MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của kinh tế xã hội, nhu cầu thưởng thức hoa và cây cảnh của con người ngày càng được chú trọng. Lily (tên khoa học là Lilium, thuộc họ Liliaceae) là một trong những loài hoa đẹp và có giá trị kinh tế cao. Hoa lily có kiểu dáng sang trọng, màu sắc quyến rũ, hoa thơm, lâu tàn, dễ thu hoạch, dễ bảo quản, dễ vận chuyển và được ưa chuộng ở nhiều nước trên thế giới. Tuy nhiên, cây lily có phổ trồng hẹp, do có xuất xứ ở những vùng ôn đới có nhiệt độ thấp và độ ẩm cao. Bên cạnh đó, hiện nay khí hậu toàn cầu đang ngày càng biến đổi, nhiệt độ tăng lên ảnh hưởng đến nhiều loại cây trồng, làm giảm năng suất cũng như khả năng sinh trưởng và phát triển, thậm chí khiến cây chết là một thách thức lớn cho ngành trồng hoa này. Nước ta nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới, nên ở khu vực phía bắc chỉ mới bước đầu trồng thử nghiệm một số giống lily vụ đông. Hơn nữa, sự thay đổi khí hậu cùng sự nóng lên toàn cầu làm cho việc trồng cây hoa lily này vốn trước đây đã khó lại càng gặp nhiều trở ngại. Các cây hoa lily sinh trưởng, phát triển kém ở điều kiện nhiệt độ cao, thể hiện ở chất lượng cây kém, đặc biệt là hoa xấu, dẫn tới năng suất cũng như chất lượng cây hoa thấp. Chính vì vậy, việc cải tiến, tạo cây giống mới có năng suất và chất lượng cao, đặc biệt là có khả năng sinh trưởng, phát triển ở điều kiện nhiệt độ cao là nhiệm vụ cấp bách với các nhà nghiên cứu (Đặng Văn Đông, 2010). Với nhiều phương pháp hiện đại đang được áp dụng, nhiều giống cây trồng nói chung, cây hoa nói riêng hiện nay đang được phát triển một cách chủ động. Trong chọn tạo giống hoa lily, lai xa là một phương pháp truyền thống đang được kết hợp với một số kỹ thuật hiện đại có thể tạo giống mới đạt được nhiều mục đích khác nhau thông qua việc tái tổ hợp vật chất di truyền của các dòng bố mẹ (VanTuyl et al., 1991,2003; Chi, 2002). Bên cạnh đó, giống hoa lily cũng ngày càng được làm phong phú hơn nhờ tiến hành kỹ thuật chuyển gen. Gen codA mã hóa choline oxidase, tham gia sinh tổng hợp glycin betaine đã được chuyển thành công vào nhiều loài cây trồng và được chứng minh là cây chuyển gen ít nhiều có khả năng chống chịu các điều kiện môi trường bất lợi. Ví dụ như cây Arabidopsis thaliana chuyển gen codA đã được tăng cường khả năng chịu nóng, lạnh và băng giá (Alia et al., 1998; Sakamoto et al., 2000), cây cải bẹ, bạch đàn, cà chua chuyển gen codA cũng tăng cường khả năng chịu mặn và oxy hóa (Prasad et al., 2000a; Ahma et al., 2008; Yu et al., 2009). Ở cây lily, việc chuyển một gen nhằm tăng cường khả năng chịu nóng chưa được thực hiện từ trước đến nay. Chính vì vậy, việc chuyển gen codA vào lily nhằm tăng cường khả năng chống chịu với những điều kiện bất lợi, đặc biệt là nhiệt độ cao là điều cần thiết. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Ứng dụng công nghệ tế bào và công nghệ gen trong đánh giá, chọn và tạo dòng Lilium có khả năng chịu nóng” làm tiền đề cho việc tạo ra các giống hoa lily mới có khả năng chống lại các điều kiện bất thuận của môi trường. Đề tài được thực hiện với các nội dung gồm: (i) Đánh giá nguồn gen lily nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử và công nghệ nuôi cấy mô tế bào; (ii) Tạo dòng lily mới có khả năng chịu nhiệt bằng lai tạo và cứu phôi; (iii) Tạo dòng lily mới có khả năng chịu nhiệt bằng xây dựng và tối ưu hóa quy trình chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily thông qua A. tumefaciens; (iv) Chọn dòng lily in vitro có khả năng chịu nóng. Mục tiêu của đề tài là sử dụng các phương pháp công nghệ sinh học bao gồm công nghệ nuôi cấy mô tế bào và công nghệ gen vào việc đánh giá và chọn tạo các dòng hoa Lilium spp. có khả năng sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ cao với mục tiêu cụ thể là (1) xây dựng được quy trình chuyển gen codA vào lát cát vảy củ lily, (2) ứng dụng kỹ thuật lai và nuôi cấy mô phôi tạo con lai chi lily và (3) đánh giá khả năng chịu nóng in vitro của các dòng lily thương mại, dòng lily chuyển gen và dòng con lai. Những kết quả của luận án góp phần bổ sung cơ sở lý luận và thực tiễn cho việc ứng dụng công nghệ tế bào và công nghệ gen trong tạo giống cây trồng mới nói chung và cây lily nói riêng có khả năng chống chịu điều kiện nhiệt độ cao.
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÙI THỊ THU HƯƠNG ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO VÀ CÔNG NGHỆ GEN TRONG ĐÁNH GIÁ, CHỌN VÀ TẠO DÒNG LILIUM CÓ KHẢ NĂNG CHỊU NÓNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2015 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Bùi Thị Thu Hương ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO VÀ CÔNG NGHỆ GEN TRONG ĐÁNH GIÁ, CHỌN VÀ TẠO DÒNG LILIUM CÓ KHẢ NĂNG CHỊU NÓNG Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Mã số: 62 42 01 12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS.TS. Lê Trần Bình Viện Công nghệ sinh học 2. PGS.TS. Trịnh Khắc Quang Viện Nghiên cứu Rau quả Hà Nội, 2015 i Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày 1 tháng 8 năm 2015 Tác giả Bùi Thị Thu Hương ii Lời cám ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Lê Trần Bình và PGS.TS. Trịnh Khắc Quang đã hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn Viện Công nghệ Sinh học cùng lãnh đạo, cán bộ nghiên cứu của phòng Công nghệ Tế bào thực vật và phòng Công nghệ ADN ứng dụng của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa Học Việt Nam và bộ môn Công nghệ sinh học, viện Nghiên cứu Rau Quả đã tạo điều kiện cho tôi được tiến hành đề tài. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Học viện Nông nghiệp Việt Nam, lãnh đạo và cán bộ thuộc bộ môn Thực vật, khoa Nông học, bộ môn Sinh học, khoa Công nghệ sinh học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài. Hà Nội, ngày 1 tháng 8 năm 2015 Nghiên cứu sinh Bùi Thị Thu Hương iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU STT Ký hiệu Chữ viết tắt 1 A. rhizogenes Agrobacterium rhizogenes 2 A. rubi Agrobacterium rubi 3 A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens 4 ADN Acid Deoxirionucleic 5 AS Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone) 6 BA 6-benzyl adenine 7 Bp Base pair 8 CaMV Cailiflower Mosaic Virus 9 Car Carbenicillin 10 Cefo Cefotaxime 11 Chloram Chloramphenicol 12 CodA Choline oxidase 13 CS Cộng sự 14 CT Công thức 15 ĐC Đối chứng 16 E. coli Escherichia coli 17 EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid 18 Et al Đồng tác giả 19 EtBr Ethidium Bromid 20 GB Glycine betaine 21 Genta Gentamycine 22 GFP Green Fluorescent Protein 23 GUS β-1,4-Glucuronidase 24 Hpt Hygromycine Phosphotransferase 25 HSF Heat shock factor 26 HSPs Heat shock proteins 27 Hyg r Hygromycine resistant iv STT Ký hiệu Chữ viết tắt 28 ISSR Inter Simple Sequence Repeat 29 Kana Kanamycine 30 LB Luria Bertani 31 M Thang Marker chuẩn 32 MAS Marker assisted selection 33 MDA Malondialdehyde 34 Mm Millimolar 35 MS Murashige and Skoog, 1962 36 MT-sHSP Mitochondrial small Heat shock protein 37 MUG 4-methyl-umBelliferyl-β-D-glucoronide 38 µl micro litte 39 µM Micromolar 40 NptII Neomycin Phosphotransferase II 41 PCR Polymerase Chain Reaction 42 Pic Picloram 43 QTL Quantitative trait loci 44 RAPD Random Amplified Polymorphic AND 45 Rifa Rifamycine POD Peroxidase 46 SOD Superoxide dismutase 47 T-ADN Transfer-ADN 48 TAE Tris-acetate-EDTA 49 Ti-plasmid Tumor inducing Plasmid 50 TP Transit Peptide 51 Vir Virulence 52 WT Dòng không chuyển gen 53 X – Gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucoronide 54 α-NAA 1- Naphthaleneacetic acid v MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cám ơn ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU iii MỤC LỤC v DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH x MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tổng quan về cây lily 3 1.1.1. Giới thiệu chung về lily 3 1.1.2. Nguồn gốc, phân bố và đặc điểm thực vật học cây lily 3 1.1.3. Lịch sử phát hiện và tình hình hiện tại của ngành trồng hoa lily 4 1.1.4. Điều kiện ngoại cảnh thích hợp cho cây lily và khả năng chịu nóng của cây lily 5 1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến thực vật 6 1.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến thực vật 6 1.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ cao đến cây lily 8 1.2.3. Biện pháp tăng cường tính chịu nhiệt ở thực vật và lily 9 1.3. Glycine betaine và kỹ thuật làm tăng cường khả năng chịu nóng ở thực vật 15 1.3.1. Giới thiệu chung về glycine betaine 15 1.3.2. Chuyển gen codA tăng cường khả năng chống chịu cho cây trồng 16 1.4. Thành tựu tạo giống lily mới bằng công nghệ tế bào và công nghệ gen 17 1.4.1. Công nghệ tế bào trong tạo giống lily 17 1.4.2. Tình hình ứng dụng công nghệ gen trong tạo giống lily 18 vi CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Vật liệu 21 2.1.1. Thực vật 21 2.1.2. Các chủng vi khuẩn, vector và cặp mồi sử dụng 22 2.1.3. Môi trường nuôi cấy 24 2.1.4. Máy móc và thiết bị 25 2.2. Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1. Các phương pháp sử dụng trong đánh giá vật liệu nghiên cứu 25 2.2.2. Phương pháp tạo giống lily mới có khả năng chịu nóng bằng lai tạo và cứu phôi 27 2.2.3. Phương pháp tạo giống lily mới có khả năng chịu nóng bằng kỹ thuật gen 30 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu 36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 37 3.1. Đánh giá tập đoàn các giống lily nghiên cứu 37 3.1.1. Đánh giá quan hệ di truyền các giống lily nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử 37 3.1.2. Đánh giá khả năng tái sinh in vitro của một số giống lily nghiên cứu 39 3.1.3. Ngưỡng chịu nóng in vitro của một số giống lily nghiên cứu 41 3.2. Tạo dòng lily có khả năng chịu nóng bằng lai tạo và cứu phôi 44 3.2.1. Kiểm tra chất lượng hạt phấn của một số giống hoa lily nghiên cứu 44 3.2.2. Lai tạo và cứu phôi 45 3.2.3. Bước đầu xác định con lai bằng chỉ thị phân tử 48 3.4.4. Khả năng chịu nhiệt cao của mô vảy củ của các dòng lily lai được tạo ra 53 3.3. Tạo dòng lily có khả năng chịu nóng bằng công nghệ gen 55 3.3.1. Thiết kế vector chuyển gen chứa gen codA mã hóa choline oxydase 55 3.3.2. Tối ưu hóa qui trình chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily bằng A. tumefaciens 62 vii 3.3.3. Chuyển gen codA mã hóa choline oxydase vào lily 71 3.3.4. Khả năng chịu nóng các dòng lily chuyển gen 73 3.3.5. Khả năng tích lũy glycine betaine ở một số dòng lily chuyển gen codA 77 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 79 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 91 1. Kết luận 91 2. Đề nghị 92 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95 SUMMARY 112 PHỤ LỤC 115 viii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 2.1. Danh sách tên và ký hiệu giống lily (Lilium spp.) sử dụng 21 Bảng 2.2. Các cặp mồi đặc hiệu cho 2 gen TP-codA-cmyc và codA-cmyc 23 Bảng 2.3. Tên và trình tự các mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu 23 Bảng 2.4. Tên và trình tự các mồi ISSR sử dụng trong nghiên cứu 23 Bảng 2.5. Môi trường nuôi cấy vi khuẩn 24 Bảng 2.6. Môi trường nuôi cấy và chọn lọc cây lily chuyển gen 24 Bảng 3.1. Hệ số tương đồng di truyền giữa 13 giống lily nghiên cứu 37 Bảng 3.2. Sự phát sinh hình thái và cảm ứng tạo củ từ lát cắt vảy củ các giống lily sau 4 tuần nuôi cấy 40 Bảng 3.3. Tỷ lệ hữu dục và tỷ lệ nảy mầm của hạt phấn các giống lily nghiên cứu 44 Bảng 3.4. Tỷ lệ tạo quả sau thụ phấn của các tổ hợp lai 46 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA tới tỷ lệ nảy mầm và tạo củ in vitro từ hạt lai được tách ra từ lát cắt quả non 47 Bảng 3.6. Khả năng sống sót và khả năng tái sinh củ của lát cắt vảy củ 3 dòng lily lai và các dòng bố mẹ sau xử lý nhiệt (37 o C ± 1 o C, 13 ngày) 54 Bảng 3.7. Tên và trình tự đoạn mồi nhân đoạn promoter HSP18.2 của A. thaliana 57 Bảng 3.8. Kết quả chuyển gen codA vào thuốc lá nhờ A. tumefaciens 60 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của Cefotaxime đến sự tái sinh củ của lát cắt vảy củ đã biến nạp 64 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của hygromycine đến khả năng sống của củ lily in vitro 65 Bảng 3.11. Khả năng chuyển gen của các chủng A. tumefaciens vào lát cắt vảy củ lily 66 [...]... tài Ứng dụng công nghệ tế bào và công nghệ gen trong đánh giá, chọn và tạo dòng Lilium có khả năng chịu nóng làm tiền đề cho việc tạo ra các giống hoa lily mới có khả năng chống lại các điều kiện bất thuận của môi trường Đề tài được thực hiện với các nội dung gồm: (i) Đánh giá nguồn gen lily nghiên cứu bằng chỉ thị phân tử và công nghệ nuôi cấy mô tế bào; (ii) Tạo dòng lily mới có khả năng chịu nhiệt... lai tạo và cứu phôi; (iii) Tạo dòng lily mới có khả năng chịu nhiệt bằng xây dựng và tối ưu hóa quy trình chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily thông qua A tumefaciens; (iv) Chọn dòng lily in vitro có khả năng chịu nóng Mục tiêu của đề tài là sử dụng các phương pháp công nghệ sinh học bao gồm công nghệ nuôi cấy mô tế bào và công nghệ gen vào việc đánh giá và chọn tạo các dòng hoa Lilium spp có khả năng. .. Văn Đông và cộng sự cũng cho rằng L longiflorum và đặc biệt là L formolongo có khả năng trồng được ở một số tỉnh thành trong cả nước ngay cả ở thời điểm mùa hè nắng nóng (Đặng Văn Đông và cs., 2010) 1.2.3.3 Lai tạo dòng chịu nóng Để tạo dòng chịu nóng, người ta cũng có thể tiến hành lai tạo giữa dòng có khả năng chịu nóng nhưng các đặc tính về nông học không ưu việt và dòng có năng suất cao (có đặc... và phát triển ở nhiệt độ cao với mục tiêu cụ thể là (1) xây dựng được quy trình chuyển gen codA vào lát cát vảy củ lily, (2) ứng dụng kỹ thuật lai và nuôi cấy mô phôi tạo con lai chi lily và (3) đánh giá khả năng chịu nóng in vitro của các dòng lily thương mại, dòng lily chuyển gen và dòng con lai Những kết quả của luận án góp phần bổ sung cơ sở lý luận và thực tiễn cho việc ứng dụng công nghệ tế bào. .. học đã bước đầu chuyển gen codA vào một số cây trồng khác như là vào cà chua (có tác dụng bảo vệ hạt, cây và hoa khỏi sự phá huỷ bởi lạnh) (Park et al., 2004) (làm tăng cường khả năng chịu muối và stress nước) (Goel et al., 2011) Cây trồng chuyển gen codA cũng được tăng cường khả năng chịu nóng ví dụ như ở cây cà chua chuyển gen này có khả năng chịu nóng giai đoạn hạt nảy mầm và cây con (Li et al.,... gen này cũng thể hiện khả năng chịu nhiệt độ cao và muối cao (Matsunaga et al., 2012); Wang et al., (2010) đã sử dụng gen codA để tăng cường khả năng chịu mặn của cây Eucalyptus globulus (một loại cây lấy gỗ nguyên liệu để làm giấy) Ở Việt Nam, cây xoan ta chuyển gen codA đã tăng cường khả năng chịu muối khá tốt (Bùi Văn Thắng, 2013) 1.4 Thành tựu tạo giống lily mới bằng công nghệ tế bào và công nghệ. .. ẩn và chúng ta cần chú ý nhiều hơn Tài liệu chứa các thông tin về cây có khả năng chịu nhiệt trong giống cây trồng khác nhau còn tương đối ít Tuy nhiên, bất chấp tất cả sự phức tạp của khả năng chịu nhiệt và những khó khăn gặp phải trong quá trình chuyển khả năng chịu nhiệt của dòng bố mẹ tới các cây lai ghép đã đang được phát triển và công bố, ít nhất là trong một vài loài cây trồng như cà chua có khả. .. truyền ngược và kỹ thuật gây đột biến trong các loài ngũ cốc xác nhận thấy HSPs có quan hệ nhân quả trong khả năng chịu nhiệt độ cao ở thực vật (Queitsch et al., 2000) Với lily, chọn tạo giống có khả năng chịu nóng bằng hỗ trợ của chỉ thị phân tử cũng như kỹ thuật di truyền vẫn chưa có công bố nào trên thế giới cũng như ở Việt Nam 1.3 Glycine betaine và kỹ thuật làm tăng cường khả năng chịu nóng ở thực... ‘Belladonna’lily) Dòng thuốc lá K326 do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp, được sử dụng cho mục đích làm vật liệu thử nghiệm chuyển gen mục tiêu 2.1.2 Các chủng vi khuẩn, vector và cặp mồi sử dụng - Các chủng vi khuẩn E.coli (DH5α), A tumefaciens do phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp - Các vector chuyển gen ở thực vật pCAMBIA1301 mang gen GUS, pBI121/35S-codA-cmyc... chuyển gen này khi có kích thước 1,0 cm - 1,5 cm có thể tồn tại môi trường MS có 400 mmol/L NaCl trong hơn 30 ngày trong khi cây không chuyển gen không có khả năng như vậy (He et al., 2001) Dòng lúa indica Pusa Basmati 1 biến đổi gen với choline oxidase (codA) bởi Agrobacterium cũng thể hiện khả năng chịu mặn (Mohanty et al., 2002) Ngoài ra, lúa Oryza sativa L chuyển gen này không chỉ chịu mặn mà còn chịu . HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÙI THỊ THU HƯƠNG ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ TẾ BÀO VÀ CÔNG NGHỆ GEN TRONG ĐÁNH GIÁ, CHỌN VÀ TẠO DÒNG LILIUM CÓ KHẢ NĂNG CHỊU. hành đề tài Ứng dụng công nghệ tế bào và công nghệ gen trong đánh giá, chọn và tạo dòng Lilium có khả năng chịu nóng làm tiền đề cho việc tạo ra các giống hoa lily mới có khả năng chống lại. tài là sử dụng các phương pháp công nghệ sinh học bao gồm công nghệ nuôi cấy mô tế bào và công nghệ gen vào việc đánh giá và chọn tạo các dòng hoa Lilium spp. có khả năng sinh trưởng và phát