- Pha động
A: Nước cất hai lần và khử ion (0,1 % HCOOH).
B: Acetonitrile.
- Dung dịch chuẩn gốc
Cân 5 mg mỗi chất chuẩn nhóm catechin vào bình định mức dung tích 10 ml. Hòa tan và định mức đến vạch bằng acetonitrile, để có dung dịch chuẩn gốc 500 ppm.
Cân 6 mg gallic acid cho vào bình định mức dung tích 100 ml. Hòa tan và định mức đến vạch bằng acetonitrile để có dung dịch chuẩn gốc 60 ppm.
- Dung dịch chuẩn
Lấy 0,1 ml của mỗi dung dịch chuẩn gốc catechin (C, EC, ECg, EGC, EGCg) cho vào bình định mức 50 ml, định mức đến vạch bằng acetonitrile, được dung dịch chuẩn 1 ppm.
Tiến hành tương tự lấy 0,5 ml; 1 ml; 1,5 ml; 2 ml; 2,5 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc và định mức đến 50 ml bằng acetonitrile, thu được các dung dịch chuẩn cĩ nồng độ lần lượt là 5 ppm; 10 ppm; 15 ppm; 20 ppm; 25 ppm.
Lấy 0,5 ml dung dịch chuẩn gốc gallic acid cho vào bình định mức dung tích 50 ml, định mức bằng acetonitrile, được dung dịch chuẩn 0,6 ppm.
Tiến hành tương tự lấy 1 ml; 2 ml; 3 ml; 5 ml; 10 ml mỗi dung dịch chuẩn gốc gallic acid và định mức đến 50 ml với acetonitrile, thu được các dung dịch chuẩn cĩ nồng độ lần lượt là 1,2 ppm; 2,4 ppm; 3,6 ppm; 6 ppm và 10 ppm.
2.3 Trích bioflavonoid[66]
Ly trích bioflavonol được thực hiện theo tài liệu Standard Operating Protocol. - Đầu tiên, ổn nhiệt cho bể siêu âm ở 56oC.
- Cân 50 mg bột chè cho vào bình định mức 50 ml, sau đó cho vào bình khoảng 35 ml nước cất đã khử ion (0,1 % HCOOH). Đem bình đánh siêu âm ở nhiệt độ 56 – 62oC trong 60 phút; đem ra ngoài để nguội đến nhiệt độ phòng và thêm nước cất đã khử ion vào để đạt định mức 50 ml. Dung dịch sau khi lọc qua màng lọc 0,45 μm được khảo sát bằng máy LC/MS một tứ cực.
2.4 Các thông số của hệ thống LC/MS
- Cột sắc ký lỏng: Waters Spherisorb S5ODS2 150 mm x 2 mm x 5 μm. - Tối ưu nguồn ion hóa[22]
Các hợp chất Ga, C, EC, ECg, EGC và EGCg có khối lượng phân tử lần lượt là 170, 290, 290, 442, 306 và 458 amu. Tất cả các bioflavonoid trên đều có khối lượng phân tử vừa phải nên về mặt lý thuyết có thể khảo sát các hợp chất này bằng máy khối phổ với nguồn ion hóa là ESI và APCI đều được.
Tuy nhiên, khi khảo sát sự tạo ion với nguồn ion hóa APCI thì kết quả thu được không đạt yêu cầu, với lý do dưới tác dụng nhiệt độ cao của APCI, các catechin bị phân hủy.
Nguồn ion hóa ESI (-) cho kết quả tốt hơn hẳn (Hình 2.4.1).
Hình 2.4.1: Sắc đồ của sáu chất chuẩn
Kỹ thuật SIM (Selected Ion Monitoring) được áp dụng để làm tăng độ
nhạy và độ chọn lọc. Trong trường hợp này khi qua tứ cực, tất cả các ion đều bị loại, chỉ còn ion muốn định lượng là tồn tại và di chuyển vào đầu dị để được ghi nhận. Vì vậy, chúng tôi chọn kỹ thuật ESI(-)/SIM để định lượng các bioflavonoid. Nhận diện các bioflavonoid dựa vào mũi tín hiệu như: mũi m/z = 169 (Ga), m/z = 289 (C), m/z = 289 (EC), m/z = 441 (ECg), m/z = 305 (EGC) và
m/z = 457 (EGCg).
- Chương trình gradient được trình bày trong bảng 2.4.1
Bảng 2.4.1: Chương trình gradient phân tích các hợp chất bioflavonoid
Thời gian (phút) Thành phần pha động Thể tích (A:B) (%) 0,01 A (nước, 0,1 % HCOOH): B (acetonitrile) 92 : 8
35 A : B 22 : 78
50 A : B 92 : 8
- Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút
- Thể tích dung dịch mẫu tiêm vào cột: 20 μl - Nhiệt độ lò cột: 25oC
2.5 Xử lý định lượng các bioflavonoid
Dựa vào diện tích mũi, có công thức tính (1) sau
(1)
Với X: hàm lượng bioflavonoid có trong mẫu, mg/g.
C0: nồng độ bioflavonoid có trong dung dịch mẫu tính từ đường chuẩn, mg/ml.
V: thể tích định mức mẫu, ml (50 ml). m: khối lượng mẫu phân tích, (50 mg). f: hệ số pha loãng (nếu có).
p: độ tinh khiết của chuẩn (nếu có). Thí dụ:
Đường chuẩn của EGCg là y= 1427560.71 x + 429438 (với y: diện tích mũi; x nồng độ (C0) và diện tích mũi của mẫu chè LD97 tháng 7 là y= 18987727
- Tính Co từ phương trình đường chuẩn x = (18987727 - 429438)/ 142560,71 Co = 13,0 (mg/ml) Thế vào công thức (1) Hàm lượng EGCg = (13,0 * 50)/ 50 = 13,0 mg/g CÂY CHÈØ ĐẮNG CAO BẰNG
2.6 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.6.1 Nguyên liệu
Lá chèø đắng thu hái ở Vườn Cam – thị xã Cao Bằng, tỉnh Cao Bằng. Lá chè đắng được sấy khô và xay nhuyễn thành bột làm nguyên liệu nghiên cứu.
Hóa chất sử dụng:
Petroleum ether phân đoạn 60 – 90oC.
Chloroform của Labscan dùng cho phân tích.
Methanol chưng cất ở 65 – 66oC và làm khan bằng Na2SO4.
Ethanol của Prolabo dùng cho phân tích.
Acetone công nghiệp chưng cất ở 56 – 57oC.
Ethyl acetate công nghiệp chưng cất ở 76 – 77oC.
Silica gel 60A dùng cho sắc ký cột của Merck, kích thước hạt 0,040 – 0,063mm.
Bản mỏng silica gel 60 F254 của Merck.
Thuốc thử iod và dung dịch H2SO4 5 %.
2.6.2 Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp tách chiết: ngâm dầm ở nhiệt độ phòng và tận trích bằng máy chiết Soxhlet.
Sắc ký bản mỏng (TLC).
Sử dụng các phương pháp hóa lý để xác định cấu trúc của hợp chất:
Phổ hồng ngoại được ghi với viên ép KBr trên quang phổ kế hồng ngoại FT- IR Impact – 410 của Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Hà Nội và máy Bruker của trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz (500 MHz cho 1H và 125 MHz cho 13C) của Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Hà Nội.
Phổ LC/MS được ghi trên máy LC/MSD bẫy ion của Agilent của Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Hà Nội và HR – MS được ghi trên máy MicroTOF – QII của Bruker của trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh.
Máy đo nhiệt độ nóng chảy của Prolabo.
2.7 Cô lập các hợp chất từ lá chè đắng Cao Bằng[17]
2.7.1 Điều chế các loại cao bằng phương pháp ngâm dầm và sắc ký cột cô lập một số hợp chất
Từ 500 g bột lá khô đem ngâm kiệt trong (2 lít x 4 lần) ethanol, lọc thu hồi dung môi; thu được 60 g cao thô ethanol.
Lấy 20 g cao thô ethanol sắc ký cột silica gel với hệ dung môi petroleum ether: acetone với độ phân cực tăng dần, thu được 60 phân đoạn (mỗi phân đoạn 100 ml). Sau đó dùng sắc ký bản mỏng (TLC) để gộp các phân đoạn có các vết giống nhau, thu được 13 phân đoạn (IL 1 – IL 13).
Bột chè đắng
- Tận chiết bằng ethanol với phương pháp ngâm dầm. - Thu hồi dung môi
Cao thô ethanol
(IL–ND–EtOH)
- Sắc ký cột silica gelvới petroleum ether: acetone - Thu được 13 phân đoạn ký hiệu từ IL 1 đến IL 13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Sơ đồ 2.7.1: Qui trình cô lập một số hợp chất từ cao ethanol trích từ bột chè đắng, bằng phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng Sắc ký cột IL 261 IL 271 IL 6522 Sắc ký cột
2.7.1.1 Khảo sát phân đoạn IL 2, cô lập methyl 3ß-hydroxylup-20(29)-en- 24-oate (IL 261) và lupeol (IL 271)
Sắc ký cột silica gel trên phân đoạn IL 2 (270 mg) với hệ dung môi acetone (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), sau đó dùng TLC gộp các phân đoạn có các vết giống nhau, thu được 8 phân đoạn (IL 21 – IL 28).
Tiếp tục sắc ký cột silica gel trên phân đoạn IL 26 (70 mg), rửa giải bằng hệ dung môi acetone (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), kết hợp với TLC thu được một hợp chất ký hiệu IL 261, là chất bột màu trắng (15 mg) (Sơ đồ 2.7.1).
Tiếp tục sắc ký cột silica gel trên phân đoạn IL 27 (25 mg) với hệ dung môi ethyl acetate (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), kết hợp với TLC thu được một hợp chất ký hiệu là IL 271, là chất bột màu trắng (12 mg) (Sơ đồ 2.7.1).
2.7.1.2 Khảo sát phân đoạn IL 6, cô lập lup-20(29)-en-3ß,24-diol (IL 6522)
Sắc ký cột silica gel trên phân đoạn IL 6 (238 mg) với hệ dung môi ethyl acetate (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), sau đó dùng TLC gộp các phân đoạn có các vết giống nhau, thu được 6 phân đoạn (IL 61 – IL 66). Tiếp tục sắc ký cột silica gel trên phân đoạn IL 65 (40 mg) rửa giải bằng hệ dung môi ethyl acetate (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), kết hợp với TLC thu được 5 phân đoạn (IL 651 – IL 655). Phân đoạn IL 652 được tinh chế lại trong ethyl acetate (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), thu được hợp chất ký hiệu là IL 6522 (7 mg) (Sơ đồ 2.7.1).
2.7.2 Điều chế cao và cô lập hợp chất bằng phương pháp trích Soxhlet
Trích Soxhlet 800 g bột chè đắng với 3,0 lít petroleum ether trong 25 giờ, cô quay thu hồi dung môi, thu được 85 g cao thô petroleum ether. Sau đó bã chè được tiếp tục trích với 3,2 lít chloroform trong 25 giờ, thu được 10,5 g cao thô chloroform. Sau cùng, bã chè được tiếp tục trích với 3,0 lít methanol trong 25 giờ, thu được 20 g cao thô methanol.
Sắc ký cột silica gel trên cao thô petroleum ether (9,8 g), với hệ dung môi ethyl acetate: petroleum ether với độ phân cực tăng dần, sau đó dùng TLC gộp các phân đoạn có các vết giống nhau, thu được 7 phân đoạn (ILE 1 – ILE 7).
Sắc ký cột silica gel trên cao thô chloroform (10,5 g), với hệ dung môi acetone: petroleum ether với độ phân cực tăng dần, sau đó dùng TLC gộp các phân đoạn có các vết giống nhau, thu được 7 phân đoạn (ILC 1 – ILC 7).
Bột chè đắng
- Trích bằng Soxhlet với petroleum ether - Thu hồi dung môi
Cao petroleum ether
(IL–SO– eter dầu hoả)
Bã còn lại
- Sắc ký cột
- Thu được 7 phân đoạn từ ILE 1 đến ILE 7
- Tận trích với chloroform - Thu hồi dung môi
ILE 7 Sắc ký cột ILE 7222 Cao chloroform (IL– SO–CHCl3) - Sắc ký cột
- Thu được 7 phân đoạn từ ILC 1 đến ILC 7 ILC 4 ILC 5 Sắc ký cột ILC 4443 ILC 54321 Bã còn lại - Trích với methanol Cao methanol Bã bỏ
Sơ đồ 2.7.2: Qui trình cô lập một số hợp chất từ cao petroleum ether và cao chloroform trích từ bột chè đắng, bằng phương pháp trích với máy Soxhlet.
2.7.2.1 Khảo sát phân đoạn ILE 7, cô lập 3ß-hydroxylup-20(29)-en-24-oic acid (ILE 7222)
đoạn (ILE 71 – ILE 75). Lặp lại sắc ký cột silica gel phân đoạn ILE 72 (55 mg), rửa giải bằng hệ dung môi acetone (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), kết hợp với TLC thu được 3 phân đoạn (ILE 721 – ILE 723). Phân đoạn ILE 722 kết tinh lại trong acetone, thu được hợp chất ILE 7222 (16 mg) (Sơ đồ 2.7.2).
2.7.2.2 Khảo sát phân đoạn ILC 4, cô lập ursolic acid (ILC 4443)
Sắc ký cột silica gel trên phân đoạn ILC 4 (3,3 g) với hệ dung môi acetone (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), kết hợp với TLC thu được 6 phân đoạn (ILC 41 – ILC 46). Tiếp tục sắc ký cột silica gel phân đoạn ILC 44 (504 mg), rửa giải bằng hệ dung môi chloroform – acetone – petroleum ether (5: 30: 65), kết hợp TLC thu được 4 phân đoạn (ILC 441 – ILC 444). Đem sắc ký cột silica gel phân đoạn ILC 444 (200 mg) với hệ dung môi acetone (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %) kết hợp TLC thu được hợp chất ký hiệu ILC 4443, là chất bột màu trắng (40 mg) (Sơ đồ 2.7.2).
2.7.2.3 Khảo sát phân đoạn ILC 5, cô lập 27-p-(E)-coumaroyloxyursolic acid (ILC 54321)
Sắc ký cột silica gel trên phân đoạn ILC 5 (1,95 g) với hệ dung môi acetone (0 – 30 %): petroleum ether (100 – 70 %), kết hợp với TLC, thu được 8 phân đoạn (ILC 51 – ILC 58). Tiếp tục sắc ký cột silica gel trên phân đoạn ILC 54, rửa giải bằng hệ dung môi ethyl acetate (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), thu được 4 phân đoạn (ILC 541 – ILC 544), dựa vào TLC, gộp hai phân đoạn ILC 542 và ILC 55 có các vết giống nhau và đặt tên chung là ILC 54a. Đem sắc ký cột silica gel phân đoạn ILC 54a với hệ dung môi ethyl acetate (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), kết hợp TLC, thu được 4 phân đoạn (ILC 54a1 – ILC 54a4). Phân đoạn ILC 54a3 kết tủa (78,8 mg).
Sắc ký cột silica gel phân đoạn ILC 54a3 (78,8 mg), rửa giải bằng hệ dung môi ethyl acetate (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %) kết hợp với TLC thu được 5 phân đoạn (ILC 54a31 – ILC 54a35). Khảo sát bằng bảng pha đảo cho thấy ở phân đoạn ILC 54a32 (30 mg) có hai vết; tiếp tục sắc ký cột silica gel phân đoạn này với hệ dung môi acetone (0 – 100 %): petroleum ether (100 – 0 %), thu được hợp chất ILC 54a321 = ILC 54321 (15 mg) (Sơ đồ 2.7.2).
2.8 Phương pháp thử hoạt tính sinh học
Các mẫu cao IL–ND–EtOH (Sơ đồ 2.7.1); IL–SO–eter dầu hỏa; IL–SO– CHCl3 (Sơ đồ 2.7.2) được gửi thử hoạt tính sinh học tại Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Viện Hóa học – Viện Các hợp chất thiên nhiên – Hà Nội.
2.8.1 Phương pháp thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial Assay)
Hoạt tính vi sinh vật được kiểm định nhằm đánh giá hoạt tính kháng sinh của mẫu. Mẫu được thực hiện trên các phiến vi lượng 96 giếng (96-well microliter plate) theo phương pháp phân tích của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), MCKan và Kandel (1996)[43].
Các chủng vi sinh vật kiểm định:
+ Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus.
+ Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli và Pseudomonas aeruginosa.
+ Nấm sợi: Aspergillus niger và Fusarium oxysporum.
+ Nấm men: Candida albicans và Saccharomyces cerevisiae.
Các mẫu chứng dương:
+ Ampicilline cho vi khuẩn Gr (+) + Tetracyline cho vi khuẩn Gr (-) + Nystatine cho nấm sợi và nấm men
+ Kết quả đọc khi ủ các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 37oC trong 24 giờ đối với vi khuẩn và ở 30oC trong 48 giờ đối với nấm sợi và nấm men. Kết quả dương tính là nồng độ mà ở đó không có vi sinh vật phát triển. Khi nuôi cấy lại nồng độ này trong môi trường thạch đĩa để kiểm tra thì có giá trị CFU (Colony Forming Unit) < 5.
2.8.2 Thử hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH
Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của Shela, Olga, Elena và cộng sự (2003), dựa trên tính bền của gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) hòa tan trong dung dịch ethanol bão hòa. Khi cho mẫu vào môi trường này, nếu mẫu có khả năng làm trung hòa hoặc bao vây các gốc tự do thì cường độ hấp thu ánh sáng của các gốc tự do DPPH sẽ giảm. Hoạt tính kháng oxy hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thu ánh sáng, đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515 nm.
2.8.3 Thử hoạt tính gây độc tế bào
Mẫu thử hoạt tính được tiến hành dựa theo phương pháp của Skehan và cộng sự (1990)[52], Likhiwitayawuid và cộng sự (1993)[47]. Phương pháp này hiện đang được áp dụng ở Viện nghiên cứu ung thư quốc gia của Mỹ (NIC) và trường Đại học Dược, Đại học Tổng hợp Illinois. Các mẫu có giá trị CS (Cell survival) khả năng sống sót của tế bào nhỏ hơn 50 % thì được chọn để tìm giá trị IC50 là nồng độ ức chế tối thiểu gây độc 50 % tế bào khảo sát.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VAØ THẢO LUẬN CÂY CHÈ
Chúng tôi đã nghiên cứu thành phần bioflavonoid trong các giống chè LD97, PH1, TB14 và TB18 theo thời tiết trong năm từ tháng 4/ 2005 đến tháng 3/ 2006.
3.1 Xây dựng các đường chuẩn(Phụ lục 3.1)
Sáu hợp chất gallic acid (Ga), catechin (C), epicatechin (EC), epicatechin gallate (ECg), epigallocatechin (EGC) và epigallocatechin gallate (EGCg).
3.1.1 Đường chuẩn gallic acid (Ga) (Bảng 3.1.1 và Đồ thị 3.1.1)
Chuẩn Nồng độ (mg/l) Diện tích mũi
1 0,6 8293 2 1,2 17964 3 2,4 37310 4 3,6 56653 5 6,0 95346 6 10,0 159830
Bảng 3.1.1: Số liệu đường chuẩn của Ga Đồ thị 3.1.1: Đường chuẩn Ga
OH OH OH O OH Gallic acid
3.1.2 Đường chuẩn catechin (C) (Bảng 3.1.2 và Đồ thị 3.1.2) Chuẩn * Nồng độ (mg/l) Diện tích mũi 1 0,98 3413 2 4,90 32762 3 9,80 69447 4 14,70 106134 5 19,60 142820 6 24,50 179506 Chuẩn*: đã hiệu chỉnh theo độ tinh khiết 98%
Bảng 3.1.2: Số liệu đường chuẩn của C Đồ thị 3.1.2: Đường chuẩn C
3.1.3 Đường chuẩn epicatechin (EC) (Bảng 3.1.3 và Đồ thị 3.1.3)
Chuẩn Nồng độ (mg/l) Diện tích mũi
1 1 2746150 2 5 11085866 3 10 21510511 4 15 31935157 5 20 42359802 6 25 52784447
Bảng 3.1.3: Số liệu đường chuẩn của EC Đồ thị 3.1.3: Đường chuẩn EC
3.1.4 Đường chuẩn epicatechin gallate (ECg) (Bảng 3.1.4 và Đồ thị 3.1.4) Chuẩn * Nồng độ (mg/l) Diện tích mũi 1 0,98 3139292 2 4,90 12807694 3 9,80 24893196 4 14,70 36978699 5 19,60 49064202 6 24,50 61149704 Chuẩn*: đã hiệu chỉnh theo độ tinh khiết 98%
Bảng 3.1.4: Số liệu đường chuẩn của ECg Đồ thị 3.1.4: Đường chuẩn ECg
3.1.5 Đường chuẩn epigallocatechin (EGC) (Bảng 3.1.5 và Đồ thị 3.1.5)
Chuẩn * Nồng độ (mg/l) Diện tích mũi 1 0,98 1269569 2 4,90 5548531