TOÀN VĂN Định lượng thành phần bioflavonoid trong lá chè xanh ở bảo lộc và nghiên cứu thành phần triterpenoid trong lá chè đắng cao bằng việt nam

Việc nghiên cứu về chất lượng của chè, nhất là các hợp chất bioflavonoid epicatechin, epigallocatechin, epigallocatechin gallate, epicatechin gallate có trong chè là mối quan tâm hàng đầ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

_

TRƯƠNG THỊ HUỲNH HOA

ĐỊNH LƯỢNG THÀNH PHẦN BIOFLAVONOID TRONG LÁ CHÈØ XANH Ở BẢO LỘC VÀ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN TRITERPENOID TRONG LÁ CHÈØ ĐẮNG CAO BẰNG - VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa lý thuyết và Hóa lý

Mã số: 1.04.04

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 GS TS CHU PHẠM NGỌC SƠN

2 GS TS POUL ERIK HANSEN

LỜI MỞ ĐẦU

Đất nước Việt Nam mến yêu của chúng ta được thiên nhiên ưu đãi rừng vàng, biển bạc Nguồn thực vật phong phú đó vừa dùng làm thực phẩm, vừa là

nguồn dược liệu có giá trị cao Trong đó có cây chè (Camellia sinensis) được

trồng trãi dài từ miền trung du Bắc bộ đến vùng cao nguyên Nam bộ

Ở miền Nam, điều kiện môi trường khí hậu, thổ nhưỡng của vùng cao nguyên Bảo Lộc (tỉnh Lâm Đồng) rất thuận lợi cho sự phát triển của loại cây công nghiệp là cây chè Việc nghiên cứu về chất lượng của chè, nhất là các hợp chất bioflavonoid (epicatechin, epigallocatechin, epigallocatechin gallate, epicatechin gallate) có trong chè là mối quan tâm hàng đầu, không chỉ của các nước nhập khẩu chè như Mỹ, Nhật, Đài Loan, mà còn là vấn đề lớn cho cây chè vùng cao nguyên Bảo Lộc Muốn tăng sản lượng xuất khẩu chè ra thị trường nước ngoài thì phải chú trọng cả về sản lượng và chất lượng các giống chè

Hiện nay, ngành Y – Dược đang có nhu cầu muốn ly trích các bioflavonoid trong cây chè để làm thuốc Vì thế vấn đề đối với cao nguyên Nam bộ là trong các giống chè đang trồng phổ biến (PH1, LD97, TB14 và TB18) thì nên chọn giống và thu hoạch lá chè vào thời điểm nào để có hàm lượng bioflavonoid cao nhất

Xuất phát từ những nhu cầu thực tiễn và phương hướng phát triển từ năm 1999 – 2010 của tỉnh Lâm Đồng, luận án này góp phần vào việc nghiên cứu định lượng các hợp chất bioflavonoid, trong đó chú trọng nhiều đến việc phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ một tứ cực các hợp chất gallic acid, catechin, epicatechin, epigallocatechin, epigallocatechin gallate, epicatechin gallate trong các giống chè đang trồng phổ biến tại tỉnh Lâm Đồng là PH1, LD97, TB14 và TB18

Hiện nay, còn có cây chè đắng (Cao Bằng – Ilex kaushue S Y Hu) cũng được

chế thành một loại thức uống có tính trị liệu ngày càng phổ biến trong nước

Ở các nước đã có nhiều nghiên cứu về các cây thuộc chi Ilex và người ta đã cô

lập được nhiều hợp chất mới, đóng góp vào kho tàng hóa chất của nhân loại Vì thế, việc nghiên cứu thành phần hóa học của cây chè đắng Cao Bằng là một vấn đề cần thiết Trong luận án này chúng tôi chỉ nghiên cứu thành phần triterpenoid trong lá chè đắng Cao Bằng, chú trọng đến việc cô lập và xác định cấu trúc những hợp chất mới

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

- APCI: Atmospheric Pressure Chemical Ionization

- Asp niger: Aspergillus niger

- B subtilis: Bacillus subtilis

- C albicans: Candida albicans

- C: Catechin

- COSY: COrrelation SpectroscopY

- DEPT: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

- EGCg: Epigallocatechin gallate

- ESI: ElectroSpray Ionization

- F oxysporum: Fusarium oxysporum

- Ga: Gallic acid

- HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Coherence

- HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation

- MeOH: Methanol

- NOESY: Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY

- P aeruginosa: Pseudomonas aeruginosa

- S aureus: Staphylococcus aureus

- S cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.4.1 : Chương trình gradient phân tích các hợp chất bioflavonoid 36 

Bảng 3.1.1 : Số liệu đường chuẩn của Ga 46 

Bảng 3.1.2 : Số liệu đường chuẩn của C 47 

Bảng 3.1.3 : Số liệu đường chuẩn của EC 47 

Bảng 3.1.4 : Số liệu đường chuẩn của ECg 48 

Bảng 3.1.5 : Số liệu đường chuẩn của EGC 48 

Bảng 3.1.6 : Số liệu đường chuẩn của EGCg 49 

Bảng 3.2.1 : Hàm lượng Ga, C, EC, ECg, EGC và EGCg có trong giống chè LD97 50 

Bảng 3.2.2 : Hàm lượng Ga, C, EC, ECg, EGC và EGCg có trong giống chè PH1 51 

Bảng 3.2.3 : Hàm lượng Ga, C, EC, ECg, EGC và EGCg có trong giống chè TB14 52 

Bảng 3.2.4 : Hàm lượng Ga, C, EC, ECg, EGC và EGCg có trong giống chè TB18 53 

Bảng 3.3.1 : So sánh hàm lượng EC, ECg, EGC và EGCg trong chè Tâm Châu và Thái Bảo 54 

Bảng 3.4.1 : Kết quả về nhiệt độ, số giờ nắng và lượng mưa ở Bảo Lộc 58 

Bảng 3.4.2 : So sánh hàm lượng EGCg và tổng polyphenol* trong bốn giống chè khảo sát thay đổi theo tháng trong năm 58 

Bảng 3.4.3 : Mối tương quan giữa hàm lượng EGCg (mg/g), tổng

polyphenol* (mg/g) với nhiệt độ (oC), lưu lượng mưa (mm)

CÂY CHÈØ ĐẮNG CAO BẰNG 

Bảng 1.7 : Một số loài thuộc chi Ilex ở Việt Nam 22 

Bảng 3.6.1 : Dữ liệu phổ NMR của hợp chất IL 261 65 

Bảng 3.6.2 : Dữ liệu phổ NMR của hợp chất IL 271 có so sánh với hợp

chất lupeol 68 

Bảng 3.6.3 : Dữ liệu phổ NMR của hợp chất IL 6522 so sánh với

lup-20(29)-en-3β,23-diol 74 

Bảng 3.6.4 : Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ILE 7222 so sánh với hợp

chất methyl 3ß-hydroxylup-20(29)-en-24-oate (IL 261) 77 

Bảng 3.6.5 : Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ILC 4443 so sánh với hợp chất

ursolic acid 79 

Bảng 3.6.6 : Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ILC 54321 so sánh hợp

chất 27-p-(E)-coumaroyloxyursolic acid 83 

Bảng 3.7.1 : Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 85 

Bảng 3.7.2 : Kết quả thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa theo phương

pháp DPPH 85 

Bảng 3.7.4 : Kết quả thử nghiệm gây độc tế bào – Cytotoxicity 86 

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ CÂY CHÈ

HÌNH Trang

Hình 1.1.1 : Lá, hoa và trái của cây chè ở Bảo Lộc 8 

Hình 1.3.2.1 : Vườn chè giống LD97 15 

Hình 1.3.2.2 : Búp và lá chè LD97 tại Bảo Lộc 15 

Hình 1.3.2.3 : Vườn chè giống PH1 15 

Hình 1.3.2.4 : Búp và lá chè PH1 tại Bảo Lộc 15 

Hình 1.3.2.5 : Vườn chè giống TB14 15 

Hình 1.3.2.6 : Búp và lá chè TB14 tại Bảo Lộc 15 

Hình 1.3.2.7 : Vườn chè giống TB18 16 

Hình 1.3.2.8 : Búp và lá chè TB18 tại Bảo Lộc 16 

Hình 2.4.1 : Sắc đồ của sáu chất chuẩn 36 

Hình 2.5.1 : Sắc đồ của EGCg của giống chè LD97 ở tháng 7 37 

ĐỒ THỊ  Đồ thị 3.1.1 : Đường chuẩn Ga 46 

Đồ thị 3.1.2 : Đường chuẩn C 47 

Đồ thị 3.1.3 : Đường chuẩn EC 47 

Đồ thị 3.1.4 : Đường chuẩn ECg 48 

Đồ thị 3.1.5 : Đường chuẩn EGC 48 

Đồ thị 3.1.6 : Đường chuẩn EGCg 49 

Đồ thị 3.2.1 : Hàm lượng bioflavonoid trong giống chè LD97 thay đổi theo từng tháng trong năm 50 

Đồ thị 3.2.2 : Hàm lượng bioflavonoid trong giống chè PH1 thay đổi theo

từng tháng trong năm 51 

Đồ thị 3.2.3 : Hàm lượng bioflavonoid trong giống chè TB14 thay đổi theo từng tháng trong năm 53 

Đồ thị 3.2.4 : Hàm lượng bioflavonoid trong giống chè TB18 thay đổi theo từng tháng trong năm 54 

Đồ thị 3.3.1 : Hàm lượng EC, ECg, EGC và EGCg có trong chè Tâm Châu và chè Thái Bảo 55 

CÂY CHÈ ĐẮNG  Hình 1.6 : Một số loài thuộc chi Ilex 25 

Hình 1.8.1 : Nhánh, lá và quả của cây chè đắng ở Cao Bằng 25 

Hình 1.10.1 : Lá chè đắng sau khi sấy khô giống cây đinh 31 

Hình 1.10.2 : Lá chè đắng sau khi sấy khô có dạng cuộn 31 

Hình 3.6.1.2 : Tương tác NOESY của hợp chất IL 261 63 

Hình 3.6.1.1 : Phổ NOESY của hợp chất IL 261 63

Hình 3.6.2.1 : Tương tác HMBC trong hợp chất IL 271 67 

Hình 3.6.3.2 : So sánh giá trị cộng hưởng C của một số carbon của hợp chất IL 6522 và hợp chất lup-20(29)-en-3β,23-diol 71 

Hình 3.6.3.3 : Phổ NOESY của hợp chất IL 6522 73 

Hình 3.6.3.4 : Tương tác HMBC trong hợp chất IL 6522 73 

Hình 3.6.4.1 : Tương tác HMBC của hợp chất ILE 7222 76 

Hình 3.6.6.1 : Phổ NOESY của hợp chất ILC 54321 82 

Hình 3.6.6.2 : Tương tác HMBC của hợp chất ILC 54321 84 

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1 

DANH MỤC CÁC BẢNG 2 

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 4 

LỜI MỞ ĐẦU 6 

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 8 

CÂY CHÈ  1.1   Đặc điểm thực vật của cây chèø 8  

1.2   Tình hình phân bố cây chè và sản xuất chè ở Việt Nam 9  

1.3   Điều kiện tự nhiên và các giống chè ở Lâm Đồng 10  

1.4   Thành phần hóa học của cây chè 16  

1.4.1  Thành phần hóa học chủ yếu trong búp chè 16 

1.4.2  Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và sáng chế trên thế giới 17 

1.5   Hoạt tính sinh học của cây chè 20  

1.5.1  Theo kinh nghiệm dân gian 20 

1.5.2  Nghiên cứu về dược tính trên thế giới 20 

CÂY CHÈ ĐẮNG  1.6   Đặc điểm thực vật của cây chè đắng 21  

1.7   Phân bố chi Ilex ở Việt Nam 21 

1.8   Đặc điểm thực vật của cây chè đắng ở Cao Bằng 23  

1.8.1  Về tên khoa học 23 

1.8.2  Về đặc điểm thực vật của cây chè đắng ở Cao Bằng 24 

1.9   Một số nghiên cứu từ chi Ilex 26 

1.9.1  Các hợp chất đã cô lập được từ chi Ilex 26 

1.9.2  Một số nghiên cứu ở Việt Nam trên cây chè đắng Cao Bằng 29 

1.10   Công dụng và các dạng sản phẩm trên thị trường của cây chè đắng Cao Bằng 29  

1.10.1  Công dụng 29 

1.10.2  Một số bài thuốc được dùng trong dân gian 30 

1.10.3  Các dạng sản phẩm trên thị trường 31 

1.11   Hoạt tính sinh học của dịch chiết lá chè đắng 31  

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 33 

CÂY CHÈ  2.1   Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 33  

2.1.1  Nguyên liệu 33 

2.1.2  Phương pháp nghiên cứu 34 

2.2   Pha động và dung dịch chuẩn gốc 34  

2.3   Trích bioflavonoid 35  

2.4   Các thông số của hệ thống LC/MS 35  

2.5   Xử lý định lượng các bioflavonoid 37  

CÂY CHÈØ ĐẮNG CAO BẰNG  2.6   Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 38  

2.6.1  Nguyên liệu 38 

2.6.2  Phương pháp nghiên cứu 38 

2.7   Cô lập các hợp chất từ lá chè đắng Cao Bằng 39  

2.7.1  Điều chế các loại cao bằng phương pháp ngâm dầm và sắc

ký cột cô lập một số hợp chất 39 

2.7.2  Điều chế cao và cô lập hợp chất bằng phương pháp trích Soxhlet 41 

2.8   Phương pháp thử hoạt tính sinh học 44  

2.8.1  Phương pháp thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial Assay) 44 

2.8.2  Thử hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH 45 

2.8.3  Thử hoạt tính gây độc tế bào 45 

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 

CÂY CHÈ  3.1   Xây dựng các đường chuẩn 46  

3.1.1  Đường chuẩn gallic acid (Ga) 46 

3.1.2  Đường chuẩn catechin (C) 47 

3.1.3  Đường chuẩn epicatechin (EC) 47 

3.1.4  Đường chuẩn epicatechin gallate (ECg) 48 

3.1.5  Đường chuẩn epigallocatechin (EGC) 48 

3.1.6  Đường chuẩn epigallocatechin gallate (EGCg) 49 

3.2   Hàm lượng bioflavonoid (Ga, C, EC, ECg, EGC và EGCg) có trong các mẫu chè khảo sát 49  

3.2.1  Hàm lượng bioflavonoid trong giống chè LD97 49 

3.2.2  Hàm lượng bioflavonoid trong giống chè PH1 51 

3.2.3  Hàm lượng bioflavonoid trong giống chè TB14 52 

3.2.4  Hàm lượng bioflavonoid trong giống chè TB18 52 

3.3   So sánh hàm lượng EC, ECg, EGC và EGCg trong một số

3.4   Giải thích sự biến đổi hàm lượng bioflavonoid của các giống

chè khảo sát và kết quả nghiên cứu 55  

3.4.1  Giải thích sự biến đổi hàm lượng bioflavonoid của các giống chè 55 

3.4.2  Kết quả nghiên cứu các giống chè khảo sát 57 

CÂY CHÈØ ĐẮNG CAO BẰNG  3.5   Giới thiệu chung 60  

3.6   Cấu trúc của sáu hợp chất đã cô lập 60  

3.6.1  Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất IL 261 60 

3.6.2  Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất IL 271 66 

3.6.3  Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất IL 6522 69 

3.6.4  Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất ILE 7222 75 

3.6.5  Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất ILC 4443 78 

3.6.6  Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất ILC 54321 80 

3.7   Kết quả thử hoạt tính sinh học 84  

3.7.1  Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định 84 

3.7.2  Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 85 

3.7.3  Thử nghiệm gây độc tế bào – Cytotoxicity 86 

KẾT LUẬN 88 

KIẾN NGHỊ 91 

DANH MỤC CÔNG TRÌNH 92 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 93 

PHỤ LỤC 102 

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

CÂY CHÈ

1.1 Đặc điểm thực vật của cây chèø

Cây chè nằm trong hệ thống phân loại thực vật như sau:[15]

 Họ Chè (Theaceae)

 Chi Camellia (Thea)

 Loài Sinensis

Hình 1.1.1: Lá, hoa và trái của cây chè ở Bảo Lộc

Theo Harler C R (1956)[15], tên khoa học của cây chè là Camellia sinensis (L) O Kuntze và có tên đồng nghĩa là Thea sinensis L., đã được nhiều nhà khoa

học công nhận

Tìm hiểu nguồn gốc cây chè là vấn đề phức tạp; cho đến nay có nhiều quan điểm khác nhau về nguồn gốc cây chè, dựa trên những cơ sở về lịch sử, khảo cổ học và thực vật học Theo quan điểm của nhiều người, cây chè mọc ở vùng cao nguyên Vân Nam, Trung Quốc, nơi có điều kiện khí hậu ẩm quanh năm Theo các tài liệu của Trung Quốc thì cách đây 4.000 năm người Trung Quốc đã biết

dùng chè làm dược liệu, sau đó mới dùng để uống[20] Tuy nhiên, những công trình nghiên cứu của Djemukhatze (1961-1976)[16] nhằm so sánh thành phần các chất catechin của các loại chè được trồng trọt và chè mọc hoang dại đã cho phép

đi tới một kết luận khác: “Nguồn gốc cây chè chính là ở Việt Nam”

Tuy có sự khác nhau nhưng những quan điểm trên đều có sự thống nhất rằng: cây chè có nguồn gốc từ Châu Á, nơi có điều kiện khí hậu nóng, ẩm Chè ngày nay đã được phân bố khá rộng trong những điều kiện tự nhiên rất khác nhau, từ 30 độ vĩ nam đến 45 độ vĩ bắc

1.2 Tình hình phân bố cây chè và sản xuất chè ở Việt Nam

- Tình hình phân bố cây chè [15]

Với ba phần tư diện tích là đồi núi, Việt Nam có điều kiện tự nhiên khá phù hợp cho cây chè sinh trưởng và phát triển Tuy nhiên ở Việt Nam sản xuất chè chỉ thực sự bắt đầu từ sau những năm 1925 Các vùng chè ở Việt Nam, bao gồm:

 Vùng chè Tây Bắc, chủ yếu ở hai tỉnh Sơn La và Lai Châu, giống chè chủ yếu là Shan và Trung Du

 Vùng chè Việt Bắc – Hoàng Liên Sơn, gồm các tỉnh Hà Giang, Tuyên Quang, Yên Bái, Hoà Bình và Lào Cai, giống chè chủ yếu là Trung Du, Shan, Assam

 Vùng chè Trung du – Bắc Bộ, gồm các tỉnh Thái Nguyên, Bắc Cạn, Phú Thọ, Hà Tây và Bắc Hà Nội, giống chè chủ yếu là Trung Du, Assam và các dòng chè lai

 Vùng chè Bắc Trung, gồm các tỉnh Nghệ An, Thanh Hóa, Hà Tĩnh, giống chè chủ yếu là Assam, chè Gay (địa phương)

 Vùng chè Tây Nguyên, gồm các tỉnh Lâm Đồng, Gia Lai và Đắc Lắc, giống chè chủ yếu là Shan, Trung Du, Assam

Ngoài năm vùng trên, chè còn được trồng ở cả một số vùng duyên hải miền Trung: Quảng Bình, Quảng Trị, Quảng Nam, Quảng Ngãi… Ở các vùng này, chè

- Tình hình sản xuất chè [15]

Ở Việt Nam, các giống chè được sử dụng trong sản xuất chè hiện nay chủ yếu là quần thể giống địa phương và phương thức trồng bằng hạt cũng là phương thức chủ yếu, đó là nguyên nhân quan trọng làm cho năng suất bình quân của chè Việt Nam (2,4 – 3,0 tấn búp tươi/ha) thấp hơn năng suất bình quân của chè thế giới (4,0 – 5,0 tấn búp tươi/ha) Tuy năng suất bình quân cả nước thấp, nhưng cũng có một số doanh nghiệp ở tỉnh Mộc Châu đã đạt năng suất cao như 10,5 tấn búp tươi/ha (*), nhiều vườn chè thâm canh đạt năng suất 25 tấn búp tươi/ha Tiềm năng cho năng suất của cây chè phụ thuộc nhiều vào giống và trình độ thâm canh, do vậy đối với các vùng sinh thái khác nhau, cần phải chọn lựa và làm tốt công tác nhân giống để đưa giống vào cho hợp lý nhằm phát huy nhanh ưu thế của giống

Trong số các địa phương trồng chè ở Việt Nam, Lâm Đồng là tỉnh có diện tích trồng chè tập trung và lớn nhất (chiếm 24 % diện tích) Từ lâu sản phẩm chè xanh và chè đen Lâm Đồng đã tham gia lưu thông thị trường trong nước và nhiều nước trên thế giới vớùi thương hiệu nổi tiếng như chè B’Lao, chè Cầu Đất

Dự án qui hoạch phát triển vùng nguyên liệu chè tỉnh Lâm Đồng thời kỳ

1999 – 2010 nêu rõ tổng diện tích chè đến năm 2010 là 24.500 – 28.000 ha, năng suất đạt 9,0 tấn búp tươi/ha, sản lượng đạt 68.800 tấn khô, xuất khẩu hàng năm đạt 8.000 – 9.000 tấn thành phẩm, doanh thu 9 – 10 triệu USD, giải quyết việc làm cho 550.000 lao động nông nghiệp và công nghiệp

1.3 Điều kiện tự nhiên và các giống chè ở Lâm Đồng

1.3.1 Điều kiện tự nhiên của tỉnh Lâm Đồng [74]

Khí hậu Lâm Đồng mang tính chất nhiệt đới gió mùa, nằm trong khu vực vĩ độ thấp của vùng nội chí tuyến bắc, phân chia làm hai mùa rõ rệt: mùa khô và

mùa mưa Ở đây yếu tố hàng đầu chi phối sự hình thành khí hậu là bức xạ mặt trời cao và sự hoàn lưu khí quyển Đông Nam Á Đặc trưng của chế độ nhiệt và chế độ mưa là giảm dần theo độ cao

 Các vùng khí hậu ở Lâm Đồng

Do đặc điểm của địa hình, Lâm Đồng có thể chia làm 4 vùng khí hậu tương đối đặc trưng theo độ cao, nhiệt độ trung bình và lượng mưa hàng năm:

+ Vùng 1 gồm ba huyện Đạ Huoai, Đạ Tẻh và Cát Tiên

+ Vùng 2 gồm hai huyện Bảo Lâm, Di Linh và thị xã Bảo Lộc

+ Vùng 3 gồm các huyện Đức Trọng, Đơn Dương và Lâm Hà

+ Vùng 4 gồm huyện Lạc Dương và thành phố Đà Lạt

Nhiệt độ của vùng cao nguyên Lâm Đồng cũng điều hòa hơn so với một số tỉnh khác của Tây Nguyên

 Lượng mưa

Vùng có lượng mưa lớn nhất là vùng Bảo Lộc và Bảo Lâm với 2.500 – 3.000 mm/năm, lượng mưa bình quân qua các trạm quan trắc bình quân cả tỉnh là 2.141 mm/năm Lượng mưa phân bổ không đều theo không gian và thời gian và dao động trong khoảng 1.600 – 2.700 mm/năm Ở sườn núi có hướng gió Tây Nam thổi, lượng mưa đạt tới 3.500 mm/năm Về phía Đông và Đông Bắc lượng mưa giảm dần còn khoảng 1.600 – 1.700 mm/năm

Mùa mưa trùng với gió mùa Tây Nam, mùa mưa bắt đầu từ tháng 5 đến tháng 10, chiếm 80 – 85 % tổng lượng mưa cả năm Các tháng có lượng mưa lớn nhất là tháng 7, 8 và 9, có năm mưa lớn kéo dài đã gây nên ngập lụt ở một số vùng như Đơn Dương, Đạ Tẻh, Cát Tiên

Mùa khô từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau, lượng mưa trong mùa khô chỉ chiếm 15 – 20 % tổng lượng mưa cả năm Cường độ mưa phân bố như sau: lượng

mưa/ngày 0,1 – 15 mm chiếm tần suất 65 – 80 %, lượng mưa/ngày từ 15,1 – 50

mm với tần suất 20 – 30 %, mưa lớn ở cường độ trên 100 mm/ngày ít xảy ra

 Độ ẩm

Độ ẩm ở Lâm Đồng tương đối cao, bình quân 84 % Ở các vùng Đà LạÏt, Bảo Lộc, Bảo Lâm có độ ẩm cao nhất, trên 85 %; ở các vùng Đạ Hoai, Đạ Tẻh có độ ẩm thấp hơn

 Số giờ nắng

Nhìn chung ở Lâm Đồng, số giờ nắng ít hơn so với các tỉnh khác ở Tây Nguyên, số giờ nắng bình quân trong năm là 1.786 giờ, trung bình 4,9 giờ/ngày (Bảo Lộc)

 Nước và các yếu tố thủy văn

Sông Đạ Đâng (Đạ Đung, Đạ Đờn) cắt ngang qua cao nguyên có dạng bậc rõ ràng Chế độ dòng chảy trong năm cũng phân ra hai mùa: mưa và mùa khô rõ rệt Lâm Đồng có nhiều sông suối ao hồ hình thành tự nhiên, có các nguồn nước mặt, nước ngầm nên tại đây có thể xây dựng các công trình thủy lợi như đập, hồ chứa nước để phục vụ tưới cho các cây trồng của tỉnh

 Rừng

Là tỉnh miền núi nên diện tích rừng khá lớn, độ che phủ của rừng tương đối cao so với các tỉnh ở Tây Nguyên, độ che phủ của rừng Lâm Đồng hiện nay đạt khoảng 63 %

 Đất đai

Tỉnh Lâm Đồng có diện tích đất tự nhiên là 977.335 ha gồm 617.800 ha đất lâm nghiệp có rừng, 359.535 ha đất nông nghiệp và khả năng nông nghiệp Đến năm 2010 có thể khai thác thêm từ 30.000 – 35.000 ha đất vừa sản xuất nông nghiệp hoặc nông lâm kết hợp nhằm thực hiện các chương trình mục tiêu kinh tế

Đất đai ở Lâm Đồng có 8 nhóm khác nhau, quan trọng nhất là nhóm đất feralit nâu vàng (Ferral Sols, Acri Sols) có diện tích lớn nhất thích hợp cho việc phát triển cây công nghiệp dài ngày Chè ở Lâm Đồng được trồng nhiều ở cao nguyên Bảo Lộc – Di Linh, nơi có độ cao trung bình 800 – 1.000 mét, có nơi 1.100 – 1.200 mét; bề mặt cao nguyên này được phủ bằng đất bazan tạo nên một lớp đất khá dày, màu mỡ Đất feralít nâu đỏ, nâu vàng, phát triển trên đá mẹ bazan Tầng canh tác dày hơn 1 mét, pH = 4 – 5,5 rất thích hợp cho cây công nghiệp dài ngày như chè, cà phê

Như vậy, tỉnh Lâm Đồng có điều kiện tự nhiên, khí hậu, đất đai ưu đãi, phù hợp cho sự phát triển của cây chè Với những định hướng trong thời gian tới của nhà nước, của ngành và của tỉnh nhằm phát triển chè thành cây chủ lực thì việc chọn lọc được bộ giống chè có ưu điểm về năng suất, chất lượng để thay thế các giống cũ và mở rộng diện tích là một việc làm hết sức cần thiết

1.3.2 Các giống chè ở Lâm Đồng[14], [15], [18], [21]

- Giống PH1 (Hình 1.3.2.3 và Hình 1.3.2.4)

PH1 là giống do Viện Nghiên cứu chè Việt Nam chọn lọc từ quần thể Manipur – Ấn Độ Giống PH1 được chọn tạo bằng phương pháp chọn lọc cá thể

từ tập đoàn Assamica từ năm 1965 và được công nhận năm 1972 Giống PH1

được di nhập vào Lâm Đồng từ năm 1991

Đặc điểm: thân gỗ, lá to trung bình, màu xanh đậm, hình bầu dục dài 8 – 12

cm, rộng 4,0 – 4,5 cm, có 8 – 10 đôi gân lá, răng cưa không đều và sâu, không kéo dài đến chót lá Búp to không có lông mao trắng, trọnglượng một búp đạt 0,8 – 1,0 g Năng suất bình quân đạt 15 – 17 tấn búp.ha-1/năm, thâm canh tốt có thể đạt 25 – 28 tấn.ha-1 Giống có khả năng chịu nóng, hạn khá, chịu rét trung bình, kháng rầy xanh, bọ xít muỗi, dễ bị nhiễm nhện đỏ Giống PH1 là nguyên liệu phù

hợp cho chế biến chèø đen đạt tiêu chuẩn xuất khẩu

- Giống chè TB18 (*) (Hình 1.3.2.7 và Hình 1.3.2.8)

Đây là giống chè Shan Trấn Ninh, hiện nay được trồng khá phổ biến ở Bảo Lộc và cũng cho năng suất cao Tuy nhiên, do chưa được nhà nước công nhận nên tên giống chè chưa được hợp thức hóa Giống chè này được trường Trung học Kỹ thuật và Dạy nghề ở Bảo Lộc trồng và đang nghiên cứu với tên gọi là TB18

Ngoài ra ở Bảo Lộc cũng có những giống chè khác như:[75]

- LDP1, LDP2 là dòng chè được chọn lọc bằng phương pháp lai hữu tính (1981 – 1988) với cây mẹ là Đại bạch trà và cây bố là PH1

(*) đang nghiên cứu

Hình 1.3.2.1: Vườn chè giống LD97 Hình 1.3.2.2: Búp và lá chè LD97 tại Bảo Lộc

Hình 1.3.2.3: Vườn chè giống PH1 Hình 1.3.2.4: Búp và lá chè PH1 tại Bảo Lộc

Hình 1.3.2.6: Búp và lá chè TB14 tại Bảo Lộc

Hình 1.3.2.5: Vườn chè giống TB14

- Ngọc Thúy (du nhập vào Việt Nam năm 1991), Kim Tuyên (du nhập vào Việt Nam năm 1994) là các giống chè của Đài Loan Các giống chè này đang được thị trường nhiều nước chấp nhận

1.4 Thành phần hóa học của cây chè [74], [76]

1.4.1 Thành phần hóa học chủ yếu trong búp chè: gồm có

 Nước là thành phần chủ yếu trong búp chè Trong búp chè (tôm) và hai

hoặc ba lá có hàm lượng nước thường từ 75 – 82%

 Tanin gọi chung là hợp chất polyphenol Dựa vào tính chất của những hợp chất

này mà có thể phân thành: nhóm tanin ngưng tụ (condensed tannins) tan được trong ethyl acetate, thường có phân tử lượng khoảng 320 – 360 amu; nhóm tanin thủy phân (hydrolyzable tannins) tan trong nước, thường có phân tử lượng khoảng 420 – 450 amu

 Alkaloid trong chè có nhiều loại nhưng nhiều nhất là caffein Hàm lượng

caffein ở trong chè có từ 3 – 5%

 Protein là hợp chất hữu cơ phức tạp kết hợp với một phần tanin làm cho vị đắng và chát giảm đi

Hình 1.3.2.8: Búp và lá chè TB18 tại Bảo Lộc Hình 1.3.2.7: Vườn chè giống TB18

 Acid amin[80] gồm có 17 hợp chất được tìm thấy trong cây chè, trong đó có

10 acid amin cơ bản là threonine, phenylalanine, leucine, isoleucine, valine, tyrosine, glutamine, serine, glutamic acid và aspartic acid

 Pectin thường ở dạng hòa tan trong nước Pectin tham gia vào việc tạo mùi

táo chín trong quá trình làm héo chè và làm cho lá chè dễ xoăn lại khi chế biến

 Vitamin hàm lượng vitamin C trong chè nhiều gấp 3 đến 4 lần so với cam, chanh

 Men chủ yếu gồm hai nhóm chính: nhóm thủy phân (men amylase, glucosydase, protease ) và nhóm oxy hóa khử (peroxydase, polyphenoloxydase )

 Chất tro hàm lượng tro trong chè tươi từ 4 – 5 % và trong chè khô từ 5 – 6 %

1.4.2 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và sáng chế trên thế giới

- Một số các nghiên cứu thành phần hóa học cây chè trên thế giới

 Theo tài liệu GreenselectTM của Ý[29], chè xanh có chứa flavanol (catechin polyphenol), flavonol và phenolic acid Nhiều flavanol được cô lập từ chè xanh và được nhận danh, hai hợp chất có khả năng kháng oxy hóa được quan tâm nhiều là epigallocatechin gallate (EGCg) và epigallocatechin (EGC)

 Yoko Yoshida[69] nghiên cứu ảnh hưởng của màng lọc đến hiệu suất thu hồi và của pH trong việc định lượng catechin trích từ chè xanh bằng sắc ký lỏng

 Lihu Yao và cộng sự[48] đã nghiên cứu ảnh hưởng của khí hậu đến thành phần polyphenol trong búp chè tươi trồng ở miền bắc Queensland – Úc bằng phương pháp sắc ký lỏng Thành phần chủ yếu được nghiên cứu là các hợp chất EGCg, ECg và EGC từ tháng 4 /2000 đến tháng 5/2001

Qua kết quả nghiên cứu, các tác giả đề nghị có thể sử dụng EGCg và ECg để đánh giá ảnh hưởng của khí hậu đến thành phần polyphenol trong lá chè tươi ở Úc và tỷ lệ (EGCg + ECg)/ EGC được xem như là chỉ số để đo sự khác biệt thành phần flavanol trong búp chè tươi

Tác giả còn đưa ra các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự thay đổi hàm lượng các hợp chất EGCg, ECg và EGC trong búp chè tươi trồng ở Úc, cụ thể hàm lượng EGCg, ECg và EGC cao nhất trong các tháng nóng (tháng 4/2000 và tháng 5/2000) và thấp nhất trong các tháng lạnh (tháng 7/2000 – tháng 9/2000)

 Theo nghiên cứu của Yukihiko Hara[72] thì hàm lượng EGCg trong chè tăng

khi nhiệt độ cao và nắng nhiều, là nhờ hiệu ứng quang hợp có 14CO2 hỗ trợ cho việc tạo thành các catechin Điều này được xác nhận trong các catechin có 14C

 Jung Il Kim và các cộng sự[40] đã cô lập EGCg từ lá chèø xanh trồng ở Chonnam – Nam Hàn Quốc Tác giả đã tìm được điều kiện tối ưu để tách EGCg là sử dụng sắc ký lỏng điều chế với cột pha đảo C18 (250 x 22 mm), kích thước hạt 15 và 40 – 63 μm, bơm đẳng dòng với pha động là 0,1 % acetic acid trong nước – acetonitrile – methanol – ethyl acetate (87:10:1:3)

 Shengmin Sang và cộng sự[63] đã nghiên cứu về khả năng tự oxy hóa của EGCg thành quinon và sự hình thành các metabolite trong chè

 Zhen- Yu Chen[73] đã điều chế dịch chiết chè xanh giàu flavanol bằng cách kết tủa với AlCl3 Hàm lượng flavanol được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng

 Chen Ping và cộng sự[34] đã tinh chế dẫn xuất acyl mạch dài mới của EGCg từ polyphenol trong lá chè xanh

 Năm 2007, Jun Xu[44] đãõ tinh chế EGCg từ nguyên liệu chè xanh thô bằng phương pháp sắc ký lỏng Tác giả đã dùng cột Superose 12HR 10/30, pha động acetonitrile – nước (78: 22) Độ tinh khiết của EGCg là 99 % và hiệu suất thu hồi từ 60 – 65 %

 Năm 2008, nhóm tác giả Shu-Ting Yin[65] cho biết hợp chất ECGg có thể bắt các gốc tự do hiệu quả cao hơn các catechin khác và EGCg được xem như là chất có khả năng chữa trị nhiễm độc chì

- Một số sáng chế liên quan đến chè xanh trên thế giới

 Phương pháp trích ly caffein tự do của hợp chất catechin từ chè xanh[53]

 Qui trình cô đặc epigallocatechin gallate[54]

 Các hợp chất catechin từ chè xanh và qui trình tạo ra nó [55]

 Hợp chất catechin từ chè xanh là tác nhân đặc biệt làm giảm bệnh ung thư[56],[57]

 Cao chiết từ chè xanh được sử dụng trong khẩu phần ăn kiêng giúp chữa bệnh cho người bị béo phì[58]

 Qui trình sản xuất epigallocatechin gallate[59]

1.4.3 Các nghiên cứu về thành phần hóa học về cây chè Việt Nam

 Trích ly tổng polyphenol từ chè xanh sử dụng phương pháp trích có hỗ trợ của vi sóng Từ lá chè xanh, tác giả Phạm Thành Quân và cộng sự[19] sử dụng dung môi trích theo hai phương pháp :

- Phương pháp trích có hỗ trợ vi sóng (Microwave Assisted Extraction– MAE):

100 g lá chè tươi được cắt ngắn khoảng 1 – 1,5 mm, đem ngâm khoảng 90 phút vào dung môi rượu: nước (70: 30), tỷ lệ nguyên liệu (g): dung môi (ml) là (1: 5) đến (1: 15) Tiếp theo điều chỉnh pH (2 – 6) và sau đó cho vào lò vi sóng công suất 450 W, thời gian 5 – 7 phút (chú ý giữ nhiệt độ không quá 70oC) Đem ra để nguội đến nhiệt độ phòng, lọc và cô quay, thu được 50 ml dịch chiết Bảo quản ở nhiệt độ 4oC Hiệu suất lượng cao trên lá cây tươi là 82,6 % trong 6 phút

- Phương pháp cổ điển (đun nóng): tiến hành tương tự như phương pháp vi sóng nhưng thời gian đun 180 phút Hiệu suất lượng cao trên lá tươi là 62,1 % trong 180 phút

 Nghiên cứu công nghệ sản xuất polyphenol từ chè xanh Việt Nam của Viện Công nghệ thực phẩm[28]

1.5 Hoạt tính sinh học của cây chè

1.5.1 Theo kinh nghiệm dân gian[74]

Chè là thức uống, caffein có trong chè là chất có khả năng kích thích hệ thần kinh trung ương, kích thích vỏ đại não làm cho tinh thần minh mẫn, tăng cường sự hoạt động của các cơ trong cơ thể, nâng cao năng lực làm việc Tanin trong chè có khả năng giải khát, chữa một số bệnh đường ruột như tả, lỵ, thương hàn Nước chè đặc biệt là chè xanh chữa bệnh sỏi thận, sỏi bàng quang và chảy máu dạ dày

1.5.2 Nghiên cứu về dược tính trên thế giới

- E K Mgaloblisvili và Weisburger[39] đã xác định ảnh hưởng của nước chè xanh tới chức năng của hệ thống tim mạch, chức năng hô hấp, hệ thống điều tiết máu

- Các nhà khoa học Nhật Bản[74] chứng minh chè có tác dụng chống được chất đồng vị phóng xạ Stronti (Sr) 90

- Theo Hisrota Fujiiki[37], ở Nhật, chè xanh được xem như một loại thức uống do trong chè có hàm lượng epigallocatechin gallate (EGCg) cao, có khả năng ngăn ngừa bệnh ung thư

- EGCg[36] có khả năng ngăn ngừa sự oxy hóa trong huyết thanh của người

- EGCg[41] trong lá chè xanh có khả năng ngăn ngừa dấu hiệu Wnt trong quá trình xâm lấn của tế bào ung thư vú

1.5.3 Nghiên cứu về dược tính ở Việt Nam

- Đề tài nghiên cứu của Phạm Thiện Ngọc[25] nhằm chiết xuất polyphenol từ lá chè xanh Việt Nam, đánh giá tác dụng của bột polyphenol trên sự rối loạn chuyển hóa lipid ở thỏ đã cho uống cholesterol và trên trạng thái chống oxy hóa

ở thỏ bị chiếu xạ

- Đề tài nghiên cứu của Nguyễn Thị Hà[11] nhằm đánh giá tác dụng của polyphenol trong lá chè xanh Việt Nam trên sự chuyển hóa lipid và trạng thái chống oxy hóa trong máu chuột cống trắng bị gây đái đường thực nghiệm

- Nghiên cứu quy trình chiết xuất EGCg từ chè xanh và thử nghiệm tác dụng bảo vệ gan của tác giả Trần Lê Tuyết Châu[5] là đề tài nghiên cứu cơ bản năm

2008 và đã nghiệm thu vào tháng 9/2010 với qui trình ly trích như sau:

CÂY CHÈ ĐẮNG

1.6 Đặc điểm thực vật của cây chè đắng[6],[77],[78]

 Cây chè đắng thuộc họ Nhựa ruồi hay họ Trâm Bùi (Aquifoliaceae)

 Đặc điểm thực vật họ Trâm Bùi: lá thường có răng cưa, mọc vòng có thể có các bướu li ti ở mặt sau phiến lá, cụm hoa thường mọc dưới tán, quả hình cầu, có chỏm là núm nhụy màu đen, có cuống, bên trong chứa vài hạch (Hình 1.6.1) Trước đây, họ Aquifoliaceae được chia thành hai chi:

- Chi Nemopanthus chỉ gồm một loài Nemopanthus mucronatus Loài này có

đài hoa ngắn, cánh hoa hẹp và trên cơ sở tế bào học nó là thể tứ bội (Hình 1.6.2)

- Chi Ilex[7] có khoảng 400 – 600 loài Chi Ilex thuộc thể lưỡng bội, phân bố

chủ yếu ở châu Á, châu Âu, Bắc Phi, Bắc Mỹ và Nam Mỹ trừ châu Úc và Tây Bắc Mỹ Hoa nhỏ thường có màu trắng có khi vàng hay lục (Hình 1.6.3)

Hiện nay, theo kết quả phân tích phân tử thì chi Nemopanthus được nhập vào chi Ilex, với tên gọi là Ilex mucronata[76]

1.7 Phân bố chi Ilex ở Việt Nam[12], [26]

Chi Ilex ở Việt Nam có khoảng 40 loài

Chè tươi nguyên liệu Diệt men Nghiền nhỏ Trích ly

Sản phẩm Tinh chế Dịch chiết Lọc

Bảng 1.7: Một số loài thuộc chi Ilex ở Việt Nam

Ilex cymosa

Bùi ba vỏ, Bùi núi, Bùi tụ tán

Thanh Hóa, Kontum, Gia Lai, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu

Gỗ dân dụng

Ilex eugeniifolia Bùi lá trâm

Đà Nẳng, Lâm Đồng, Đồng Nai, Phú Quốc, Côn Đảo

Gỗ xây dựng và đồ mộc

Ilex ficoidea Bùi da, Bùi

Thanh Hóa, Kontum, Ninh Thuận, Đồng Nai

Vỏ cây chữa đau bụng, khó tiêu, sốt rét, trúng độc thức ăn

Ilex kaushue

Chè đắng, Khổ đinh tràø, Ché khôm

Lào Cai, Cao Bằng, Hòa Bình, Ninh Bình

Lá, búp dùng để uống tác dụng thanh nhiệt, giải độc

Ilex marcrocarpa Bùi trái to Lào Cai, Đà Nẳng, Khánh

Hòa, Lâm Đồng

Gỗ dùng đóng đồ gia dụng

Ilex rotunda Bùi lá tròn

Quảng Ninh, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Ninh Bình, Thanh Hóa, Đà Nẳng

Gỗ dùng làm đồ gia dụng, vỏ sắc nước uống chữa cảm mạo,

ho, loét dạ dày, viêm ruột

Tên khoa học Tên thường Phân bố Công dụng

Nhựa ruồi lá nhỏ

Lạng Sơn, Quảng Ninh, Thái Nguyên, Bắc Ninh, Hà Tây, Lâm Đồng, Quảng Trị

Rễ sắc uống chữa cảm, sưng họng, lá tươi giã đắp chữa mụn nhọt, vết thương bầm tím

Ilex wallichi Bùi wallich

Đà Nẳng, KonTum, Lâm Đồng, Bình Phước, Bình Dương, Đồng Nai

Gỗ gia dụng

1.8 Đặc điểm thực vật của cây chè đắng ở Cao Bằng

1.8.1 Về tên khoa học[13]

Năm 1999, các nhà thực vật học đã dựa vào một số đặc điểm để phân biệt

hai loài Ilex latifolia và Ilex kaushue như sau:

 Ilex latifolia: cành và cuống hoa hoàn toàn không có lông, phiến lá dài 8 –

17 cm, rộng 4,5 – 7,5 cm, gân bên chỉ rõ ở mặt dưới, không rõ ở mặt trên, cụm hoa dạng tán giả gần như không có cuống Đài của hoa đực hình đấu, nhị dài bằng cánh hoa

 Ilex kaushue: cành và cuống hoa có lông tơ thưa, phiến lá dài 13 – 16 cm,

rộng 5 – 6 cm, gân bên rõ cả ở hai mặt lá Cụm hoa mọc tụm là dạng chùm giả với trục, cụm hoa dài gần 1 cm, đài của hoa đực hình đĩa, nhị ngắn hơn cánh hoa Từ sự phân biệt đó, hiện nay tên khoa học của cây chè đắng ở Cao Bằng

được GS TSKH Nguyễn Tiến Bân xác định là Ilex kaushue S Y Hu

1.8.2 Về đặc điểm thực vật của cây chè đắng ở Cao Bằng[7], [2]

Cây gỗ cao khoảng 6 – 20 m, đường kính thân khoảng 20 – 60 cm, cũng có cây cổ thụ cao đến 35 m, đường kính thân 120 cm, cành khô màu nâu xám không lông Lá dài khoảng 8 – 17 cm, rộng 4,5 – 7,5 cm, mọc so le, dai và mỏng, hình thuôn dạng bầu dục hay hình mác ngược Những lá ở chồi non có thể dài tới 21 –

31 cm và rộng 9 – 13 cm, mặt trên màu lục sẩm, mặt dưới màu lục nhạt, gân giữa lõm, cuống lá dài 1,5 – 2,0 cm Hoa đơn tính, họp thành cụm hoa ở nách lá Cụm hoa đực thường gồm: 20 – 30 hoa, đài hoa đực hình đĩa với 4 cánh hoa, 4 nhị ngắn hơn hoặc gần bằng cánh hoa Cụm hoa cái gồm 3 – 9 hoa có cuống thô dài

4 – 6 mm Cây ra hoa vào tháng 2 – 4 Quả hình cầu, đường kính 1,0 – 1,2 cm, không có lông khi chín màu đỏ, chứa 3 – 4 hạt Hạt hình thuôn dài cỡõ 4 mm, rộng

3 mm, mặt bên và mặt lưng có vân và rãnh dạng mạng lưới Quả chín vào khoảng tháng 6 – 8 (Hình 1.8.1)

1.8.3 Phân bố chè đắng Cao Bằng[13], [2]

Cây chè đắng Cao Bằng phân bố ở các huyện Nguyên Bình, Quảng Hòa, Thạch An…

Ilex attenuate Ilex cornuta

Ilex glabra Ilex quercus

Ilex bacciflava Ilex myricoides

Hình 1.6: Một số loài thuộc chi Ilex

Hình 1.8.1: Nhánh, lá và quả của cây chè đắng ở Cao Bằng

1.9 Một số nghiên cứu từ chi Ilex

1.9.1 Các hợp chất đã cô lập được từ chi Ilex

Một số hợp chất triterpene, triterpenoid glycoside, triterpene saponin đã

được cô lập từ lá của các loài cây thuộc chi Ilex:

- Các hợp chất triterpene[30],[46] như: ursolic acid (1); 23-hydroxyursolic acid

(2); 3β-O-acetylursolic acid (3); 27-trans-p-coumaroyloxyursolic acid (4);

- Các hợp chất ilekudinol và ulmoidol[46],[50] như: ilekudinol A (6);

ilekudinol B (7); ilekudinol C (8); ulmoidol (9); α-kudinlactone (10);

β-kudinlactone (11)

- Các hợp chất triterpenoid glycoside [30], [50] như: kudinoside D (12); kudinoside

E (13); kudinoside F (14); kudinoside H (15); kudinoside G (16), kudinoside 9 (17); kudinoside 10 (18); affinoside (19); buxifolioside I (20); buxifolioside II (21)

- Các hợp chất triterpene saponin [31], [49] như: ilekudinoside K (22); ilekudinoside

L (23); ilekudinoside M (24); ilekudinoside N (25); ilekudinoside O (26); ilekudinoside P (27); ilekudinoside Q (28); ilekudinoside R (29); ilekudinoside S (30)

O HO

HO HO

O Ara Glc

C

O HO

O

Ara Rha

HO

24

1.9.2 Một số nghiên cứu ở Việt Nam trên cây chè đắng Cao Bằèng

 Nông Văn Hai và các cộng sự[10] đã định lượng được các nhóm chất có trong lá chè đắng Cao Bằng là: saponin toàn phần 5,1 – 5,5 %; flavonoid toàn

phần 0,5 – 0,6 %; polysaccharide toàn phần 2,8 – 3,4 %; carotenoid (tính theo ß-

carotene) 5,0 – 5,8 %

 Nguyễn Văn Đậu và Lê Ngọc Thức[8] đã cô lập và nhận danh được hai hợp chất là quercetin và dihydrocaffeic acid

 Vũ Anh Thơ và Trần Lê Quan[23] đã cô lập và nhận danh được các hợp

chất kudinoside A (31), kudinoside C (32), kudinoside D (12), kudinoside E (13) và latifoloside G (33)

1.10 Công dụng và các dạng sản phẩm trên thị trường của cây chè đắng Cao Bằng[1],[79]

1.10.1 Công dụng

Lá non và búp được sao thành chè dùng để uống Nước chè đắng trong hơn nước chè xanh; nó có vị đắng ngọt, tính mát

 Làm trí óc minh mẫn và mắt sáng, ngăn ngừa chức năng suy não

 Giải độc

 Giải cơn khát, giải nhiệt

 Trị các chứng bệnh thường gặp như cảm lạnh, ngứa ngáy mắt, mắt đỏ và nhức đầu

 Giảm ho nên chè đắng được dùng để trị bệnh viêm cuống phổi

 Giúp lợi tiểu

 Kích thích tiêu hóa làm ăn ngon

 Tăng cường tuần hoàn máu, giảm huyết áp, hạ thấp lipid của máu, ngăn chặn suy tim

 Không làm khó ngủ như trà thường mà giúp ngủ ngon

 Giải độc do vi khuẩn, kháng viêm

 Giã rượu

 Kéo dài tuổi thọ nếu uống thường xuyên với liều dùng thích hợp

1.10.2 Một số bài thuốc được dùng trong dân gian

- Chữa bệnh cảm nắng, sốt cao:

Chè đắng 10 g Sắc nước uống

- Chữa bệnh viêm họng:

* Chè đắng 10 g và cát cánh 6 g Sắc nước uống

* Chè đắng 10 g và la hán quả 6 g Sắc nước uống

- Chữa bệnh lỵ, viêm dạ dày cấp tính:

Chè đắng 10 g và phượng vĩ thảo 30 g Sắc nước uống

- Chữa bỏng lửa:

Chè đắng không kể liều lượng đem nấu nước, để nguội Dùng xoa

- Chữa bệnh đầu váng hoa mắt:

1.10.3 Các dạng sản phẩm trên thị trường

Lá chè đắng bán trên thị trường thường có dạng:

- Lá chè non cuốn lại khi sấy khô giống cây đinh (Hình 1.10.1)

- Lá chè có dạng cuộn khi sấy khô (Hình 1.10.2)

Hình 1.10.1: Lá chè đắng sau khi sấy khô giống cây đinh

Hình 1.10.2: Lá chè đắng sau khi sấy khô có dạng cuộn

1.11 Hoạt tính sinh học của dịch chiết lá chè đắng

 Trên thế giới

- Các nhà khoa học Trung Quốc[46] đã trích cao methanol từ lá cây Ilex kudincha và tiến hành thử hoạt tính sinh học trên protein lấy ở gan của chuột Kết

quả cho thấy cao methanol có khả năng ức chế Acyl CoA Cholesteryl Acyl Transferase (ACAT), ứng dụng trong việc chữa trị bệnh xơ vữa động mạch và bệnh béo phì

- Năm 2004, các nhà khoa học ở Brazil[30] thử nghiệm in vitro hoạt tính

chống lại bệnh trùng mũi khoan (antitrypanosomal) của các hợp chất cô lập từ

cây Ilex affinis và Ilex buxifolia

- Các hợp chất asprellic acid[70] cô lập từ cây Ilex asprella được thử nghiệm

in vitro cho thấy có hoạt tính ức chế rất hiệu quả trên các dòng ung thư ở người

như u hắc tố, u bạch cầu

- Dịch nước chiết từ lá của cây Ilex paraguariensis[35] đem thử nghiệm trên chuột, cho biết dịch chiết này có khả năng bắt giữ các gốc tự do (gốc hydroxyl, hydrogen peroxide và superoxide anion) rất có hiệu quả, giúp cơ thể chống lại quá trình oxy hóa

 Ở Việt Nam

- Lương Thị Hồng Vân và cộng sự[27] đã nghiên cứu tác dụng của dịch chiết lá cây chè đắng Cao Bằng đối với nhiễm sắc thể của chuột nhắt trắng bị nhiễm độc 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Dịch chiết này có khả năng làm giảm tác động, khoảng 20 – 40 %, của 2,4-D lên dòng bạch cầu, nhất là bạch cầu

đa nhân và bạch cầu lympho Dịch chiết có khả năng giảm bớt sự tác hại của

2,4-D đến men serum glutamyl oxaloacetate amino transferase

- Bùi Thị Bằng và cộng sự[3] đã nghiên cứu tác dụng chống viêm gan và ức chế chống xơ gan của chế phẩm saponin toàn phần (SF) chiết xuất từ lá chè đắng thu hái

ở Cao Bằng Kết quả cho thấy SF có tác dụng bảo vệ gan và ức chế tạo collagen tương đương với chế phẩm cugama chiết từ cúc gai và mã đề Ngoài ra, chế phẩm từ lá chè đắng Cao Bằng còn có tác dụng chống oxy hóa và lợi mật

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM CÂY CHÈ

2.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

 Các mẫu chè (TB14, PH1, LD97 và TB18) gồm một tôm (búp lá) và một hoặc hai lá được thu hái tại vườn nghiên cứu của Khoa Trồng trọt, trường Trung học Kỹ thuật và Dạy nghề Bảo Lộc – thị xã Bảo Lộc – tỉnh Lâm Đồng Sau đó, mẫu được đem phơi ở nhiệt độ phòng đến trọng lượng không đổi trong khoảng 10 – 20 ngày, tùy theo thời điểm thu hái chè vào mùa mưa hay mùa khô và kế tiếp xay nhuyễn làm bột nghiên cứu

 Chè Tâm Châu thu từ nhà máy Tâm Châu – Lộc An – Bảo Lộc – Lâm Đồng Chè dạng se sợi khô, đóng gói vào tháng 5/2005

 Chè Thái Bảo thu từ nhà máy 1-5 – khu 4 – phường B’lao – Bảo Lộc – Lâm Đồng Chè dạng se sợi khô, đóng gói vào tháng 5/2005

 Hóa chất

- Acetonitrile (Labscan) dùng cho sắc ký lỏng

- Formic acid (Merck) dùng cho phân tích

- Methanol (Merck) dùng cho sắc ký lỏng

- Nước cất khử ion hai lần

- Gallic acid (Ga) chất chuẩn của Sigma và có độ tinh khiết 100 %

- Catechin (C) chất chuẩn của Sigma và có độ tinh khiết 98 %

- Epicatechin (EC) chất chuẩn của Sigma và có độ tinh khiết 100 %

- Epicatechin gallate (ECg) chất chuẩn của Sigma và có độ tinh khiết 98 %

- Epigallocatechin (EGC) chất chuẩn của Sigma và có độ tinh khiết 98 %

- Epigallocatechin gallate (EGCg) chất chuẩn của Sigma và có độ tinh khiết 80 %

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu[66]

 Các bioflavonoid được ly trích bằng nước khử ion kết hợp với phương pháp ngâm dầm có hỗ trợ siêu âm (máy hiệu Branson 2510)

 Định lượng bioflavonoid bằng phương pháp sắc lỏng ghép khối phổ (LC/MS – 2010A của Shimadzu gồm máy sắc ký lỏng đơn khối CHT 2010 và đầu dò khối phổ một tứ cực MS 2010A )

2.2 Pha động và dung dịch chuẩn gốc

- Pha động

 A: Nước cất hai lần và khử ion (0,1 % HCOOH)

 B: Acetonitrile

- Dung dịch chuẩn gốc

Cân 5 mg mỗi chất chuẩn nhóm catechin vào bình định mức dung tích 10 ml Hòa tan và định mức đến vạch bằng acetonitrile, để có dung dịch chuẩn gốc 500 ppm Cân 6 mg gallic acid cho vào bình định mức dung tích 100 ml Hòa tan và định mức đến vạch bằng acetonitrile để có dung dịch chuẩn gốc 60 ppm

- Dung dịch chuẩn

 Lấy 0,1 ml của mỗi dung dịch chuẩn gốc catechin (C, EC, ECg, EGC, EGCg) cho vào bình định mức 50 ml, định mức đến vạch bằng acetonitrile, được dung dịch chuẩn 1 ppm

Tiến hành tương tự lấy 0,5 ml; 1 ml; 1,5 ml; 2 ml; 2,5 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc và định mức đến 50 ml bằng acetonitrile, thu được các dung dịch chuẩn

cĩ nồng độ lần lượt là 5 ppm; 10 ppm; 15 ppm; 20 ppm; 25 ppm

 Lấy 0,5 ml dung dịch chuẩn gốc gallic acid cho vào bình định mức dung tích 50 ml, định mức bằng acetonitrile, được dung dịch chuẩn 0,6 ppm

Tiến hành tương tự lấy 1 ml; 2 ml; 3 ml; 5 ml; 10 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc gallic acid và định mức đến 50 ml với acetonitrile, thu được các dung dịch chuẩn cĩ nồng độ lần lượt là 1,2 ppm; 2,4 ppm; 3,6 ppm; 6 ppm và 10 ppm

2.3 Trích bioflavonoid[66]

Ly trích bioflavonol được thực hiện theo tài liệu Standard Operating Protocol

- Đầu tiên, ổn nhiệt cho bể siêu âm ở 56oC

- Cân 50 mg bột chè cho vào bình định mức 50 ml, sau đó cho vào bình khoảng 35 ml nước cất đã khử ion (0,1 % HCOOH) Đem bình đánh siêu âm ở nhiệt độ 56 – 62oC trong 60 phút; đem ra ngoài để nguội đến nhiệt độ phòng và thêm nước cất đã khử ion vào để đạt định mức 50 ml Dung dịch sau khi lọc qua màng lọc 0,45 μm được khảo sát bằng máy LC/MS một tứ cực

2.4 Các thông số của hệ thống LC/MS

- Cột sắc ký lỏng: Waters Spherisorb S5ODS2 150 mm x 2 mm x 5 μm

- Tối ưu nguồn ion hóa[22]

Các hợp chất Ga, C, EC, ECg, EGC và EGCg có khối lượng phân tử lần lượt là 170, 290, 290, 442, 306 và 458 amu Tất cả các bioflavonoid trên đều có khối lượng phân tử vừa phải nên về mặt lý thuyết có thể khảo sát các hợp chất này bằng máy khối phổ với nguồn ion hóa là ESI và APCI đều được

Tuy nhiên, khi khảo sát sự tạo ion với nguồn ion hóa APCI thì kết quả thu được không đạt yêu cầu, với lý do dưới tác dụng nhiệt độ cao của APCI, các catechin bị phân hủy