3.1 Ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy khác nhau lên sự phát triển mật số và hình thành nội bào tử của chủng vi khuẩn PGPR1
3.1.2 Tỉ lệ nội bào tử/tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn PGPR1 diễn biến theo thời gian
Kết quả ở bảng 3.3, cho thấy tỷ lệ nội bào tử giữa các nghiệm thức môi trường nuôi có khác biệt ở mức ý nghĩa 1% qua tất cả các thời điểm khảo sát.
Ở thời điểm 1 NSKN, tỷ lệ nội bào tử ở nghiệm thức khoai mì là cao nhất với tỷ lệ 11,30%, khác biệt ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại. Qua đó cho thấy, có thể đây là môi trường thích hợp để nuôi cấy tạo nội bào tử đối với chủng vi khuẩn PGPR1.
Ở thời điểm 2 NSKN, tỷ lệ nội bào tử của vi khuẩn PGPR1 ở các nghiệm thức đều tăng, tuy nhiên cao nhất vẫn là ở nghiệm thức khoai mì (33,93%) và dịch trích khoai mì (32,35%), và khác biệt ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại. Tỷ lệ thấp nhất ở giai đoạn này là ở nghiệm thức dịch trích bã đậu nành (0,89%).
Ở thời điểm 3 NSKN, nghiệm thức khoai mì có tỷ lệ nội bào tử là 70,65%, không khác biệt ý nghĩa so với nghiệm thức dịch trích khoai mì
38
(67,18%) và nghiệm thức khoai tây (67,54%); nhưng khác biệt ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại.
Đến 4 NSKN, tỷ lệ nội bào tử ở các nghiệm thức khoai mì, dịch trích khoai mì đã tăng cao đạt 96,15 - 96,62%. Nghiệm thức dịch trích khoai tây cũng có tỷ lệ NBT là 92,75%, tương đương với hai nghiệm thức khoai mì, nhưng không khác biệt ý nghĩa so với nghiệm thức khoai tây.
Vào thời điểm 5 NSKN, nghiệm thức dịch trích khoai tây, nghiệm thức dịch trích khoai mì, nghiệm thức khoai tây, nghiệm thức khoai mì có tỷ lệ nội bào tử cao nhất và khác biệt ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại.
Vào thời điểm 6 NSKN, các nghiệm thức dịch trích khoai tây, nghiệm thức dịch trích khoai mì, nghiệm thức khoai tây, nghiệm thức khoai mì đều cho tỷ lệ nội bào tử ở mức tối đa là 100% khác biệt ý nghĩa so với nghiệm thức dịch trích khoai lang, dịch trích bã đậu nành, nghiệm thức khoai lang và nghiệm thức đối chứng King's B. Kết hợp với Bảng 3.1 ta thấy, sự tạo nội bào tử dễ dàng hơn khi mật số vi khuẩn cao và điều kiện là tế bào vi khuẩn phải ở một giai đoạn nào đó của chu trình sinh trưởng (Moat et al, 2002).
Bảng 3.3: Tỉ lệ nội bào tử/ tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn PGPR1 ở các nghiệm thức môi trường nuôi cấy khác nhau qua các thời điểm khảo sát
Nghiệm thức
Tỉ lệ NBT/TBSD (%) Thời gian khảo sát (NSKN)
1 2 3 4 5 6
DT khoai tây 8,06c 27,31c 66,45 b 92,75ab 97,72a 100,0a DT khoai mì 9,58b 32,35a 67,18ab 96,15a 98,90a 100,0a DT khoai lang 1,18e 7,35d 18,42 cd 39,02c 65,10 b 70,03c DT bã đậu
nành 0,19e 0,89 f 3,58 e 7,70e 13,10 d 19,22e Khoai tây 6,80 d 29,31 b 67,54ab 88,85 b 98,10a 100,0a Khoai mì 11,30 a 33,93a 70,65a 96,62a 99,57a 100,0a Khoai lang 1,28e 6,92 d 19,62c 39,90c 64,52 b 78,56 b King’s B (ĐC) 1,00e 4,99e 14,72 d 26,52d 47,71c 56,94d
CV (%) 15,93 6,78 6,49 6,86 2,38 2,97
Ý nghĩa F tính ** ** ** ** ** **
Ghi chú: - Các trung bình trong cùng một cột được theo sau bởi một hay những chữ cái giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê trong phép thử Duncan’s
- **: khác biệt ở mức ý nghĩa 1%,NSKN: Ngày sau khi nuôi, DT: dịch trích - Số liệu mật số vi khuẩn được chuyển sang Log10 khi phân tích thống kê.
39
Kết quả ở Bảng 3.3 cũng cho thấy rằng môi trường dịch trích bã đậu nành không thể sử dụng để nuôi cấy PGPR1 nhằm thu nội bào tử vì đến 6 NSKN, chỉ cho tỷ lệ nội bào tử thấp nhất (19,22%), trong khi hầu hết các nghiệm thức đều cho tỷ lệ nội bào tử rất cao, thậm chí 100%
Xét về diễn biến theo thời gian nuôi của tỉ lệ nội bào tử/tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn PGPR1 ở các nghiệm thức môi trường nuôi cấy khác nhau (Bảng 3.4), có thể thấy tất cả các nghiệm thức đều xuất hiện nội bào tử và tỷ lệ NBT/TBSD đều tăng dần theo thời gian nuôi, và đến ngày thứ 6 SKN đã có bốn loại môi trường cho tỷ lệ này là 100%, khác biệt ý nghĩa so với các thời điểm nuôi cấy khác, trừ các nghiệm thức dịch trích khoai lang,dịch trích bã đậu nành, khoai lang, King's B có tỷ lệ nội bào tử không đạt 100%.
Ở nghiệm thức dịch trích khoai lang, nghiệm thức King's B và nghiệm thức dịch trích bã đậu nành thì tỷ lệ NBT/TBSD ở thời điểm 1 NSKN là rất thấp, biến động trong khoảng 0,19% (DT bã đậu nành) đến 1,18% (dịch trích khoai lang). Có thể ở thời điểm này, trong môi trường nuôi cấy vẫn còn đầy đủ dinh dưỡng nên vi khuẩn chỉ tạo nội bào tử với tỷ lệ còn thấp, kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Trần Văn Nhã (2009) .
Vào thời điểm 4 NSKN, các nghiệm thức dịch trích khoai tây, nghiệm thức dịch trích khoai mì, nghiệm thức khoai tây, nghiệm thức khoai mì có tỷ lệ NBT/TBSD đạt trên 75%, riêng nghiệm thức khoai mì, vào thời điểm này đã đạt đến 96,62% .
Đến 5 NSKN, các nghiệm thức có khoai mì đã có tỷ lệ NBT/TBSD đạt 97,72-99,57% khác biệt ý nghĩa so với các thời điểm trước đó.
Hình 4.2: Nội bào tử (A) và mật số vi khuẩn của vi khuẩn PGPR1(B) ở tỷ lệ nội bào tử 100% của môi trường khoai mì vào thời điểm 6 NSTN.
A B
40
Đến ngày thứ 6 SKN thì tỷ lệ NBT/TBSD của nghiệm thức dịch trích khoai lang là 70,03% và nghiệm thức King's B là 56,94%, còn ở nghiệm thức dịch trích bã đậu nành chỉ là 19,22%. Nghiệm thức khoai lang sau 6 ngày nuôi cấy NBT/TBSD chỉ đạt 78,56%.
Bảng 3.4: Tỉ lệ nội bào tử/tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn PGPR1 ở các nghiệm thức môi trường nuôi cấy khác nhau qua thời điểm quan sát
Thời gian (ngày)
Tỷ lệ NBT/TBSD (%) DT
khoai tây
DT khoai
mì
DT khoai
lang
DT bã đậu nành
Khoai tây
Khoai mì
Khoai lang
King’s B 1 8,06 f 9,58 e 1,18 f 0,19e 6,80 e 11,30 e 1,28 f 1,00f 2 27,31 e 32,35 d 7,35 e 0,89e 29,31 d 33,93 d 6,92 e 4,99e 3 66,45d 67,18 c 18,42d 3,58 d 67,54 c 70,65c 19,62d 14,72d 4 92,75c 96,15b 39,02c 7,70 c 88,85b 96,62b 39,90c 26,52c 5 97,72b 98,90 a 65,10b 13,10 b 98,10 a 99,57 a 64,52b 47,71b 6 100,0 a 100,0 a 70,03 a 19,22 a 100,0 a 100,0 a 78,56 a 56,94 a
CV (%) 3,20 1,79 5,53 11,49 7,47 2,49 7,82 6,48
Ý nghĩa F tính
** ** ** ** ** ** ** **
Ghi chú: - Các trung bình trong cùng một cột được theo sau bởi một hay những chữ cái giốngnhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê trong phép thử Duncan’s,
- **khác biệt ở mức ý nghĩa 1%; NSKN: Ngày sau khi nuôi, DT: dịch trích Mật số vi khuẩn được chuyển sang Log10 khi phân tích thống kê
Như vậy, so với các loại môi trường nuôi cấy khác, môi trường có nguyên liệu là khoai mì (nghiệm thức dịch trích khoai mì, nghiệm thức khoai mì ) có ưu thế trong làm gia tăng nhanh tạo nội bào tử ở chủng PGPR1 và là môi trường có triển vọng để nuôi tạo nội bào tử ở chủng vi khuẩn PGPR1. Có thể do khoai mì có hàm lượng tinh bột khá cao 16 – 32% (Hoàng Kim Anh và ctv.,2004) và theo kết quả nghiên cứu của Trần Thị Ái Luyến (2011), bột khoai mì thô có tác dụng kích thích khả năng sinh tổng hợp amylase của chủng vi khuẩn PGPR1 mà α-amylase là một enzyme xúc tác phản ứng thủy phân liên kết alpha của các polysaccharides lớn như tinh bột và glycogen, tạo glucose và maltose (Mauren Barlow Pugh, 2000). Theo Cheong (2006), đường glucose là thích hợp nhất cho việc nuôi tăng sinh khối Bacillus subtilis và nếu duy trì glucose trong môi trường nuôi ở 0,2 g/L thì mật độ vi khuẩn đạt 3,5ì1010 CFU/mL vào cuối chu kỳ nuụi , do đú trong mụi trường khoai mỡ thỡ
41
mật số vi khuẩn PGPR1 luôn cao hơn so với các môi trường còn lại; khi đó, thì dinh dưỡng trong môi trường sẽ mau chóng cạn kiệt nên vi khuẩn bắt đầu đi vào giai đoạn tiềm sinh nên tỷ lệ nội bào tử bắt đầu tăng nhanh (Biền Văn Minh và ctv.,2006). Theo Logan and Halket (2011), sự thiếu hụt dưỡng chất, đặc biệt khi nguồn carbon hoặc nitrogen đầy đủ, và mật số quần thể cao là tác nhân kích thích tế bào sinh dưỡng chuyển sang dạng nội bào tử. Mặt khác, tế bào vi khuẩn cũng phải ở một giai đoạn nào đó của chu trình sinh trưởng (Moat et al., 2002)
Hình 3.3: Tủ sấy chế phẩm trước (A) và sau (B) khi đưa chế phẩm vào sấy.
A
B
42
3.2 Hiệu quả đối kháng của chế phẩm đối với nấm F. oxysporum, S. rolfsii và vi khuẩn R. solanacearum.