Trên thế giới
- Các nhà khoa học Trung Quốc[46] đã trích cao methanol từ lá cây Ilex kudincha và tiến hành thử hoạt tính sinh học trên protein lấy ở gan của chuột. Kết quả cho thấy cao methanol có khả năng ức chế Acyl CoA Cholesteryl Acyl Transferase (ACAT), ứng dụng trong việc chữa trị bệnh xơ vữa động mạch và bệnh béo phì.
- Năm 2004, các nhà khoa học ở Brazil[30] thử nghiệm in vitro hoạt tính chống lại bệnh trùng mũi khoan (antitrypanosomal) của các hợp chất cô lập từ cây Ilex affinis và Ilex buxifolia.
- Các hợp chất asprellic acid[70] cô lập từ cây Ilex asprella được thử nghiệm
in vitro cho thấy có hoạt tính ức chế rất hiệu quả trên các dòng ung thư ở người như u hắc tố, u bạch cầu.
- Dịch nước chiết từ lá của cây Ilex paraguariensis[35] đem thử nghiệm trên chuột, cho biết dịch chiết này có khả năng bắt giữ các gốc tự do (gốc hydroxyl, hydrogen peroxide và superoxide anion) rất có hiệu quả, giúp cơ thể chống lại quá trình oxy hóa.
Ở Việt Nam
- Lương Thị Hồng Vân và cộng sự[27] đã nghiên cứu tác dụng của dịch chiết lá cây chè đắng Cao Bằng đối với nhiễm sắc thể của chuột nhắt trắng bị nhiễm độc 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid). Dịch chiết này có khả năng làm giảm tác động, khoảng 20 – 40 %, của 2,4-D lên dòng bạch cầu, nhất là bạch cầu đa nhân và bạch cầu lympho. Dịch chiết có khả năng giảm bớt sự tác hại của 2,4- D đến men serum glutamyl oxaloacetate amino transferase.
- Bùi Thị Bằng và cộng sự[3] đã nghiên cứu tác dụng chống viêm gan và ức chế chống xơ gan của chế phẩm saponin toàn phần (SF) chiết xuất từ lá chè đắng thu hái ở Cao Bằng. Kết quả cho thấy SF có tác dụng bảo vệ gan và ức chế tạo collagen tương đương với chế phẩm cugama chiết từ cúc gai và mã đề. Ngoài ra, chế phẩm từ lá chè đắng Cao Bằng còn có tác dụng chống oxy hóa và lợi mật.
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM CÂY CHÈ
2.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu
Các mẫu chè (TB14, PH1, LD97 và TB18) gồm một tôm (búp lá) và một hoặc hai lá được thu hái tại vườn nghiên cứu của Khoa Trồng trọt, trường Trung học Kỹ thuật và Dạy nghề Bảo Lộc – thị xã Bảo Lộc – tỉnh Lâm Đồng. Sau đó, mẫu được đem phơi ở nhiệt độ phòng đến trọng lượng không đổi trong khoảng 10 – 20 ngày, tùy theo thời điểm thu hái chè vào mùa mưa hay mùa khô và kế tiếp xay nhuyễn làm bột nghiên cứu.
Chè Tâm Châu thu từ nhà máy Tâm Châu – Lộc An – Bảo Lộc – Lâm Đồng. Chè dạng se sợi khô, đóng gói vào tháng 5/2005.
Chè Thái Bảo thu từ nhà máy 1-5 – khu 4 – phường B’lao – Bảo Lộc – Lâm Đồng. Chè dạng se sợi khô, đóng gói vào tháng 5/2005.
Hóa chất
- Acetonitrile (Labscan) dùng cho sắc ký lỏng. - Formic acid (Merck) dùng cho phân tích. - Methanol (Merck) dùng cho sắc ký lỏng. - Nước cất khử ion hai lần.
- Gallic acid (Ga) chất chuẩn của Sigma và có độ tinh khiết 100 % . - Catechin (C) chất chuẩn của Sigma và có độ tinh khiết 98 %. - Epicatechin (EC) chất chuẩn của Sigma và có độ tinh khiết 100 %.
- Epicatechin gallate (ECg) chất chuẩn của Sigma và có độ tinh khiết 98 %. - Epigallocatechin (EGC) chất chuẩn của Sigma và có độ tinh khiết 98 %.
2.1.2 Phương pháp nghiên cứu[66]
Các bioflavonoid được ly trích bằng nước khử ion kết hợp với phương pháp ngâm dầm có hỗ trợ siêu âm (máy hiệu Branson 2510).
Định lượng bioflavonoid bằng phương pháp sắc lỏng ghép khối phổ (LC/MS – 2010A của Shimadzu gồm máy sắc ký lỏng đơn khối CHT 2010 và đầu dò khối phổ một tứ cực MS 2010A ).
2.2 Pha động và dung dịch chuẩn gốc - Pha động - Pha động
A: Nước cất hai lần và khử ion (0,1 % HCOOH).
B: Acetonitrile.
- Dung dịch chuẩn gốc
Cân 5 mg mỗi chất chuẩn nhóm catechin vào bình định mức dung tích 10 ml. Hòa tan và định mức đến vạch bằng acetonitrile, để có dung dịch chuẩn gốc 500 ppm.
Cân 6 mg gallic acid cho vào bình định mức dung tích 100 ml. Hòa tan và định mức đến vạch bằng acetonitrile để có dung dịch chuẩn gốc 60 ppm.
- Dung dịch chuẩn
Lấy 0,1 ml của mỗi dung dịch chuẩn gốc catechin (C, EC, ECg, EGC, EGCg) cho vào bình định mức 50 ml, định mức đến vạch bằng acetonitrile, được dung dịch chuẩn 1 ppm.
Tiến hành tương tự lấy 0,5 ml; 1 ml; 1,5 ml; 2 ml; 2,5 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc và định mức đến 50 ml bằng acetonitrile, thu được các dung dịch chuẩn cĩ nồng độ lần lượt là 5 ppm; 10 ppm; 15 ppm; 20 ppm; 25 ppm.
Lấy 0,5 ml dung dịch chuẩn gốc gallic acid cho vào bình định mức dung tích 50 ml, định mức bằng acetonitrile, được dung dịch chuẩn 0,6 ppm.
Tiến hành tương tự lấy 1 ml; 2 ml; 3 ml; 5 ml; 10 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc gallic acid và định mức đến 50 ml với acetonitrile, thu được các dung dịch chuẩn cĩ nồng độ lần lượt là 1,2 ppm; 2,4 ppm; 3,6 ppm; 6 ppm và 10 ppm.
2.3 Trích bioflavonoid[66]
Ly trích bioflavonol được thực hiện theo tài liệu Standard Operating Protocol. - Đầu tiên, ổn nhiệt cho bể siêu âm ở 56oC.
- Cân 50 mg bột chè cho vào bình định mức 50 ml, sau đó cho vào bình khoảng 35 ml nước cất đã khử ion (0,1 % HCOOH). Đem bình đánh siêu âm ở nhiệt độ 56 – 62oC trong 60 phút; đem ra ngoài để nguội đến nhiệt độ phòng và thêm nước cất đã khử ion vào để đạt định mức 50 ml. Dung dịch sau khi lọc qua màng lọc 0,45 μm được khảo sát bằng máy LC/MS một tứ cực.
2.4 Các thông số của hệ thống LC/MS
- Cột sắc ký lỏng: Waters Spherisorb S5ODS2 150 mm x 2 mm x 5 μm. - Tối ưu nguồn ion hóa[22]
Các hợp chất Ga, C, EC, ECg, EGC và EGCg có khối lượng phân tử lần lượt là 170, 290, 290, 442, 306 và 458 amu. Tất cả các bioflavonoid trên đều có khối lượng phân tử vừa phải nên về mặt lý thuyết có thể khảo sát các hợp chất này bằng máy khối phổ với nguồn ion hóa là ESI và APCI đều được.
Tuy nhiên, khi khảo sát sự tạo ion với nguồn ion hóa APCI thì kết quả thu được không đạt yêu cầu, với lý do dưới tác dụng nhiệt độ cao của APCI, các catechin bị phân hủy.
Nguồn ion hóa ESI (-) cho kết quả tốt hơn hẳn (Hình 2.4.1).
Hình 2.4.1: Sắc đồ của sáu chất chuẩn
Kỹ thuật SIM (Selected Ion Monitoring) được áp dụng để làm tăng độ
nhạy và độ chọn lọc. Trong trường hợp này khi qua tứ cực, tất cả các ion đều bị loại, chỉ còn ion muốn định lượng là tồn tại và di chuyển vào đầu dị để được ghi nhận. Vì vậy, chúng tôi chọn kỹ thuật ESI(-)/SIM để định lượng các bioflavonoid. Nhận diện các bioflavonoid dựa vào mũi tín hiệu như: mũi m/z = 169 (Ga), m/z = 289 (C), m/z = 289 (EC), m/z = 441 (ECg), m/z = 305 (EGC) và
m/z = 457 (EGCg).
- Chương trình gradient được trình bày trong bảng 2.4.1
Bảng 2.4.1: Chương trình gradient phân tích các hợp chất bioflavonoid
Thời gian (phút) Thành phần pha động Thể tích (A:B) (%) 0,01 A (nước, 0,1 % HCOOH): B (acetonitrile) 92 : 8
35 A : B 22 : 78
50 A : B 92 : 8
- Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút
- Thể tích dung dịch mẫu tiêm vào cột: 20 μl - Nhiệt độ lò cột: 25oC
2.5 Xử lý định lượng các bioflavonoid
Dựa vào diện tích mũi, có công thức tính (1) sau
(1)
Với X: hàm lượng bioflavonoid có trong mẫu, mg/g.
C0: nồng độ bioflavonoid có trong dung dịch mẫu tính từ đường chuẩn, mg/ml.
V: thể tích định mức mẫu, ml (50 ml). m: khối lượng mẫu phân tích, (50 mg). f: hệ số pha loãng (nếu có).
p: độ tinh khiết của chuẩn (nếu có). Thí dụ:
Đường chuẩn của EGCg là y= 1427560.71 x + 429438 (với y: diện tích mũi; x nồng độ (C0) và diện tích mũi của mẫu chè LD97 tháng 7 là y= 18987727
- Tính Co từ phương trình đường chuẩn x = (18987727 - 429438)/ 142560,71 Co = 13,0 (mg/ml) Thế vào công thức (1) Hàm lượng EGCg = (13,0 * 50)/ 50 = 13,0 mg/g CÂY CHÈØ ĐẮNG CAO BẰNG
2.6 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.6.1 Nguyên liệu
Lá chèø đắng thu hái ở Vườn Cam – thị xã Cao Bằng, tỉnh Cao Bằng. Lá chè đắng được sấy khô và xay nhuyễn thành bột làm nguyên liệu nghiên cứu.
Hóa chất sử dụng:
Petroleum ether phân đoạn 60 – 90oC.
Chloroform của Labscan dùng cho phân tích.
Methanol chưng cất ở 65 – 66oC và làm khan bằng Na2SO4.
Ethanol của Prolabo dùng cho phân tích.
Acetone công nghiệp chưng cất ở 56 – 57oC.
Ethyl acetate công nghiệp chưng cất ở 76 – 77oC.
Silica gel 60A dùng cho sắc ký cột của Merck, kích thước hạt 0,040 – 0,063mm.
Bản mỏng silica gel 60 F254 của Merck.
Thuốc thử iod và dung dịch H2SO4 5 %.
2.6.2 Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp tách chiết: ngâm dầm ở nhiệt độ phòng và tận trích bằng máy chiết Soxhlet.
Sắc ký bản mỏng (TLC).
Sử dụng các phương pháp hóa lý để xác định cấu trúc của hợp chất:
Phổ hồng ngoại được ghi với viên ép KBr trên quang phổ kế hồng ngoại FT- IR Impact – 410 của Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Hà Nội và máy Bruker của trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz (500 MHz cho 1H và 125 MHz cho 13C) của Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Hà Nội.
Phổ LC/MS được ghi trên máy LC/MSD bẫy ion của Agilent của Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Hà Nội và HR – MS được ghi trên máy MicroTOF – QII của Bruker của trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh.
Máy đo nhiệt độ nóng chảy của Prolabo.
2.7 Cô lập các hợp chất từ lá chè đắng Cao Bằng[17]
2.7.1 Điều chế các loại cao bằng phương pháp ngâm dầm và sắc ký cột cô lập một số hợp chất
Từ 500 g bột lá khô đem ngâm kiệt trong (2 lít x 4 lần) ethanol, lọc thu hồi dung môi; thu được 60 g cao thô ethanol.
Lấy 20 g cao thô ethanol sắc ký cột silica gel với hệ dung môi petroleum ether: acetone với độ phân cực tăng dần, thu được 60 phân đoạn (mỗi phân đoạn 100 ml). Sau đó dùng sắc ký bản mỏng (TLC) để gộp các phân đoạn có các vết giống nhau, thu được 13 phân đoạn (IL 1 – IL 13).
Bột chè đắng
- Tận chiết bằng ethanol với phương pháp ngâm dầm. - Thu hồi dung môi
Cao thô ethanol
(IL–ND–EtOH)
- Sắc ký cột silica gelvới petroleum ether: acetone - Thu được 13 phân đoạn ký hiệu từ IL 1 đến IL 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Sơ đồ 2.7.1: Qui trình cô lập một số hợp chất từ cao ethanol trích từ bột chè đắng, bằng phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng Sắc ký cột IL 261 IL 271 IL 6522 Sắc ký cột
2.7.1.1 Khảo sát phân đoạn IL 2, cô lập methyl 3ß-hydroxylup-20(29)-en- 24-oate (IL 261) và lupeol (IL 271)
Sắc ký cột silica gel trên phân đoạn IL 2 (270 mg) với hệ dung môi acetone (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), sau đó dùng TLC gộp các phân đoạn có các vết giống nhau, thu được 8 phân đoạn (IL 21 – IL 28).
Tiếp tục sắc ký cột silica gel trên phân đoạn IL 26 (70 mg), rửa giải bằng hệ dung môi acetone (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), kết hợp với TLC thu được một hợp chất ký hiệu IL 261, là chất bột màu trắng (15 mg) (Sơ đồ 2.7.1).
Tiếp tục sắc ký cột silica gel trên phân đoạn IL 27 (25 mg) với hệ dung môi ethyl acetate (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), kết hợp với TLC thu được một hợp chất ký hiệu là IL 271, là chất bột màu trắng (12 mg) (Sơ đồ 2.7.1).
2.7.1.2 Khảo sát phân đoạn IL 6, cô lập lup-20(29)-en-3ß,24-diol (IL 6522)
Sắc ký cột silica gel trên phân đoạn IL 6 (238 mg) với hệ dung môi ethyl acetate (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), sau đó dùng TLC gộp các phân đoạn có các vết giống nhau, thu được 6 phân đoạn (IL 61 – IL 66). Tiếp tục sắc ký cột silica gel trên phân đoạn IL 65 (40 mg) rửa giải bằng hệ dung môi ethyl acetate (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), kết hợp với TLC thu được 5 phân đoạn (IL 651 – IL 655). Phân đoạn IL 652 được tinh chế lại trong ethyl acetate (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), thu được hợp chất ký hiệu là IL 6522 (7 mg) (Sơ đồ 2.7.1).
2.7.2 Điều chế cao và cô lập hợp chất bằng phương pháp trích Soxhlet
Trích Soxhlet 800 g bột chè đắng với 3,0 lít petroleum ether trong 25 giờ, cô quay thu hồi dung môi, thu được 85 g cao thô petroleum ether. Sau đó bã chè được tiếp tục trích với 3,2 lít chloroform trong 25 giờ, thu được 10,5 g cao thô chloroform. Sau cùng, bã chè được tiếp tục trích với 3,0 lít methanol trong 25 giờ, thu được 20 g cao thô methanol.
Sắc ký cột silica gel trên cao thô petroleum ether (9,8 g), với hệ dung môi ethyl acetate: petroleum ether với độ phân cực tăng dần, sau đó dùng TLC gộp các phân đoạn có các vết giống nhau, thu được 7 phân đoạn (ILE 1 – ILE 7).
Sắc ký cột silica gel trên cao thô chloroform (10,5 g), với hệ dung môi acetone: petroleum ether với độ phân cực tăng dần, sau đó dùng TLC gộp các phân đoạn có các vết giống nhau, thu được 7 phân đoạn (ILC 1 – ILC 7).
Bột chè đắng
- Trích bằng Soxhlet với petroleum ether - Thu hồi dung môi
Cao petroleum ether
(IL–SO– eter dầu hoả)
Bã còn lại
- Sắc ký cột
- Thu được 7 phân đoạn từ ILE 1 đến ILE 7
- Tận trích với chloroform - Thu hồi dung môi
ILE 7 Sắc ký cột ILE 7222 Cao chloroform (IL– SO–CHCl3) - Sắc ký cột
- Thu được 7 phân đoạn từ ILC 1 đến ILC 7 ILC 4 ILC 5 Sắc ký cột ILC 4443 ILC 54321 Bã còn lại - Trích với methanol Cao methanol Bã bỏ
Sơ đồ 2.7.2: Qui trình cô lập một số hợp chất từ cao petroleum ether và cao chloroform trích từ bột chè đắng, bằng phương pháp trích với máy Soxhlet.
2.7.2.1 Khảo sát phân đoạn ILE 7, cô lập 3ß-hydroxylup-20(29)-en-24-oic acid (ILE 7222)
đoạn (ILE 71 – ILE 75). Lặp lại sắc ký cột silica gel phân đoạn ILE 72 (55 mg), rửa giải bằng hệ dung môi acetone (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), kết hợp với TLC thu được 3 phân đoạn (ILE 721 – ILE 723). Phân đoạn ILE 722 kết tinh lại trong acetone, thu được hợp chất ILE 7222 (16 mg) (Sơ đồ 2.7.2).
2.7.2.2 Khảo sát phân đoạn ILC 4, cô lập ursolic acid (ILC 4443)
Sắc ký cột silica gel trên phân đoạn ILC 4 (3,3 g) với hệ dung môi acetone (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), kết hợp với TLC thu được 6 phân đoạn (ILC 41 – ILC 46). Tiếp tục sắc ký cột silica gel phân đoạn ILC 44 (504 mg), rửa giải bằng hệ dung môi chloroform – acetone – petroleum ether (5: 30: 65), kết hợp TLC thu được 4 phân đoạn (ILC 441 – ILC 444). Đem sắc ký cột silica gel phân đoạn ILC 444 (200 mg) với hệ dung môi acetone (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %) kết hợp TLC thu được hợp chất ký hiệu ILC 4443, là chất bột màu trắng (40 mg) (Sơ đồ 2.7.2).
2.7.2.3 Khảo sát phân đoạn ILC 5, cô lập 27-p-(E)-coumaroyloxyursolic acid (ILC 54321)
Sắc ký cột silica gel trên phân đoạn ILC 5 (1,95 g) với hệ dung môi acetone (0 – 30 %): petroleum ether (100 – 70 %), kết hợp với TLC, thu được 8 phân đoạn (ILC 51 – ILC 58). Tiếp tục sắc ký cột silica gel trên phân đoạn ILC 54, rửa giải bằng hệ dung môi ethyl acetate (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), thu được 4 phân đoạn (ILC 541 – ILC 544), dựa vào TLC, gộp hai phân đoạn ILC 542 và ILC 55 có các vết giống nhau và đặt tên chung là ILC 54a. Đem sắc ký cột silica gel phân đoạn ILC 54a với hệ dung môi ethyl acetate (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), kết hợp TLC, thu được 4 phân đoạn (ILC 54a1 – ILC 54a4). Phân đoạn ILC 54a3 kết tủa (78,8 mg).
Sắc ký cột silica gel phân đoạn ILC 54a3 (78,8 mg), rửa giải bằng hệ dung môi ethyl acetate (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %) kết hợp với TLC thu được 5 phân đoạn (ILC 54a31 – ILC 54a35). Khảo sát bằng bảng pha đảo cho thấy ở phân đoạn ILC 54a32 (30 mg) có hai vết; tiếp tục sắc ký cột silica gel phân đoạn này với hệ dung môi acetone (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), thu được