Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi lên thời gian lưu tồn trong chế phẩm dạng bột của chủng vi khuẩn PGPR1

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.2.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi lên thời gian lưu tồn trong chế phẩm dạng bột của chủng vi khuẩn PGPR1

2.2.2.1 Thí nghiệm 2.1: Đánh giá ảnh hưởng của thời gian tồn trữ trên sức sống của chủng vi khuẩn PGPR1 trong chế phẩm.

* Mục tiêu: Đánh giá thời gian lưu tồn của vi khuẩn vùng rễ trong chế phẩm dạng bột được nhân mật số bằng môi trường đã được chọn ở thí nghiệm 1.

2.2.2.1.1 Chuẩn bị

- Chuẩn bị hỗn hợp bột làm chế phẩm.

- Môi trường nuôi nhân vi khuẩn (chọn từ TN1).

- Môi trường King’s B agar để lấy chỉ tiêu.

2.2.2.1.2 Tiến hành

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 nghiệm thức (3 loại chế phẩm với các tỷ lệ nội bào tử khác nhau), 4 lần lặp lại.

- Làm chế phẩm:

+2000 ml huyền phù PGPR1.

+ 2 kg bột talc (khử trùng ở 105oC trong 12 giờ).

+ 15 g calcium carbonate (để đạt pH trung tính).

Hình 2.2: Máy lắc nuôi vi khuẩn ở 150 vòng/phút với các nghiệm thức khác nhau.

29

+ 10 g carboxymethyl cellulose (CMC) (chất bám dính).

Huyền phù vi khuẩn được trộn đều với hổn hợp bột (chuẩn bị trước) bằng máy trộn tự chế, trong điều kiện vô trùng, theo phương pháp được mô tả bởi Vidhyasekaran and Muthuamilan (1995); Bharathi et al, (2004) với chất nền là bột talc vi khuẩn được nhân trong môi trường đã chọn.

Các chế phẩm chuẩn bị xong cho vào các bọc polime, buộc kính miệng để tránh nhiễm các vi sinh vật khác.

2.2.2.1.3 Chỉ tiờu theo dừi

- Mật số vi khuẩn sống trong chế phẩm theo thời gian (1 tháng/ lần) cho đến 3 tháng sau thí nghiệm (STN).

- Cách xác định: Sử dụng phương pháp pha loãng huyền phù vi khuẩn.

Hòa 0,1 gam chế phẩm vào 10 ml nước cất vô trùng trong ống nghiệm, lắc đều, hút 10 μl chà lên đĩa petri chứa môi trường King’s B, 1 đĩa / lặp lại, rồi ủ trong tủ định ôn, sau 48 giờ, đếm số khuẩn lạc, tính ra mật số vi khuẩn

2.2.2.2 Thí nghiệm 2.2: Khảo sát hiệu quả đối kháng của chế phẩm đối với nấm F. oxysporum, nấm S. rolfsii và vi khuẩn R. solanacearum.

* Mục tiêu: Đánh giá hiệu quả đối kháng của chủng vi khuẩn PGPR1 trong chế phẩm dạng bột được nhân mật số bằng môi trường khác nhau đối với vi khuẩn R. solanacearum, nấm F. oxysporum, nấm S. rolfsii sau tồn trữ

2.2.2.2.1 Khảo sát hiệu quả đối khángcủa chế phẩm đối với nấm Fusarium oxysporum và nấm Sclerotium rolfsii.

Thí nghiệm thực hiện trong đĩa petri, bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lần lặp lại, với 3 nghiệm thức (chế phẩm với tỷ lệ 5%, 50% và 100% nội bào tử).

* Chuẩn bị

- Nấm Sclerotium rolfsii và Fusarium oxysporum nuôi trên môi trường PDA trong 4 ngày, khoanh khuẩn ty lấy từ rìa khuẩn lạc khi thử đối kháng .

- Chuẩn bị các ống nghiệm nước cất vô trùng (mỗi ống 10ml)

- Chế phẩm với các tỷ lệ nội bào tử khác nhau được pha loãng tạo thành dung dịch huyền phù vi khuẩn.

-Khoanh giấy thấm được thanh trùng bằng tủ sấy.

* Cách tiến hành

Thực hiện theo phương pháp của Rajkumaret al,(2005), với môi trường PDA. Khoanh khuẩn ty (ứ= 5 mm) nấm S. rolfsii hoặc F. oxysporum được cấy ở tâm và 1 khoanh giấy làm đối chứng, 1 ngày sau cấy 3 khoanh giấy thấm có

30

tẩm huyền phù ứng với từng nghiệm thức lên môi trường trong đĩa petri, cách khoanh khuẩn ty 3 cm. Các đĩa sau đó được giữ trong tủ định ổn ở 300C

Hình 2.3: Sơ đồ thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm đối với nấm Sclerotium rolfsiivà Fusarium oxysporum.

2.2.2.2.2 Khảo sát hiệu quả đối kháng của chế phẩm đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum

* Chuẩn bị

- Vi khuẩn Ralstonia solanacearum được nhân mật số trong môi trường King’s B lỏng trên máy lắc ngang (150 vòng/phút) trong 48 giờ.

- Chế phẩm với các tỷ lệ nội bào tử khác nhau được pha loãng tạo thành dung dịch huyền phù vi khuẩn.

* Cách tiến hành

- Thí nghiệm tiến hành trong đĩa petri chứa môi truờng King’s B agar, 4 lần lặp lại, bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố, ba nghiệm thức tương ứng với chế phẩm PGPR1 với tỷ lệ nội bào tử 5%, 50% và 100% nội bào tử.

- Thí nghiệm đuợc thực hiện theo phương pháp khuyếch tán có đục lỗ, (agar well diffusion assay) mô tả bởi Lemessa and Zeller (2007)

+ Chà 100 àl huyền phự R. solanacearum trờn mụi trường King’s B agar trong đĩa petri.

+ Tạo 4 lỗ (d=5 mm) ở 5 điểm cách đều nhau trên môi trường (khoảng cỏch 3cm), rồi cho vào mỗi lỗ 25 àl huyền phự ứng với từng nghiệm thức.

- Các đĩa được giữ trong tủ định ổn với nhiệt độ 30oC

3cm

Sclerotium sp.

hoặc Fusarium sp.

Khoanh giấy đối chứng

Khoanh giấy tẩm huyền phù các loại chế phẩm

100%

50%

5%

31

Hình 2.4: Sơ đồ thử nghiệm hiệu quả của các loại chế phẩm đối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum .

2.2.2.2.3 Chỉ tiờu theo dừi

- Xác định hiệu quả đối kháng của chủng vi khuẩn PGPR1 đối với các tác nhân gây bệnh thử nghiệm, 1 tháng / lần, cho đến 3 tháng sau khi tồn trữ.

Riêng lần lấy chỉ tiêu đầu tiên thì mật số được xác định cho từng nghiệm thức, và chỉnh cho mật số của các nghiệm thức bằng nhau (108 CFU/ml) trước khi thử đối kháng. Các lần còn lại đều lấy 1g chế phẩm cho vào 9 ml nước cất thanh trùng lắc trong 15 phút và tiến hành thử.

- Chỉ tiêu ghi nhận :

 Bán kính vành khăn vùng nấm gây bệnh bị ức chế

Đo và tính hiệu của bán kính khuẩn ty nấm về phía đối chứng với bán kính khuẩn ty nấm về phía chế phẩm.

 Hiệu suất đối kháng đối với nấm:

Đo bán kính khuẩn lạc nấm về phía đối chứng hoặc về phía chế phẩm, trên đường nối tâm của khuẩn lạc với khoanh giấy tẩm huyền phù chế phẩm.

Hiệu suất đối kháng được tính theo công thức:

100

(%)  

 BKKLđK BKKLvk BKKLđK

AE

Ghi chú: AE: hiệu suất đối kháng, BKKLđc: bán kính kính khuẩn lạc về phía đối chứng, BKKLvk: bán kính khuẩn lạc về phía vi khuẩn

Lỗ đục đối chứng

Huyền phù các loại chế phẩm 100%

50%

5%

3cm

32

Mức độ đối kháng được đánh giá theo thang đánh giá của Soytong (1988) (Trần Thị Thúy Ái, 2011)

++++ = đối kháng rất cao (>75%) +++ = đối kháng cao (61-75%) ++ = đối kháng trung bình (51-60%) + = đối kháng thấp (<50%)

- = không đối kháng

 Khảo sát hiệu quả đối kháng đối với vi khuẩn:

Ðo bán kính vùng vi khuẩn gây bệnh bị ức chế bởi vi khuẩn đối kháng theo hai đường thẳng vuông gốc tại tâm khuẩn lạc vi khuẩn vùng rễ theo thời gian (1ngày/lần) đến khi vùng vi khuẩn gây bệnh bị ức chế bị giảm.

- Chỉ tiêu được thu vào 1, 3, 5, 7 NSTN đối với nấm F. oxysporum và 1, 2, 3, 4, 5 ngày sau thí nghiệm (NSTN) đối với nấm S. rolfsii hoặc vi khuẩn R.

solanacearum;