CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.8 Một số kết quả nghiên cứu về môi trường nhân nuôi vi khuẩn và tồn trữ vi khuẩn
1.8.1 Những kết quả nghiên cứu về môi trường nhân nuôi vi khuẩn Những nghiên cứu về nhân nuôi vi khuẩn bắt đầu từ rất sớm, King et al,(1954) đã sử dụng môi trường King’s B để nhân nuôi vi khuẩn P.
fluorescens trong glycerol 30% và trữ ở -800C. Khi tiến hành nhân nuôi vi khuẩn P. fluorescens trong King’s B lỏng trên máy lắc Infors AG với tần số lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng sau 48 giờ mật số vi khuẩn đạt được khoảng 9 x 108 CFU/ml, vi khuẩn sẽ tăng trưởng tốt khi có bổ sung thêm rifampicin (190 μgml), penicilin (100 μgml) và streptomicin (30 μgml) mà ở nồng độ này sẽ ức chế vi sinh vật khác phát triển (Vidhyasekaran et al,1997).
Theo Bharathi et al.(2004) thì dịch trích từ hạt cây neem và hợp chất chitin (dưới dạng colloidal chitin) có tác dụng làm tăng mật số 2 chủng PGPR trong môi trường nuôi cấy. Neem và chitin sau khi pha chế được cho vào môi trường nuôi cấy trước khi thanh trùng theo tỉ lệ 1% (V/V).
Nguyễn Thị Thu Nga (2003) đã thử nghiệm dịch trích đậu nành với các liều lượng khác nhau trong chất nền có chứa saccharose, kết quả ghi nhận được ở môi trường dịch trích đậu nành với liều lượng 150 g/lít cho hiệu quả cao hơn các nghiệm thức khác và khi chọn môi trường này cũng với liều lượng
22
150 g/lít và thử nghiệm bổ sung sucrose với các liều lượng khác nhau thì tác giả đi đến kết luận việc bổ sung sucrose không có hiệu quả làm gia tăng mật số vi khuẩn trên máy lắc ngang. Cũng nghiên cứu về vi khuẩn TG17 thì Nguyễn Đắc Khoa và ctv., (2002) đã sử dụng dịch trích đậu nành với liều lượng 150 g/lít để sản xuất vi khuẩn bằng nồi lên men tự chế, sau 72 giờ thì thu được 7 lít huyền phù vi khuẩn có mật số là 6 x 109 CFU/ml. Tuy nhiên, cách nhân nuôi này lại gặp nhược điểm lớn là môi trường đậu nành dễ bị trào ra trong quá trình nhân nuôi do đó rất dễ bị nhiễm, để khắc phục hiện tượng này cũng nhân nuôi bằng nồi lên men tự chế nhưng Nguyễn Thị Thu Nga (2003) đã sử dụng môi trường cám với các liều lượng khác nhau để thử nghiệm, kết quả ghi nhận được môi trường cám với liều lượng 40 g/lít cho mật số vi khuẩn cao nhất và không bị trào ra trong quá trình nhân nuôi do đó không bị nhiễm. Nhân nuôi bằng các loại môi trường trên chưa cho được mật số vi khuẩn cao nên Dương Thị Nguyễn Quyên (2004) tiến hành nhân nuôi vi khuẩn TG17 với 3 loại môi trường: dịch trích cám (40 g/lít), dịch trích đậu nành (150 g/lít), cùng với môi trường kết hợp (cám hòa với đậu nành theo tỉ lệ 9:1), kết quả ghi nhận được môi trường kết hợp là tốt nhất để nhân nuôi vi khuẩn TG17 trên máy lắc ngang (tần số 150 lần/phút ở điều kiện nhiệt độ phòng), vi khuẩn đạt mật số cao trong khoảng từ 48 – 96 giờ sau khi nhân nuôi, lúc 72 giờ đạt mật số cao nhất là 2,3 x 1010 CFU/ml. Dương Thị Nguyễn Quyên (2007) đã thử nghiệm bổ sung thêm PVP vào môi trường nhân nuôi, kết quả là bổ sung PVP ở nồng ðộ 2% có thể nhân mật số ðạt 1,2 x 1010 và rút ngắn thời gian nhân nuôi xuống còn 60 giờ.
1.8.2 Những kết quả nghiên cứu về tồn trữ vi khuẩn
Vidhyasekaran và Muthamilan (1995) nghiên cứu 6 loại chất mang khác nhau gồm: than bùn, phân xanh, talc, chất khoáng bón cây, kaolinite và lignite trong việc tồn trữ vi khuẩn, có bổ sung thêm 10 g CMC (chất giúp bám dính) và CaCO3 (giúp điều chỉnh pH về 7), các chất này được trộn đều và thanh trùng trong 2 ngày, huyền phù vi khuẩn có mật số 9 x 108 CFU/ml được nhân trước 48 giờ trên máy lắc ngang (tần số 150 vòng/phút), sau đó trộn đều với hỗn hợp ở trên trong điều kiện vô trùng (400 ml huyền phù trộn cho 1 kg giá thể) sau đó cho vào bọc PE, hàn kín và để trong điều kiện phòng. Kết quả cho thấy công thức tồn trữ với bột talc có thể duy trì mật số vi khuẩn còn khoảng 1,3 x 107 CFU/ml ở 240 ngày sau khi trộn.
Trong nghiên cứu của Bharathi et al,(2004), đã sử dụng 400 ml huyền phù vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có mật số 9 x 108 CFU/ml trộn đều với 1 kg bột talc (thanh trùng ở 105oC trong 12 giờ) có bổ sung 10 g CMC (chất bám dính), 15 g CaCO3 (điều chỉnh pH) trong điều kiện vô trùng. Sản
23
phẩm được sấy khô trong mát để giảm độ ẩm (độ ẩm < 20%) rồi cho vào bọc PE và hàn kín. Hiện nay, có một số nhà khoa học đã thành công khi sử dụng bột talc để tồn trữ vi khuẩn Pseudomonas (Vivekananthan et al,2004;Co mmare et al,2002).
Kanjanamaneesathian et al. (1998) đã nghiên cứu phát triển các chế phẩm của vi khuẩn đối kháng theo phương pháp tạp hạt ướt, thành phần chính trong công thức này là tế bào vi khuẩn, dầu thực vật đã được hydrate hóa, monohyrate lactose, polyvinyl pyrrolidone, sodium carboxymethyl cellulose, kết quả cho thấy mật số vi khuẩn còn 107-108 CFU/g và vẫn có hiệu quả tốt đối với bệnh đốm vằn trên lúa tương tự như khi xử lý với huyền phù vi khuẩn mới nuôi nhân.
Bora et al,(2004) cũng nghiên cứu về khả năng sống sót của vi khuẩn, huyền phù vi khuẩn P. putida sau khi được nhân mật số trong môi trường King’s B, được ly tâm khoảng 20 phút với tốc độ 6250 vòng/phút. Dạng viên thu được hòa vào MgSO4 0,1 M theo tỉ lệ 1:1 (trọng lượng/thể tích), sau đó được trộn tiếp với glycerol 10% (1 thể tích/1 thể tích), rồi tồn trữ.
Dương Thị Nguyễn Quyên (2004) đã thử nghiệm tồn trữ vi khuẩn TG17 trên một số loại giá thể, kết quả ghi nhận trên giá thể đậu nành xay chỉ có thể bảo quản vi khuẩn trong 15 ngày, trên giá thể trấu không thêm chất nền agar thì có thể bảo quản được đến 45 ngày, riêng đối với giá thể cùi bắp xay khi thêm agar ở nồng độ 0,005% có tác dụng kéo dài thời gian bảo quản vi khuẩn đối kháng B. cepacia TG17 lên đến 60 ngày.
Tiếp tục theo dừi thời gian tồn trữ của B. cepacia TG17 trong giỏ thể cựi bắp xay, có bổ sung thêm 0,05% agar, Dương Thị Nguyễn Quyên (2007) ghi nhận chế phẩm có thể bảo quản được đến 150 ngày sau khi cấy, tuy nhiên . việc bổ sung thêm PVP (polyvinyl pirrolidone) và CMC (carboxymethyl cellulose) thì không ảnh hưởng đến tỉ lệ sống sót của TG17 trong chế phẩm ở dạng bột, theo thời gian tồn trữ.
24