Chuyển gen vào cây lily đã được thực hiện bởi phương pháp trực tiếp nhưng kết quả chỉ tạo được cây L. longiflorum chuyển gen nhờ phương pháp bắn gen. Kĩ thuật biến nạp di truyền thường được dùng là bắn các phân tử ADN nhỏ này vào các vảy củ. Một hướng tiếp cận khác của các nhà khoa học là sự biến nạp di truyền phấn hoa. Các phân tử nhỏ ADN có chứa gen kháng kanamycin và gen
β-glucuronidase sau đó được bắn vào các hạt phấn tách rời dùng để tạo ra các cây trồng chuyển gen. Một số lượng lớn (400000) hạt phấn L. longiflorum đã được tạo ra và được sử dụng để thụ phấn với cây làm mẹ. Sàng lọc khả năng kháng kanamycin của 65000 cây con đầu tiên đã thu được 3 cây kháng kanamycin. Ở những cây này cũng có sự hoạt động của gen GUS, sử dụng PCR có thể xác nhận
sự có mặt của gen này ở mức độ phân tử.
Gần đây người ta đã thực hiên chuyển gen thành công bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium (Eady et al., 2000; Suzuki & Nakano, 2002). Vi khuẩn Agrobacterium thường được sử dụng là A.tumefaciens chủng EHA 101/pIG121Hm, trong đó có chứa gen neomycin phosphotransferase II (nptII),
hygromycine phosphotransferase (hpt) và gen β-glucuronidase (Hoshi et al., 2004; Ogaki & Furuichi, 2008); chủng LBA4404 mang vector pBI121 chứa Zm-40 cũng có thể sử dụng (Liet al., 2008a). A. tumefaciens chủng EHA 105 chứa plasmid mang gen nptII kháng kanamycine, chứa gen GUS mã hóa cho ß-glucuronidase và gen
bar mã hóa cho phosphinothricin acetyltransferaza (Nguyễn Thị Phương Thảo và cs., 2008) và gần đây nhất là Xi et al., (2012) đã sử dụng chủng EHA105 với pCAMBIA1304 và anti lLAC01. Những lát cắt từ vảy củ hoặc màng thân lily (Nguyễn Thị Phương Thảo và cs., 2008) hay những khối callus (Nguyễn Thị Lý Anh và CS., 2009) được nuôi cấy khởi động 3 ngày (Liet al., 2008a) hoặc không nuôi cấy khởi động, được đưa vào dịch huyền phù tế bào khả biến có OD600 = 0,8 khoảng 5 phút (Li et al., 2008a) hoặc OD600 = 0,6 trong 10 phút (Ogaki & Furuichi, 2008), sau đó nuôi trong môi trường đồng nuôi cấy khoảng 3 ngày (Nguyễn Thị Lý Anh và CS., 2009) hoặc 5 ngày (Li et al., 2008a) hay có thể là 7 ngày (Hoshi et al., 2004). Môi trường đồng nuôi cấy là môi trường MS có chứa 2 g/l gellan, 100 µM AS, 30 g/l sucrose, 1 mg/l picloram (Ogaki & Furuichi, 2008). Một số nghiên cứu gần đây lại cho thấy ảnh hưởng của nồng độ gellan trong môi trường đồng nuôi cấy đến kết quả chuyển gen, với nồng độ 10 g/l gellan biểu hiên tạm thời của gen GUS
tăng từ 2 đến 3,5 lần so với nồng độ là 3 g/l (Hoshi et al., 2005). Ngoài ra, môi trường không chứa NH4NO3 được coi là tạo điều kiện thuận lợi cho chuyển gen vào cây hoa lily (Hoshi et al., 2004). Sau khi đồng nuôi cấy, tiến hành chọn lọc những
mẫu cấy chứa gen chuyển và loại bỏ vi khuẩn ra khỏi mẫu cấy bằng cách nuôi trong môi trường chọn lọc chứa kháng sinh. Cefotaxime, kanamycine, hygromycine được bổ sung vào môi trường với nồng độ thích hợp như là 300 mg/l cefotaxime và 50 mg/l hygromycine (Hoshi et al., 2004) hay 500 mg/l cefotaxime (Nguyễn Thị Phương Thảo và cs., 2008). Sau khi chọn lọc, mẫu cấy, khối callus được đưa vào môi trường tái sinh để phát sinh hình thái và phát triển thành cây hoàn chỉnh. Môi trường tái sinh sau biến nạp là môi trường MS, có bổ sung 0,1 mg/l PIC; 0,01 mg/l BA; 20 mg/l meropenem trihydrate; 30 g sucrose và 3 g/l gellan (Hoshi et al., 2004) hoặc bổ sung 1 mg/l 6-BA và 1 mg/l NAA (Li et al., 2008a) hay 0,4 mg/l PIC và 0,044 mg/l 6-BA (Yue et al., 2012a). Các mẫu mô callus sau khi được chuyển gen sẽ được đánh giá kết quả và hiệu suất chuyển gen qua biểu hiện tạm thời của gen
GUS, phân tích PCR và lai phân tử. Trong một số năm gần đây, sự thành công trong nghiên cứu chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium đã được công bố trên một số loài thuộc họ Liliacea bao gồm: Asparagus officinalis (Kiasaka & Kameya, 1998),
Allium sativum (Kondo et al., 2000), Allium cepa (Eady et al., 2000), Agapanthus praecox (Suzuki & Nakano, 2002) và Muscari armeniacum (Suzuki & Nakano, 2002). Gần đây nhất, Hoshi et al. (2005), đã nghiên cứu thành công quy trình tạo cây chuyển gen cho cây Oriental hybrid Lilium cv. Acapulco bằng vi khuẩn
Agrobacterium.
Ở nước ta, một số nhà khoa học cũng sử dụng kỹ thuật chuyển gen để tạo các giống hoa loa kèn mang đặc tính mong muốn như là đã nghiên cứu sự cảm ứng tạo mô sẹo và tái sinh chồi từ mô sẹo ở cây hoa loa kèn L. formolongo làm cơ sở cho công tác chọn tạo giống bằng kỹ thuật chuyển gen (Nguyễn Thị Phương Thảo và cs., 2006); nghiên cứu nuôi cấy mô vảy củ in vitro và chuyển gen GFP (green
fluorescent protein) vào callus hoa loa kèn trắng (L. longiflorum) nhờ vi khuẩn
A. tumefaciens, đã xác định được môi trường tái sinh thích hợp cho mô sẹo nuôi cấy và làm rõ ảnh hưởng của một số khâu kỹ thuật đến quá trình chuyển gen (Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2009). Những kết quả này là tiền đề cơ bản cho các nghiên cứu chuyên sâu tạo cây lily mới bằng kỹ thuật chuyển gen.
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU