Khảo Sát Khả Năng Tổng Hợp Hợp Chất Thứ Cấp Của Vi Khuẩn Methylobacterium Sp. Trên Lúa Ở Tây Ninh

Phần mở đầu

Vật liệu và phương pháp

• Vật liệu
• Phương pháp tiến hành thí nghiệm
• Định danh vi khuẩn
• Khảo sát khả năng tổng hợp các hợp chất thử cấp của vi khuẩn

Do đó, để có khuẩn lạc thuần phục vụ cho tiến trình thử nghiệm sinh hóa chúng tôi tiến chọn lọc khuẩn lạc có màu hồng đặc trưng trên môi trường phân lập cấy ria trên đĩa môi trường mới nhiều lần (3 – 4 lần), để tạo chủng thuần. Để có chủng vi khuẩn tiến hành các nghiên cứu có liên quan nên chúng tôi dùng vi khuẩn thuần cấy sang môi trường giữ giống GPA và bảo quản giống trong glycerol 50% trong điều kiện đông lạnh. Thử nghiệm Gram là thử nghiệm đầu tiên, đơn giản trong các thử nghiệm sinh hóa nhưng thử nghiệm Gram có ý nghĩa quan trọng trong quá trình định danh vi sinh vật.

Ngược lại, ở vi khuẩn gram dương chất nhuộm ban đầu bao bọc thành tế bào thành lớp dày và hợp chất violet-iodine không bị phai ra môi trường xung quanh. Phương pháp: dàn điều sinh khối vi khuẩn lên đĩa giấy có tẩm dung dịch tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride (TMPD) quan sát sự xuất hiện màu xanh dương trong khoảng một phút. Nguyên tắc: Trong quá trình biến dưỡng vi khuẩn sử dụng các nguồn cacbon để tăng trưởng, đồng thời tiết ra các chất làm thay đổi pH môi trường.

Mục đích: Nhằm sàng lọc và xác định các nhóm khuẩn lạc đã phân lập theo các đặc tính sinh hóa, tạo tiền đề thuận lợi cho các thử nghiệm định danh sau này nên chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả năng sử dụng nguồn cacbon của các khuẩn lạc thuần phân lập được. Các chất cung cấp nguồn cacbon đã thử nghiệm: L-arabinose, fructose, ethanol, L- glutamate, acetate, methylamine, trimethylamine, serbacate, D-glocose, sucrose, manitol, maltose, betaine, citrate, lactose và môi trường nutrient agar tổng hợp (Merk). Để có thể định danh chính xác hơn các dòng vi khuẩn đã phân lập và thử nghiệm ở trên, nên chúng tôi tiếp tục khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác bằng bộ thử nghiệm sinh hóa định danh vi khuẩn gram âm IDS 14GNR của công ty Nam Khoa.

Nhằm xác định khả năng thủy phân glycoside esculin thành glucose và esculetin của một số vi khuẩn, trong điều kiện có sự hiện diện của 40% muối mật. Nhằm xác định khả năng của vi sinh vật có khả năng tạo sản phẩm cuối cùng mang tính trung tính là acetoin (acetylmethylcarbinol – AMC) do lên men glucose. Mục đích: Nhằm xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển của các chủng phân lập được để làm cơ sở cho những nghiên cứu ứng dụng sau này.

- Khuếch đại trình tự rDNA 16S nguyên vẹn của vi khuẩn Methylobacterium phân lập được bằng cặp mồi FPGS6 và FPGS1509 và phối hợp sử dụng chung cặp mồi 2R và 2F. Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn có kích thước khoảng 500base và 1200 base được pha loãng với nước cất khử ion sau đó tiến hành phản ứng PCR cho mẫu pha loãng này nếu kết quả dương tính thì gởi mẫu pha loãng này để giải trình tự. Mục tiêu: Sàn lọc các chủng có khả năng tổng hợp auxin để có thể ứng dụng chúng trong nuôi cấy in vitro và làm chế phẩm vi sinh dùng trong nông nghiệp và chế phẩm vi sinh cho cây lúa.

Kết quả và biện luận

• Kết quả khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa 1. Kết quả thử nghiệm gram và đo kích thước tế bào
• Định danh vi khuẩn

Từ đó chúng tôi cho rằng các hai chủng TS7 và TD15 là vi khuẩn gram âm còn hai chủng LM2 và TN10 là vi khuẩn gram âm biến đổi. Ngoài ra, trong bốn chủng đại diện cho nhóm đều cho phản ứng oxydase dương tính cũng cho phép chúng tôi xác nhận một lần nữa các chủng này là vi khuẩn hiếu khí. Kết quả thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn cung cấp carbon và năng lượng các khuẩn lạc thuần được tóm tắt trên bảng 4.2.

Các khuẩn lạc có đặc điểm sinh hóa giống nhau được xếp vào cùng một nhóm và từ mỗi nhóm này chỉ dùng một đại diện để tiến hành tính hệ số tương đồng Jaccard so với đặc điểm sinh hóa của các chủng đã được công bố. Từ các chủng vi khuẩn đại diện cho nhóm theo các đặc điểm sinh lý, sinh hóa để có thể khảo sát đầy đủ hơn một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của bốn chủng vi khuẩn chúng tôi tiến hành dùng bộ thử nghiệm sinh hóa định danh vi khuẩn gram âm để khảo sát một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác. Các chủng trong thí nghiệm đều có khả năng tăng trưởng tốt trên môi trường trong khoảng nhiệt độ biến thiên từ 20 – 300C.

Tuy nhiên, kết quả định danh dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa chưa thể định danh chính xác các chủng có thuộc chi Methylobacterium hay không và phương pháp định danh bằng sinh lý, sinh hóa cũng không thể định danh các dòng vi khuẩn đã phân lập thuộc loài nào. Trong khi đó, theo nghiên cứu của Nishio và ctv (1997), [68] cho rằng cặp mồi 2F và 2R cho kết quả dương tính với 7 chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. Do kết quả đoạn DNA đặc trưng chỉ có thể định danh các dòng vi khuẩn có thuộc chi Methylobacterium hay không, mà không cho kết quả định danh đến mức độ loài.

Tuy nhiên, cặp mồi này tạo ra trình tự tương đối lớn gây khó khăn cho quá trình giải trình tự, nên chúng tôi sử dụng phối hợp với cặp mồi 2F và 2R sản phẩm tạo ra là hai đoạn khoảng 500base và 1200base (hình 4.9). Kết quả cho thấy rằng trong các mẫu giải trình tự chỉ có hai mẫu chính xác ở mức tinh cậy được là đoạn DNA 500base của mẫu LM2 và TN10, còn các mẫu còn lại có sự sai sót đáng kểtrong quá trình giải trình tự do mẫu chưa được tinh sạch. Mối quan hệ của trình tự hai chủng so với các chủng trên ngân hàng gen NCBI và của phòng thí nghiệm được biểu diển trên cây sinh loài được vẽ bằng phần mềm CluxtalX và Treeview.

Từ những số liệu so sánh này có thể thấy rằng mức độ tương đồng trình tự giữa chủng thí nghiệm với chủng đã công bố tương đối lớn. Bên cạnh đó, trong nghiên cứu của Omer và ctv (2004), Ivanova và ctv (2001), một số chủng thuộc chi Methylobacterium có thể tổng hợp auxin. Từ đó có thể khẳng định rằng hai chủng này có khả năng tổng hợp auxin ở nồng độ đủ phát hiện, còn hai chủng LM2 và TD15 có thể chúng không thể tổng hợp auxin hoặc nồng độ auxin tạo ra của hai chủng này không đủ lớn để có thể phản ứng với thuốc thử Salkowski cải tiến.