- E. K. Mgaloblisvili và Weisburger[39] đã xác định ảnh hưởng của nước chè xanh tới chức năng của hệ thống tim mạch, chức năng hô hấp, hệ thống điều tiết máu.
- Các nhà khoa học Nhật Bản[74] chứng minh chè có tác dụng chống được chất đồng vị phóng xạ Stronti (Sr) 90.
- Theo Hisrota Fujiiki[37], ở Nhật, chè xanh được xem như một loại thức uống do trong chè có hàm lượng epigallocatechin gallate (EGCg) cao, có khả năng ngăn ngừa bệnh ung thư.
- EGCg[36] có khả năng ngăn ngừa sự oxy hóa trong huyết thanh của người. - EGCg[41] trong lá chè xanh có khả năng ngăn ngừa dấu hiệu Wnt trong quá trình xâm lấn của tế bào ung thư vú.
1.5.3 Nghiên cứu về dược tính ở Việt Nam
- Đề tài nghiên cứu của Phạm Thiện Ngọc[25] nhằm chiết xuất polyphenol từ lá chè xanh Việt Nam, đánh giá tác dụng của bột polyphenol trên sự rối loạn chuyển hóa lipid ở thỏ đã cho uống cholesterol và trên trạng thái chống oxy hóa ở thỏ bị chiếu xạ.
- Đề tài nghiên cứu của Nguyễn Thị Hà[11] nhằm đánh giá tác dụng của polyphenol trong lá chè xanh Việt Nam trên sự chuyển hóa lipid và trạng thái chống oxy hóa trong máu chuột cống trắng bị gây đái đường thực nghiệm.
- Nghiên cứu quy trình chiết xuất EGCg từ chè xanh và thử nghiệm tác dụng bảo vệ gan của tác giả Trần Lê Tuyết Châu[5] là đề tài nghiên cứu cơ bản năm 2008 và đã nghiệm thu vào tháng 9/2010 với qui trình ly trích như sau:
CÂY CHÈ ĐẮNG
1.6 Đặc điểm thực vật của cây chè đắng[6],[77],[78]
Cây chè đắng thuộc họ Nhựa ruồi hay họ Trâm Bùi (Aquifoliaceae).
Đặc điểm thực vật họ Trâm Bùi: lá thường có răng cưa, mọc vòng có thể có các bướu li ti ở mặt sau phiến lá, cụm hoa thường mọc dưới tán, quả hình cầu, có chỏm là núm nhụy màu đen, có cuống, bên trong chứa vài hạch (Hình 1.6.1).
Trước đây, họ Aquifoliaceae được chia thành hai chi:
- Chi Nemopanthus chỉ gồm một loài Nemopanthus mucronatus. Loài này có đài hoa ngắn, cánh hoa hẹp và trên cơ sở tế bào học nó là thể tứ bội (Hình 1.6.2).
- Chi Ilex[7] có khoảng 400 – 600 loài. Chi Ilex thuộc thể lưỡng bội, phân bố chủ yếu ở châu Á, châu Âu, Bắc Phi, Bắc Mỹ và Nam Mỹ trừ châu Úc và Tây Bắc Mỹ. Hoa nhỏ thường có màu trắng có khi vàng hay lục (Hình 1.6.3).
Hiện nay, theo kết quả phân tích phân tử thì chi Nemopanthus được nhập vào chi Ilex, với tên gọi là Ilex mucronata[76].
1.7 Phân bố chi Ilex ở Việt Nam[12], [26] Chi Ilex ở Việt Nam có khoảng 40 loài.
Chè tươi nguyên liệu Diệt men Nghiền nhỏ Trích ly Sản phẩm Tinh chế Dịch chiết Lọc
Bảng 1.7: Một số loài thuộc chi Ilex ở Việt Nam
Tên khoa học Tên thường Phân bố Công dụng
Ilex cymosa
Bùi ba vỏ, Bùi núi, Bùi tụ tán
Thanh Hóa, Kontum, Gia Lai, Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu
Gỗ dân dụng
Ilex eugeniifolia Bùi lá trâm
Đà Nẳng, Lâm Đồng, Đồng Nai, Phú Quốc, Côn Đảo
Gỗ xây dựng và đồ mộc
Ilex ficoidea Bùi da, Bùi
sung Bắc Cạn, Thái Nguyên, Hà Tây, Hòa Bình Gỗ bền làm nhà và đồ gia dụng Ilex godajam Bùi gò dăm, Bùi tía, Mộc hương lan, Rụt
Thanh Hóa, Kontum, Ninh Thuận, Đồng Nai
Vỏ cây chữa đau bụng, khó tiêu, sốt rét, trúng độc thức ăn Ilex kaushue Chè đắng, Khổ đinh tràø, Ché khôm
Lào Cai, Cao Bằng, Hòa Bình, Ninh Bình
Lá, búp dùng để uống tác dụng thanh nhiệt, giải độc
Ilex marcrocarpa Bùi trái to Lào Cai, Đà Nẳng, Khánh Hòa, Lâm Đồng
Gỗ dùng đóng đồ gia dụng
Ilex rotunda Bùi lá tròn
Quảng Ninh, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Ninh Bình, Thanh Hóa, Đà Nẳng
Gỗ dùng làm đồ gia dụng, vỏ sắc nước uống chữa cảm mạo, ho, loét dạ dày, viêm ruột
Tên khoa học Tên thường Phân bố Công dụng
Ilex vidiris Bùi xanh,
Nhựa ruồi lá nhỏ
Lạng Sơn, Quảng Ninh, Thái Nguyên, Bắc Ninh, Hà Tây, Lâm Đồng, Quảng Trị
Rễ sắc uống chữa cảm, sưng họng, lá tươi giã đắp chữa mụn nhọt, vết thương bầm tím
Ilex wallichi Bùi wallich
Đà Nẳng, KonTum, Lâm Đồng, Bình Phước, Bình Dương, Đồng Nai
Gỗ gia dụng
1.8 Đặc điểm thực vật của cây chè đắng ở Cao Bằng 1.8.1 Về tên khoa học[13] 1.8.1 Về tên khoa học[13]
Năm 1999, các nhà thực vật học đã dựa vào một số đặc điểm để phân biệt hai loài Ilex latifolia và Ilex kaushue như sau:
Ilex latifolia: cành và cuống hoa hoàn toàn không có lông, phiến lá dài 8 – 17 cm, rộng 4,5 – 7,5 cm, gân bên chỉ rõ ở mặt dưới, không rõ ở mặt trên, cụm hoa dạng tán giả gần như không có cuống. Đài của hoa đực hình đấu, nhị dài bằng cánh hoa.
Ilex kaushue: cành và cuống hoa có lông tơ thưa, phiến lá dài 13 – 16 cm, rộng 5 – 6 cm, gân bên rõ cả ở hai mặt lá. Cụm hoa mọc tụm là dạng chùm giả với trục, cụm hoa dài gần 1 cm, đài của hoa đực hình đĩa, nhị ngắn hơn cánh hoa.
Từ sự phân biệt đó, hiện nay tên khoa học của cây chè đắng ở Cao Bằng được GS. TSKH. Nguyễn Tiến Bân xác định là Ilex kaushue S. Y. Hu.
1.8.2 Về đặc điểm thực vật của cây chè đắng ở Cao Bằng[7], [2]
Cây gỗ cao khoảng 6 – 20 m, đường kính thân khoảng 20 – 60 cm, cũng có cây cổ thụ cao đến 35 m, đường kính thân 120 cm, cành khô màu nâu xám không lông. Lá dài khoảng 8 – 17 cm, rộng 4,5 – 7,5 cm, mọc so le, dai và mỏng, hình thuôn dạng bầu dục hay hình mác ngược. Những lá ở chồi non có thể dài tới 21 – 31 cm và rộng 9 – 13 cm, mặt trên màu lục sẩm, mặt dưới màu lục nhạt, gân giữa lõm, cuống lá dài 1,5 – 2,0 cm. Hoa đơn tính, họp thành cụm hoa ở nách lá. Cụm hoa đực thường gồm: 20 – 30 hoa, đài hoa đực hình đĩa với 4 cánh hoa, 4 nhị ngắn hơn hoặc gần bằng cánh hoa. Cụm hoa cái gồm 3 – 9 hoa có cuống thô dài 4 – 6 mm. Cây ra hoa vào tháng 2 – 4. Quả hình cầu, đường kính 1,0 – 1,2 cm, không có lông khi chín màu đỏ, chứa 3 – 4 hạt. Hạt hình thuôn dài cỡõ 4 mm, rộng 3 mm, mặt bên và mặt lưng có vân và rãnh dạng mạng lưới. Quả chín vào khoảng tháng 6 – 8 (Hình 1.8.1).
1.8.3 Phân bố chè đắng Cao Bằng[13], [2]
Cây chè đắng Cao Bằng phân bố ở các huyện Nguyên Bình, Quảng Hòa, Thạch An….
Ilex glabra Ilex quercus
Ilex bacciflava Ilex myricoides
Hình 1.6: Một số loài thuộc chi Ilex
1.9 Một số nghiên cứu từ chi Ilex
1.9.1 Các hợp chất đã cô lập được từ chi Ilex
Một số hợp chất triterpene, triterpenoid glycoside, triterpene saponin đã được cô lập từ lá của các loài cây thuộc chi Ilex:
- Các hợp chất triterpene[30],[46] như: ursolic acid (1); 23-hydroxyursolic acid
(2); 3β-O-acetylursolic acid (3); 27-trans-p-coumaroyloxyursolic acid (4); 27-cis- p-coumaroyloxyursolic acid (5). COOH HO 1 COOH HO 2 CH2OH COOH 3 CH3COO
- Các hợp chất ilekudinol và ulmoidol[46],[50] như: ilekudinol A (6); ilekudinol B (7); ilekudinol C (8); ulmoidol (9); α-kudinlactone (10); β-
- Các hợp chất triterpenoid glycoside [30], [50] như: kudinoside D (12); kudinoside E (13); kudinoside F (14); kudinoside H (15); kudinoside G (16), kudinoside 9 (17); kudinoside 10 (18); affinoside (19); buxifolioside I (20); buxifolioside II (21).
- Các hợp chất triterpene saponin [31], [49] như: ilekudinoside K (22); ilekudinoside L (23); ilekudinoside M (24); ilekudinoside N (25); ilekudinoside O (26); ilekudinoside P (27); ilekudinoside Q (28); ilekudinoside R (29); ilekudinoside S (30).
O HO O Glc C O Rha 22 O C O HO HO O Ara Glc 23 O C O HO O Ara Rha HO 24
1.9.2 Một số nghiên cứu ở Việt Nam trên cây chè đắng Cao Bằèng
Nông Văn Hai và các cộng sự[10] đã định lượng được các nhóm chất có trong lá chè đắng Cao Bằng là: saponin toàn phần 5,1 – 5,5 %; flavonoid toàn phần 0,5 – 0,6 %; polysaccharide toàn phần 2,8 – 3,4 %; carotenoid (tính theo ß- carotene) 5,0 – 5,8 %.
Nguyễn Văn Đậu và Lê Ngọc Thức[8] đã cô lập và nhận danh được hai hợp chất là quercetin và dihydrocaffeic acid.
Vũ Anh Thơ và Trần Lê Quan[23] đã cô lập và nhận danh được các hợp chất kudinoside A (31), kudinoside C (32), kudinoside D (12), kudinoside E (13) và latifoloside G (33).
1.10 Công dụng và các dạng sản phẩm trên thị trường của cây chè đắng Cao Bằng[1],[79]
1.10.1 Công dụng
Lá non và búp được sao thành chè dùng để uống. Nước chè đắng trong hơn nước chè xanh; nó có vị đắng ngọt, tính mát.
Làm trí óc minh mẫn và mắt sáng, ngăn ngừa chức năng suy não.
Giải độc.
Giải cơn khát, giải nhiệt.
Trị các chứng bệnh thường gặp như cảm lạnh, ngứa ngáy mắt, mắt đỏ và nhức đầu.
Giảm ho nên chè đắng được dùng để trị bệnh viêm cuống phổi.
Giúp lợi tiểu.
Kích thích tiêu hóa làm ăn ngon.
Tăng cường tuần hoàn máu, giảm huyết áp, hạ thấp lipid của máu, ngăn chặn suy tim.
Không làm khó ngủ như trà thường mà giúp ngủ ngon.
Giải độc do vi khuẩn, kháng viêm.
Giã rượu.
Kéo dài tuổi thọ nếu uống thường xuyên với liều dùng thích hợp.
1.10.2 Một số bài thuốc được dùng trong dân gian
- Chữa bệnh cảm nắng, sốt cao: Chè đắng 10 g. Sắc nước uống. - Chữa bệnh viêm họng:
* Chè đắng 10 g và cát cánh 6 g. Sắc nước uống. * Chè đắng 10 g và la hán quả 6 g. Sắc nước uống. - Chữa bệnh lỵ, viêm dạ dày cấp tính:
Chè đắng 10 g và phượng vĩ thảo 30 g. Sắc nước uống. - Chữa bỏng lửa:
Chè đắng không kể liều lượng đem nấu nước, để nguội. Dùng xoa. - Chữa bệnh đầu váng hoa mắt:
1.10.3 Các dạng sản phẩm trên thị trường
Lá chè đắng bán trên thị trường thường có dạng:
- Lá chè non cuốn lại khi sấy khô giống cây đinh (Hình 1.10.1) - Lá chè có dạng cuộn khi sấy khô (Hình 1.10.2)
Hình 1.10.1: Lá chè đắng sau khi sấy khô giống cây đinh
Hình 1.10.2: Lá chè đắng sau khi sấy khô có dạng cuộn
1.11 Hoạt tính sinh học của dịch chiết lá chè đắng
Trên thế giới
- Các nhà khoa học Trung Quốc[46] đã trích cao methanol từ lá cây Ilex kudincha và tiến hành thử hoạt tính sinh học trên protein lấy ở gan của chuột. Kết quả cho thấy cao methanol có khả năng ức chế Acyl CoA Cholesteryl Acyl Transferase (ACAT), ứng dụng trong việc chữa trị bệnh xơ vữa động mạch và bệnh béo phì.
- Năm 2004, các nhà khoa học ở Brazil[30] thử nghiệm in vitro hoạt tính chống lại bệnh trùng mũi khoan (antitrypanosomal) của các hợp chất cô lập từ cây Ilex affinis và Ilex buxifolia.
- Các hợp chất asprellic acid[70] cô lập từ cây Ilex asprella được thử nghiệm
in vitro cho thấy có hoạt tính ức chế rất hiệu quả trên các dòng ung thư ở người như u hắc tố, u bạch cầu.
- Dịch nước chiết từ lá của cây Ilex paraguariensis[35] đem thử nghiệm trên chuột, cho biết dịch chiết này có khả năng bắt giữ các gốc tự do (gốc hydroxyl, hydrogen peroxide và superoxide anion) rất có hiệu quả, giúp cơ thể chống lại quá trình oxy hóa.
Ở Việt Nam
- Lương Thị Hồng Vân và cộng sự[27] đã nghiên cứu tác dụng của dịch chiết lá cây chè đắng Cao Bằng đối với nhiễm sắc thể của chuột nhắt trắng bị nhiễm độc 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid). Dịch chiết này có khả năng làm giảm tác động, khoảng 20 – 40 %, của 2,4-D lên dòng bạch cầu, nhất là bạch cầu đa nhân và bạch cầu lympho. Dịch chiết có khả năng giảm bớt sự tác hại của 2,4- D đến men serum glutamyl oxaloacetate amino transferase.
- Bùi Thị Bằng và cộng sự[3] đã nghiên cứu tác dụng chống viêm gan và ức chế chống xơ gan của chế phẩm saponin toàn phần (SF) chiết xuất từ lá chè đắng thu hái ở Cao Bằng. Kết quả cho thấy SF có tác dụng bảo vệ gan và ức chế tạo collagen tương đương với chế phẩm cugama chiết từ cúc gai và mã đề. Ngoài ra, chế phẩm từ lá chè đắng Cao Bằng còn có tác dụng chống oxy hóa và lợi mật.
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM CÂY CHÈ
2.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu
Các mẫu chè (TB14, PH1, LD97 và TB18) gồm một tôm (búp lá) và một hoặc hai lá được thu hái tại vườn nghiên cứu của Khoa Trồng trọt, trường Trung học Kỹ thuật và Dạy nghề Bảo Lộc – thị xã Bảo Lộc – tỉnh Lâm Đồng. Sau đó, mẫu được đem phơi ở nhiệt độ phòng đến trọng lượng không đổi trong khoảng 10 – 20 ngày, tùy theo thời điểm thu hái chè vào mùa mưa hay mùa khô và kế tiếp xay nhuyễn làm bột nghiên cứu.
Chè Tâm Châu thu từ nhà máy Tâm Châu – Lộc An – Bảo Lộc – Lâm Đồng. Chè dạng se sợi khô, đóng gói vào tháng 5/2005.
Chè Thái Bảo thu từ nhà máy 1-5 – khu 4 – phường B’lao – Bảo Lộc – Lâm Đồng. Chè dạng se sợi khô, đóng gói vào tháng 5/2005.
Hóa chất
- Acetonitrile (Labscan) dùng cho sắc ký lỏng. - Formic acid (Merck) dùng cho phân tích. - Methanol (Merck) dùng cho sắc ký lỏng. - Nước cất khử ion hai lần.
- Gallic acid (Ga) chất chuẩn của Sigma và có độ tinh khiết 100 % . - Catechin (C) chất chuẩn của Sigma và có độ tinh khiết 98 %. - Epicatechin (EC) chất chuẩn của Sigma và có độ tinh khiết 100 %.
- Epicatechin gallate (ECg) chất chuẩn của Sigma và có độ tinh khiết 98 %. - Epigallocatechin (EGC) chất chuẩn của Sigma và có độ tinh khiết 98 %.
2.1.2 Phương pháp nghiên cứu[66]
Các bioflavonoid được ly trích bằng nước khử ion kết hợp với phương pháp ngâm dầm có hỗ trợ siêu âm (máy hiệu Branson 2510).
Định lượng bioflavonoid bằng phương pháp sắc lỏng ghép khối phổ (LC/MS – 2010A của Shimadzu gồm máy sắc ký lỏng đơn khối CHT 2010 và đầu dò khối phổ một tứ cực MS 2010A ).
2.2 Pha động và dung dịch chuẩn gốc - Pha động - Pha động
A: Nước cất hai lần và khử ion (0,1 % HCOOH).
B: Acetonitrile.
- Dung dịch chuẩn gốc
Cân 5 mg mỗi chất chuẩn nhóm catechin vào bình định mức dung tích 10 ml. Hòa tan và định mức đến vạch bằng acetonitrile, để có dung dịch chuẩn gốc 500 ppm.
Cân 6 mg gallic acid cho vào bình định mức dung tích 100 ml. Hòa tan và định mức đến vạch bằng acetonitrile để có dung dịch chuẩn gốc 60 ppm.
- Dung dịch chuẩn
Lấy 0,1 ml của mỗi dung dịch chuẩn gốc catechin (C, EC, ECg, EGC, EGCg) cho vào bình định mức 50 ml, định mức đến vạch bằng acetonitrile, được dung dịch chuẩn 1 ppm.
Tiến hành tương tự lấy 0,5 ml; 1 ml; 1,5 ml; 2 ml; 2,5 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc và định mức đến 50 ml bằng acetonitrile, thu được các dung dịch chuẩn cĩ nồng độ lần lượt là 5 ppm; 10 ppm; 15 ppm; 20 ppm; 25 ppm.
Lấy 0,5 ml dung dịch chuẩn gốc gallic acid cho vào bình định mức dung tích 50 ml, định mức bằng acetonitrile, được dung dịch chuẩn 0,6 ppm.
Tiến hành tương tự lấy 1 ml; 2 ml; 3 ml; 5 ml; 10 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc gallic acid và định mức đến 50 ml với acetonitrile, thu được các dung dịch chuẩn cĩ nồng độ lần lượt là 1,2 ppm; 2,4 ppm; 3,6 ppm; 6 ppm và 10 ppm.
2.3 Trích bioflavonoid[66]
Ly trích bioflavonol được thực hiện theo tài liệu Standard Operating Protocol. - Đầu tiên, ổn nhiệt cho bể siêu âm ở 56oC.
- Cân 50 mg bột chè cho vào bình định mức 50 ml, sau đó cho vào bình khoảng 35 ml nước cất đã khử ion (0,1 % HCOOH). Đem bình đánh siêu âm ở nhiệt độ 56 – 62oC trong 60 phút; đem ra ngoài để nguội đến nhiệt độ phòng và thêm nước cất đã khử ion vào để đạt định mức 50 ml. Dung dịch sau khi lọc qua màng lọc 0,45 μm được khảo sát bằng máy LC/MS một tứ cực.
2.4 Các thông số của hệ thống LC/MS
- Cột sắc ký lỏng: Waters Spherisorb S5ODS2 150 mm x 2 mm x 5 μm. - Tối ưu nguồn ion hóa[22]
Các hợp chất Ga, C, EC, ECg, EGC và EGCg có khối lượng phân tử lần lượt là 170, 290, 290, 442, 306 và 458 amu. Tất cả các bioflavonoid trên đều có khối