Sinh trưởng của vi khuẩn

1.5.1 Yếu tố sinh trưởng

Theo Biền Văn Minh và ctv., (2006) thì:

Đối với vi sinh vật thì yếu tố sinh trưởng là một khái niệm rất linh động. Nó chỉ có ý nghĩa là những chất hữu cơ cần thiết đối với hoạt động sống mà một loại vi sinh vật nào đó không tự tổng hợp được từ các chất khác. Những chất được coi là yếu tố sinh trưởng của loài vi sinh vật này hoàn toàn có thể không phải là yếu tố sinh trưởng đối với một loại vi sinh vật khác. Hầu như không có chất nào là yếu tố sinh trưởng chung đối với tất cả các loài vi sinh vật.

Đặc điểm của môi trường sống có ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp yếu tố sinh trưởng của vi sinh vật, mặt khác ảnh hưởng đến đặc điểm trao đổi chất của chúng. Chính thông qua các ảnh hưởng này mà môi trường sống của từng

14

loại vi sinh vật đã góp phần quyết định nhu cầu của chúng về yếu tố sinh trưởng. Khi sống lâu dài trong các môi trường thiếu yếu tố sinh trưởng, vi sinh vật sẽ dần dần tạo ra được khả năng tự tổng hợp yếu tố sinh trưởng mà chúng cần thiết.

Cùng một loài vi sinh vật nhưng nếu nuôi cấy trong các điều kiện khác nhau cũng có thể có những nhu cầu khác nhau về yếu tố sinh trưởng. Chẳng hạn nấm mốc Mucor rouxii được chứng minh là chỉ cần biotine và thiamine khi phát triển trong điều kiện kị khí. Khi nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí, chúng sẽ tự tổng hợp ra được yếu tố sinh trưởng này.

Sự có mặt của một số chất dinh dưỡng khác có khi cũng ảnh hưởng đến nhu cầu về yếu tố sinh trưởng của vi sinh vật. Chẳng hạn việc đòi hỏi pantotenic acid của một số vi sinh vật (ví dụ vi khuẩn bạch hầu

Corynebacterium diphtheriae) có thể thỏa mãn khi chỉ cần cung cấp cho chúng  - alanine, chúng có thể tự tổng hợp được pantoic acid (pantotenic acid cấu tạo từ pantoic acid và  - alanine).

- Thông thường các chất được coi là yếu tố sinh trưởng đối với một loài nào đó có thể thuộc về một trong các loại sau đây: các gốc kiềm purine, pirimidine và các dẫn xuất của chúng, các acid béo và thành phần của màng tế bào, các vitamin thông thường...

1.5.2 Sự tăng trưởng của vi khuẩn

* Sinh trưởng của vi khuẩn trong nuôi tĩnh

Theo Biền Văn Minh và ctv. (2006) thì nuôi cấy tĩnh là phương pháp nuôi cấy mà trong suốt thời gian đó ta không thêm vào hay lấy đi bất kì chất gì vào trong môi trường nuôi cấy. Sự sinh trưởng của vi khuẩn trong “hệ kín” như vậy tuân theo những quy luật bắt buộc không những đối với các cơ thể đơn bào mà cả đối với các cơ thể đa bào.

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của logarit số lượng tế bào theo thời gian gọi là đường cong sinh trưởng:

Hình 2.1: Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn 0

12 10 8 6 4 GĐ chuẩ n bị GĐ tăng trưởng nhảy vọt GĐ ổn định Giai đoạn chết Log1 0 mật số

15

Theo Phạm Văn Kim (2000) thì trong một mẻ nuôi cấy thích hợp, vi khuẩn thường tăng trưởng theo 4 giai đoạn chính:

Giai đoạn chuẩn bị (latent phase): trong giai đoạn này, tức là ngay sau khi nuôi cấy, vi khuẩn chưa tăng mật số, có thể đây là giai đoạn vi sinh vật làm quen với môi trường nuôi cấy mới và chuẩn bị cho sự tăng trưởng vượt bậc sau đó.

Giai đoạn tăng trưởng nhảy vọt (logarithmic phase, exponential phase): ở giai đoạn này vi khuẩn bắt đầu nhân mật số lên với tốc độ rất nhanh theo cấp số nhân. Trong giai đoạn này mật số tổng cộng và mật số vi khuẩn sống không chênh lệch nhau nhiều vì trong giai đoạn này còn nhiều chất dinh dưỡng cung ứng đủ nhu cầu, nên số vi khuẩn chết chưa tăng cao.

Giai đoạn ổn định (stationary phase): đây là giai đoạn mà mật số vi sinh vật không tăng thêm mà giữ an định ở một mức. Lúc này mật số vi khuẩn chết có tăng nên mật số tổng cộng đã chênh lệch so với mật số vi sinh vật sống. Giai đoạn này có thể do vi khuẩn thu hút và làm cạn dần một vài thành phần dinh dưỡng hoặc là do tác động của vài chất đối kháng do chính vi khuẩn ấy tiết ra trong quá trình tăng trưởng.

Giai đoạn chết (death phase): mật số vi sinh vật sống giảm dần trong khi đó mật số vi khuẩn tổng cộng có hơi tăng nhẹ. Đây là giai đoạn trùng hợp vào lúc mà dưỡng chất trong môi trường bị hao mòn dần hoặc do sự tích lũy các chất đối kháng ngày càng nhiều.

* Sinh trưởng của vi khuẩn trong nuôi liên tục

Trong phương pháp nuôi cấy tĩnh, các điều kiện môi trường luôn luôn thay đổi theo thời gian, mật độ vi khuẩn tăng lên còn nồng độ cơ chất giảm xuống. Vi khuẩn phải sinh trưởng và phát triển theo một số giai đoạn nhất định, sinh khối đạt được không cao. Tuy nhiên trong nhiều nghiên cứu và thực tiễn sản xuất ta cần cung cấp cho vi sinh vật những điều kiện ổn định để trong một thời gian dài chúng vẫn có thể sinh trưởng trong giai đoạn tăng trưởng nhảy vọt (pha log). Trong một mức độ nào đó có thể cấy chuyền tế bào nhiều lần (qua những khoảng thời gian ngắn) vào môi trường dinh dưỡng mới. Nhưng đơn giản hơn, người ta đưa môi trường dinh dưỡng mới vào bình nuôi cấy vi khuẩn đồng thời loại khỏi bình một lượng tương ứng dịch vi khuẩn. Đây chính là cơ sở của phương pháp nuôi cấy liên tục trong chemostas và turbidostas (thiết bị nuôi cấy liên tục) (Biền Văn Minh và ctv., 2006).

1.5.3 Điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng đến sinh trưởng vi khuẩn

16

Tác dụng có hại của các yếu tố bên ngoài tế bào thể hiện chủ yếu ở những biến đổi sau đây (Biền Văn Minh và ctv., 2006):

Phá hủy thành tế bào: một số chất nhưenzyme lysozyme (chứa trong lá lách, bạch cầu, lòng trắng trứng, đuôi thực khuẩn thể...) có khả năng phân huỷ thành tế bào vi khuẩn dẫn đến tạo thành các nguyên lạp chủ yếu ở vi khuẩn Gram dương và các cầu lạp ở vi khuẩn Gram âm.

Biến đổi tính thấm của màng tế bào chất: một số chất không nhất thiết phải xâm nhập tế bào, nhưng vẫn gây tác dụng kháng khuẩn. Do tác dụng lên một hoặc một chức phận sinh lí của màng tế bào, chất này sẽ làm vi khuẩn mất khả năng sinh sản. Rất có thể, trong trường hợp như vậy, hàng rào thẩm thấu tồn tại trong màng tế bào chất đã bị hư hại.

Thay đổi đặc tính keo của nguyên sinh chất: các yếu tố vật lí cũng như hóa học đều có thể gây nên tác dụng này. Nhiệt độ cao làm biến tính protein và làm chúng đông tụ do nhiệt có thể làm mất nước tế bào vi sinh vật.

Kìm hãm hoạt tính: một số chất tác động vào các hệ thống sinh năng lượng của tế bào, cyanite kìm hãm cytochrome - oxydase, fluoride ngăn cản quá trình đường phân, các hợp chất hoá trị ba của arcsenic bao vây chu trình Krebs, dinitrophenol kìm hãm quá trình phosphoryl hoá oxy hóa.

Hủy hoại các quá trình tổng hợp: trong sự có mặt của một số chất tương tự về mặt cấu trúc với các chất trao đổi tự nhiên, gọi là các chất kháng sự trao đổi chất (antimetabolism), quá trình sinh tổng hợp có thể bị ức chế.

* Các nhân tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Yếu tố vật lý

Theo Biền Văn Minh và ctv. (2006) thì hầu hết tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật bị chết ở nhiệt độ cao do protein bị biến tính, một hoặc hàng loạt enzyme bị bất hoạt. Các enzyme hô hấp đặc biệt là các enzyme trong chu trình Krebs rất mẫn cảm với nhiệt độ. Sự chết của vi khuẩn ở nhiệt độ cao cũng có thể còn là hậu quả của sự bất hoạt hóa ARN và sự phá hoại màng tế bào chất. Còn khi nhiệt độ thấp sự tăng trưởng sẽ ngưng lại do tế bào chất từ dạng lỏng bị ngưng tụ lại làm quá trình trao đổi ion và hoạt động của enzyme trong tế bào bị đình chỉ, nên sự tăng trưởng của vi sinh vật bị ngừng lại. Khoảng nhiệt độ tối đa của nhóm vi khuẩn lam (cyanobacteria) là 70 – 74oC, vi khuẩn quang dưỡng kị khí (anoxygenicphototrophic bacteria) là 70 – 73oC và nhóm vi khuẩn hóa dưỡng hữu cơ (chemoorganotrophic bacteria) là 90oC (Madigan

17

Ngoài ra, các yếu tố áp suất, ánh sáng, âm thanh cũng có tác động không nhỏ đến việc sinh trưởng và sinh sản của vi khuẩn. Nếu các yếu tố này bất thuận thì mật số của mẻ nuôi cấy có thể bị ảnh hưởng (Phạm Văn Kim, 2000; Biền Văn Minh và ctv., 2006).

Yếu tố hóa học

Ảnh hưởng của pH môi trường: pH của môi trường có ý nghĩa quyết định đối với sinh trưởng của nhiều vi sinh vật. Các ion H+ và OH- là hai ion hoạt động cao nhất trong các các ion, những biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của chúng cũng có tác động mạnh mẽ. Cho nên việc xác định pH thích hợp ban đầu và duy trì pH cần thiết trong thời gian sinh trưởng của tế bào là rất quan trọng.

Các giá trị pH (cực tiểu, tối thích, cực đại) cần cho sinh trưởng và sinh sản của vi khuẩn tương ứng với các giá trị pH trung bình cần cho hoạt động của nhiều enzyme. Giới hạn pH hoạt động đối với vi sinh vật ở trong khoảng 4 - 10. Đa số vi khuẩn sinh trưởng tốt nhất ở pH trủng tính (7,0) như nhiều vi khuẩn gây bệnh (môi trường tự nhiên là máu và bạch huyết của cơ thể động vật có pH khoảng 7,4). Các vi khuẩn nitrate hóa, vi khuẩn nốt sần, xạ khuẩn, vi khuẩn phân giải urea lại ưa môi trường hơi kiềm. Một số vi khuẩn chịu acid (vi khuẩn lactic, Acetobacter, Sarcina ventriculi), một số khác ưa acid như

Acetobacter acidophilus, Thiobacillus thiooxydans (oxy hóa lưu huỳnh thành H2SO4) có thể sinh trưởng ở pH <1 (Biền Văn Minh và ctv., 2006). Trong quá trình đồng hóa của vi khuẩn thường tiết ra hay bazơ làm thay đổi pH của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng bất lợi đến sự phát triển của vi khuẩn. Do đó trong điều kiện nuôi cấy, chất đệm như K2HPO4, Na2HPO4 thưởng được bổ sung để giúp ổn định pH của môi trường (Madigan et al, 1997).

Oxygen cũng là yếu tố quan trọng cho sự phát triển của vi sinh vật, đây cũng là yếu tố để phân chia vi sinh vật thành vi sinh vật hiếu khí bắt buộc, hiếu khí không bắt buộc, vi hiếu khí và kỵ khí (Biền Văn Minh và ctv., 2006).

Yếu tố sinh học

Chất kháng sinh có thể có từ nhiều nguồn gốc khác nhau như tổng hợp hoá học, chiếc xuất từ thực vật, động vật nhưng chủ yếu là được tổng hợp từ vi sinh vật. Đây là các chất đặc hiệu mà ở nồng độ thấp cũng có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật một cách chọn lọc (Biền Văn Minh và ctv., 2006).

18

1.6 Sự thành lập và “nảy mầm” của nội bào tử vi khuẩn

Các loài vi khuẩn có khả năng hình thành nội bào tử thường thuộc các chi Bacillus, Clostridium, Sporolactobacillus, Thermoactinomyces, Sporosarcina, Desulfotomaculum,

Sự thành lập và đặc điểm cấu tạo của nội bào tử

Sự khởi tạo nội bào tử ở vi khuẩn được gợi bởi nhiều tác nhân liên quan đến các điều kiện sinh trưởng bất lợi, bao gồm sự tích tụ các nhân tố ức chế sinh dưỡng (Kim và Gadd, 2008, Moat et al, 2002). Nhiều nhân tố môi trường khác có ảnh hưởng trên sự hình thành nội bào tử được ghi nhận, như nhiệt độ sinh trưởng, pH môi trường, điều kiện thoáng khí, sự hiện diện của một số khoáng, nguồn carbon, nitrogen và phosphorus và nồng độ của chúng, nhưng hai nhân tố môi trường có vai trò đặc biệt quan trọng được xác định là sự thiếu hụt dưỡng chất và mật số quần thể (Logan and Halket, 2011). Tình trạng thiếu hụt dưỡng chất, đặc biệt khi nguồn carbon hoặc nitrogen đầy đủ, là tác nhân kích thích tế bào sinh dưỡng chuyển sang dạng nội bào tử.

Sự tạo nội bào tử dễ dàng hơn khi mật số vi khuẩn cao và điều kiện là tế bào vi khuẩn phải ở một giai đoạn nào đó của chu trình sinh trưởng (Moat et al, 2002). Ở hầu hết các loài, tiến trình từ khi tế bào sinh dưỡng nhận biết điều kiện kích thích, cần thời gian 6-8 giờ (Cowan, 2013). Thởi gian để hình thành nội bào tử từ tế bào sinh dưỡng cần khoảng 10 giờ ở loài Bacillus megaterium

(Willey et al, 2011).

Sự hình thành nội bào tử là kết quả của tiến trình điều hòa phức tạp, trải qua nhiều giai đoạn, bao gồm sự dẫn truyền các tín hiệu từ môi trường và các nhân tố sinh lý và được điều khiển bởi một loạt phospho transfer (phosphorelay), giúp hoạt hóa các gen liên quan đến việc tạo nội bào tử và ức chế các gen liên quan đến tăng trưởng sinh dưỡng (Kim và Gadd, 2008, Moat

et al, 2002). Sự hình thành nội bào tử bắt đầu từ sự phân chia bất đối xứng tế bào thành 2 phần không bằng nhau (phần nhỏ hơn được gọi là prespore và phần lớn được gọi là tế bào mẹ). Sau đó, tế bào mẹ sử dụng tất cả các nguồn chất dinh dưỡng và thành phần của tế bào mẹ để hình thành lớp vỏ rắn chắc có thể bảo vệ prespore, do đó tối đa hóa cơ hội sống sót cho các nội bào tử trưởng thành (Errington, 2003).

- Đặc điểm cấu tạo của nội bào tử:

Cấu trúc của nội bào tử gồm nhiều lớp màng bao bọc, tính không thấm của các lớp màng nên các chất hóa học, chất sát trùng khó tác động.

19

Thành phần hóa học của nội bào tử gồm: Các lớp bao và màng của nội bào tử cấu tạo bởi protein, gồm nhiều amin chứa lưu huỳnh như: glyxin, tirozin, xistin, ngoài ra còn có keratin. Cấu tạo của nội bào tử có liên quan đến sức chống chịu với sự tác động của điều kiện ngoại cảnh của nội bào tử (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 1979; Nguyễn Xuân Thành và ctv., 2006):

Nước phần lớn ở trạng thái liên kết nên không có khả năng làm biến tính protein khi tăng nhiệt độ. Trong bào tử có chứa ion Ca2+ và dipicolinit acid, các protein sẽ kết hợp với dipicolinat calcium tạo thành phức chất có tính ổn định cao với nhiệt độ. Các enzyme ở trạng thái không hoạt động nên hạn chế được sự trao đổi chất của nội bào tử với môi trường ngoài. Sự có mặt của các amin chứa lưu huỳnh giúp nội bào tử đề kháng mạnh với tia cực tím.

- Sự “nẩy mầm” của nội bào tử:

Thời gian vi khuẩn tồn tại bất hoạt dưới dạng nội bào tử thường rất lâu, cho đến khi điều kiện môi trường thuận lợi hơn cho sự tăng trưởng như có đủ nước và có tác nhân kích thích hóa học hay môi trường giúp nảy mầm, khi đó nội bào tử trải qua tiến trình chuyển thành tế bào sinh dưỡng (Cowan, 2013). Kết quả của tiến trình này là lớp vỏ bào tử bị phá và n65i bào tử vi khuẩn được chuyển thành dạng tế bào sinh dưỡng để tăng trưởng và sinh sản bình thường (Nguyễn Như Hiền, 2005).

Sự chuyển thành tế bào sinh dưỡng từ nội bào tử thường gồm 3 giai đoạn chính: hoạt hóa, nảy mầm và tăng sinh, trong đó nếu không có tác động hoạt hóa nội bào tử có thể không hoạt động, ngay cả khi dinh dưỡng đầy đủ. (Willey et al, 2011). Tiến trình hoạt hóa, chuẩn bị cho nội bào tử nảy mầm, thường có liên quan đến vai trò tác động của nhiệt. Các khảo sát về ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự chuyển hóa từ nội bào tử thành tế bào sinh dưỡng, cho thấy nhiệt độ kích hoạt thường là 65oC trong 45 phút, 34oC trong 48 giờ và sự hoạt hóa nầy là thuận nghịch. Ở nhiệt độ 30oC sự hoạt hoá nội bào tử nảy mầm cũng được ghi nhận và trong thực tế nhiệt độ nầy dễ dàng xảy ra trong đất hoặc đống chất hữu cơ đang phân hũy (Keynan et al. 1964).

Trong tự nhiên, nội bào tử nảy mầm có lẻ chỉ do phản ứng với chất dinh dưỡng, thường là các amino acid, đường hoặc purine nucleoside, riêng rẻ hay kết hợp, như kết hợp của asparagine, glucose, fructose and K+ (AGFK) gợi sự nảy mầm của nội bào tử B. subtilis, giai đoạn gợi nầy chỉ xảy ra trong vòng vài giây, và tiến trình tiếp tục ngay cả khi đã loại bỏ tác nhân khởi phát.Các bước