc bằng phương pháp PCR trực tiếp tại Hàn Quốc.
Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn có kích thước khoảng 500base và 1200