Kỹ thuật chuyển gen vào lily đã được nghiên cứu trên thế giới và mới gần đây người ta bắt đầu thực hiện chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium (Hoshi
et al., 2005). Sau đó, ở Việt Nam cũng đã có một vài nghiên cứu tạo cây lily chuyển gen (chủ yếu là gen chỉ thị) nhờ vi khuẩn đã được thực hiện. Các kết quả thu được đang dừng ở việc xây dựng một quy trình chuyển gen vào lily nhờ vi
khuẩn A. tumefaciens vì các công bố mới chỉ thu được những kết quả biểu hiện gen bước đầu với hiệu quả chưa cao. Các nhà nghiên cứu từng bước chuẩn hóa chúng với từng điều kiện như các yếu tố môi trường dinh dưỡng, chất dẫn dụ vi khuẩn (AS), thời gian đồng nuôi cấy, vật liệu biến nạp… (Ogaki & Furuichi, 2008; Nguyễn Thị Phương Thảo và CS., 2008; Nguyễn Thị Lý Anh và CS., 2009; Yue Wang et al., 2012b). Chính vì vậy, việc hoàn thiện quy trình chuyển gen cần tiếp tục được nghiên cứu nhằm phục vụ cho công tác chọn tạo giống hoa lily mới. Đầu tiên, chúng tôi tiến hành thử nghiệm chuyển gen GUS vào giống Belladonna, là một trong những giống có khả năng tái sinh in vitro củ con từ lát cắt vảy củ cao, đã được nghiên cứu kiểm tra từ trước.
3.3.2.1. Xác định nồng độ kháng sinh thích hợp cho chuyển gen vào lily
a. Ảnh hưởng của cefotaxime đến sự tái sinh củ của lát cắt vảy củ đã biến nạp
Kết quả nghiên cứu cho thấy sự sai khác về khả năng tái sinh củ sau 4 tuần nuôi cấy lát cắt vảy củ lily nuôi cấy. Ở môi trường không bổ sung cefotaxime, tỷ lệ mẫu sống sạch vi khuẩn là 0%. Tuy nhiên, một số mẫu bị nhiễm khuẩn này (10%) vẫn có biểu hiện phát sinh củ nhưng với hệ số nhân củ rất thấp (0,02 củ/lát). Hơn nữa, những củ này rất nhỏ (kích thước khoảng 0,01 mm2 - chỉ là những điểm màu trắng nhô lên trên bề mặt lát cắt) (số liệu không thể hiện ở bảng). Với môi trường nuôi cấy có bổ sung kháng sinh này thì tỷ lệ mẫu sống sạch vi khuẩn cao (75% ở môi trường có 125 mg/l cefotaxime và 100% với môi trường có lượng cefotaximelà 250; 375 hay 500 mg/l). Tuy nhiên, ở nồng độ cefotaxime càng cao thì tỷ lệ mẫu tạo củ và hệ số nhân củ là thấp dần (với môi trường bổ sung cefotaxime ở nồng độ 125 mg/l cefotaxime thì 86,5% mẫu tạo củ và có 1,8 củ/lát; nồng độ 250, 375 và 500 mg/l có 69,5%, 44% và 32% mẫu tạo củ và trung bình tạo 0,81; 0,15 và 0,14 củ/lát, tương ứng. Mặc dù tỷ lệ mẫu tạo củ và hệ số nhân củ của mẫu trong môi trường có bổ sung 250 mg/l cefotaxime ít hơn ở môi trường có 125 mg/l cefotaxime nhưng 100% mẫu sạch vi khuẩn và củ con mới hình thành có kích thước to hơn cả (hình 3.16, bảng 3.9).
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của Cefotaxime đến sự tái sinh củ của lát cắt vảy củ đã biến nạp
Cefotaxime (mg/l) 0 125 250 37 5 500
Tỷ lệ mẫu sống sạch khuẩn (%) 0,0 75,0 100,0 100,0 100,0
Tỷ lệ mẫu tạo củ (%) 10,0 86,5 69,5 44,0 32,0
Hệ số nhân củ (lần) 0,02 1,2 0,81 0,15 0,14
Kết quả trên chứng tỏ rằng, khi không sử dụng hoặc sử dụng kháng sinh với nồng độ thấp (125 mg/l), vi khuẩn (vẫn còn trong lát cắt) đã ức chế sự phát triển của mẫu; còn sử dụng kháng sinh với nồng độ cao (≥ 375 mg/l), mặc dù vi khuẩn bị tiêu diệt nhưng kháng sinh lại ức chế mạnh khả năng tái sinh của lát cắt vảy củ lily.
A B C D E
Hình 3.21. Sự tái sinh củ in vitro từ lát cắt vảy củ lily đã biến nạp sau 4 tuần nuôi cấy
A: Mẫu lát cắt vảy củ trong môi trường tái sinh không bố sung cefotaxime;
B, C, D, E: Mẫu lát cắt vảy củ trong môi trường tái sinh bố sung cefotaxime 125; 250; 375; 500 mg/l, tương ứng. Môi trường nền: MS + 7,5 g/l agar + 90 g/l saccharose.
Như vậy, sử dụng nồng độ kháng sinh cefotaxime 250 mg/l là thích hợp nhất, hiệu quả diệt khuẩn cao (100%), khả năng tái sinh mẫu khá cao (69,5%).
b. Ảnh hưởng của hygromycine đến khả năng phát triển của cây lily in vitro dạng củ
Xác định nồng độ kháng sinh thích hợp cho chọn lọc mẫu chuyển gen, củ lily
in vitro 4 tuần tuổi đã được kiểm tra mức độ mẫn cảm môi trường tái sinh bổ sung hygromycine ở các nồng độ khác nhau. Kết quả thể hiện ở hình 3.22, bảng 3.10.
A B C D E
Hình 3.22. Củ lily in vitro trong môi trường có hygromycine sau 4 tuần nuôi cấy
A: Mẫu củ trong môi trường tái sinh không bố xung hygromycine;
B, C, D, E: Mẫu củ in vitro trong môi trường có hygromycine 25; 50; 75; 100 mg/l, tương ứng.
Mỗi loài cây có độ mẫn cảm khác nhau với kháng sinh nói chung và với hygromycine nói riêng. Các mẫu chuyển gen mang cấu trúc vector có gen kháng
hygromycine có thể sống sót trong môi trường có bổ sung kháng sinh này. Tuy nhiên, nuôi mẫu trên môi trường chọn lọc có nồng độ hygromycine quá cao sẽ làm mẫu bị chết hoặc sinh trưởng bị ức chế. Ngược lại, nếu nuôi mẫu trên môi trường chọn lọc có nồng độ kháng sinh thấp sẽ khó chọn lọc được cây chuyển gen.
Ở môi trường bổ sung hygromycine 0; 25 và 50 mg/l tỷ lệ mẫu sống tương ứng là 100; 50,0 và 10,3%. Ngoài ra, các mẫu nghiên cứu này có sự xuất hiện lá và rễ, tỷ lệ nghịch với sự tăng nồng độ kháng sinh, cụ thể, tỷ lệ mẫu xuất hiện lá là 77,3; 56,3; 27,6% và tỷ lệ mẫu xuất hiện rễ là 100; 87,5; 51,7%. Trên môi trường không bổ sung hygromycine và bổ sung với nồng độ thấp (25 mg/l), ở gốc củ nhỏ in vitro ban đầu còn có sự xuất hiện thêm củ mới, điều này ít hoặc không thấy ở các đĩa thí nghiệm có nồng độ kháng sinh cao hơn 50 mg/l (hình 3.22) (số liệu không biểu hiện ở bảng 3.10). Với môi trường có nồng độ hygromycine lớn (75; 100 mg/l), các củ lily in vitro đều ngừng sinh trưởng và có hiện tượng chết, đồng thời cũng không thấy sự xuất hiện lá hay rễ (tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu xuất hiện lá và tỷ lệ mẫu xuất hiện rễ đều là 0%).
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của hygromycine đến khả năng sống của củ lily in vitro
Hygromycine (mg/l) 0 25 50 75 100
Tỷ lệ sống (%) 100 50,0 10,3 0 0
Tỷ lệ xuất hiện lá (%) 77,3 56,3 27,6 0 0
Tỷ lệ xuất hiện rễ (%) 100 87,5 51,7 0 0
Như vậy, từ kết quả nghiên cứu này chỉ ra rằng, có thể sử dụng nồng độ 75 mg/l hygromycine cho chọn lọc củ lily chuyển gen.
3.3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố vi khuẩn đến chuyển gen vào lilly a. Xác định chủng A. tumefaciens thích hợp cho chuyển gen
Để nâng cao hiệu quả chuyển gen thông qua A. tumefaciens, đối với mỗi
loài thực vật cần xác định được chủng A. tumefaciens thích hợp. Bốn chủng
A. tumefaciens LBA4404, C58-PMP90, C58-pGV2260 và EHA105 (OD600 là 0,5) đã được đồng nuôi cấy với lát cắt vảy củ lily Belladonna khoảng 2 ngày đến 3 ngày.
Bảng 3.11. Khả năng chuyển gen của các chủng A. tumefaciens vào lát cắt vảy củ lily
Chủng thí nghiệm (củ/ lát cắt) Hệ số nhân Tỷ lệ mẫu sống sót sau chọn lọc (%) Hiệu suất chuyển gen
(%)
EHA 105 0,744 ± 0,122a 10,88 ± 0,009a 6,67 ± 0,018a
C58-PMP90 0,760 ± 0,206a 6,24 ± 0,012c 3,80 ± 0,023a
C58-pGV2260 0,708 ± 0,101a 8,79 ± 0,003b 3,27 ± 0,001a
LBA 0,742 ± 0,131a 9,29 ± 0,007ab 5,95 ± 0,016a
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p <0.05 (phép thử Duncan)
Kết quả nghiên cứu thu được cho thấy, khi các lát vảy củ (đã được biến nạp bởi các chủng vi khuẩn) đều có hệ số nhân củ tương đối bằng nhau (từ 0,708 củ/lát đến 0,760 củ/lát) (bảng 3.11), tuy nhiên tỷ lệ mẫu sống sót trên môi trường chọn lọc và tỷ lệ mẫu dương tính với X-gluc khác nhau.
Các chủng vi khuẩn có khả năng chuyển gen vào lát cắt lily thấp gần như nhau, thể hiện hiệu suất chuyển gen là tương đương; mặc dù các chủng khi xâm nhập vào mẫu khiến tỷ lệ mẫu sống sót trên môi trường chọn lọc khác nhau. Chủng vi khuẩn này gần đây cũng được một số nhà nghiên cứu để chuyển gen vào lily (Ogaki
et al., 2008; Yue et al., 2012). Như vậy, chủng EHA105 đã được chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
b. Xác định nồng độ dịch khuẩn A. tumefaciens thích hợp để chuyển gen
Nồng độ vi khuẩn trong một đơn vị thể tích khi lây nhiễm cũng đóng vai trò quan trọng mang lại hiệu quả cao cho chuyển gen. Thí nghiệm ở đây được bố trí với 4 mật độ tế bào vi khuẩn chủng EHA105 trên tương ứng với OD600 lần lượt là 0,3; 0,6; 0,9 và 1,2. Kết quả thí nghiệm với chủng vi khuẩn Belladonna khoảng 2-3 ngày thu được cho thấy, khi đồng nuôi cấy với lát cắt vảy củ lily ở OD600 từ 0,6 đến 0,9 cho hệ số nhân củ giống với ở công thức nuôi cấy ở dịch khuẩn có OD600 là 0,3 hay 1,2 (0,617 - 0,679) nhưng tỷ lệ mẫu sống sót trên môi trường chọn lọc cao (khoảng 10,00 đến 12,19% ) và hiệu suất chuyển gen khá cao tương ứng là 6,8% và 5,61%. Với nồng độ vi khuẩn ở OD600 là 0,3 hoặc 1,2 cho hiệu suất chuyển gen thấp hơn hẳn với hệ số này là 4,65 và 2,14%; mặc dù tỷ lệ mẫu sống sót trên môi trường chọn lọc khá cao (khoảng 7,80 – 7,37 %).
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn tới hiệu quả chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily OD600 Hệ số nhân (củ/ lát cắt) Tỷ lệ mẫu sống sót sau chọn lọc (%)
Hiệu suất chuyển gen (%)
0,3 0,681 ± 0,064a 7,80 ± 0,075ab 4,60 ± 0,010b
0,6 0,617 ± 0,083a 12,19 ± 0,127a 6,80 ± 0,006a
0,9 0,679 ± 0,031a 10,00 ± 0,123ab 5,61 ± 0,013a
1,2 0,579 ± 0,035a 7,37 ± 0,071b 2,14 ± 0,008b
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p <0.05 (phép thử Duncan)
Bước đầu, ta có thể kết luận rằng dịch khuẩn có OD600 = 0,3 là quá thấp, (lượng vi khuẩn không đủ cho việc biến nạp vào mẫu), còn dịch khuẩn có OD600 = 1,2 lại có lượng vi khuẩn quá cao (lượng số lượng vi khuẩn lớn nên chúng có thể đã chết trong cạnh tranh dinh dưỡng và không gian sống hạn chế). Như vậy, dịch khuẩn dùng để lây nhiễm cho lily có OD600 trong khoảng 0,6 đến 0,9 là thích hợp.
c. Xác định thời gian đồng nuôi cấy thích hợp để chuyển gen
Thời gian đồng nuôi cấy giữa vật liệu thực vật và vi khuẩn A. tumefaciens
là một trong những yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả của quá trình chuyển gen. Các lát cắt vảy củ được lây nhiễm với dịch vi khuẩn chủng EHA105 (OD600 = 0,6) trong 30 phút và được đồng nuôi cấy trong thời gian 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày và 7 ngày đã được tiến hành, kết quả thu được như bảng 3.13.
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen vào lily
Thời gian đồng nuôi cấy (ngày)
Hệ số nhân (củ/lát cắt)
Tỷ lệ mẫu sống sót sau chọn lọc (%)
Hiệu suất chuyển gen (%)
1 0,840 ± 0,040a 3,75 ± 0,015c 2,40 ± 0,002b
3 0,727 ± 0,098a 12,78 ± 0,006a 8,46 ± 0,018a
5 0,794 ± 0,081a 11,06 ± 0,011a 8,80 ± 0,013a
7 0,742 ± 0,009a 7,37 ± 0,020b 3,91 ± 0,016b
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p <0.05
Kết quả ở bảng 3.13 cho thấy, với thời gian đồng nuôi cấy là 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày hay 7 ngày thì hệ số nhân củ đều đạt giá trị ngang nhau khoảng từ
0,72 củ/lát đến 0,84 củ/lát. Tuy nhiên, với thời gian đồng nuôi cấy ngắn (1 ngày), hiệu quả chuyển gen vào mẫu không cao, thể hiện tỷ lệ mẫu sống sót trong môi trường chọn lọc thấp (khoảng 3,75%) và tỷ lệ dòng hình thành dương tính Xgluc cũng thấp là 2,4%. Ngược lại, với thời gian đồng nuôi cấy dài (7 ngày), tỷ lệ mẫu sống sót trong môi trường chọn lọc khá cao (7,37%) và tỷ lệ mẫu tạo thành dương tính với Xgluc là 3,91%. Dù vậy, thời gian đồng nuôi cấy 7 ngày cho hiệu quả chuyển gen không cao bằng thời gian đồng nuôi cấy là 3 hoặc 5 ngày. Có thể quá trình đồng nuôi cấy quá dài nên vi khuẩn sinh trưởng quá mức nên ức chế sự phát triển của các tế bào lily đã được chuyển gen. Thời gian đồng nuôi cấy từ 3 đến 5 ngày cho hiệu suất chuyển gen cao nhất, tỷ lệ mẫu sống sót trong môi trường chọn lọc khoảng từ 11,06 - 12,78% và với hệ số chuyển gen (số dòng hình thành, dương tính với X-gluc của một lát cắt vảy củ biến nạp) là 8,46% và 8,8%.
Như vậy, việc đồng nuôi cấy vi khuẩn với lát cắt vảy củ lily trong 3 đến 5 ngày có thể thu được cây lily chuyển gen dạng củ in vitro hiệu quả hơn cả. Li et al.,
(2008) cũng tiến hành đồng nuôi cấy mẫu mô sẹo và vi khuẩn trong 5 ngày thu được mô sẹo có biểu hiện gen đạt xấp sỉ 12%. Bên cạnh đó, Nguyễn Lý Anh và CS. (2009) cũng đã đồng nuôi cấy mô sẹo cây hoa loa kèn trắng và vi khuẩn
Agrobacterium trong 3 ngày, bước đầu nhận thấy sự biểu hiện tạm thời của gen GFP trên mô sẹo cao (trên 50%). Ở đây, chúng tôi nhận thấy rằng, sự biểu hiện tạm thời gen GUS rất cao (trên 70%) (hình 3.23) (số liệu không biểu hiện ở bảng); song sự biểu hiện gen GUS trong cây in vitro tái sinh dạng củ ở các vị trí khác nhau khá bền vững (giai đoạn củ in vitro 8 - 12 tuần tuổi).
Tuy nhiên, sự biểu hiện gen GUS nhìn không rõ ở phía bề mặt ngoài của củ tái sinh in vitro mà chỉ thể hiện ở một vài vị trí như mô sẹo hình thành ở gốc (hình 3.24A), trên thân mầm khi cắt dọc củ (hình 3.24B) và mảnh lá (hình 3.24C); biểu hiện hơi mờ ở gốc vảy củ (hình 3.24C).
Hình 3.23. Sự biểu hiện tạm thời gen GUS của lát cắt vảy củ sau biến nạp
A B C D
Hình 3.24. Sự biểu hiện gen GUS ở cây lily in vitro 8- 12 tuần tuổi
Hình 3.24A, 3.24B, 3.24C, 3.24D: Sự xuất hiện màu xanh chàm đặc trưng khi nhuộm Xgluc trên mô sẹo hình thành ở gốc thân (A); trên thân mầm (B); trên mảnh lá (C) và trên vảy củ (D) cây in vitro, tương ứng.
Hình 3.25. Các bước chuyển gen thông qua A. tumefaciens vào lát cắt vảy củ lily in vitro
Như vậy, dựa vào các kết quả trên, chúng ta có thể xây dựng được qui trình chuyển gen vào lát cắt vẩy củ lily in vitro có hiệu quả cao (hình 3.25; hình 3.26). Qui trình này nhằm phục vụ chuyển gen quí vào lily nhằm phục vụ công tác tạo giống lily mới.
Hình 3.26. Quy trình chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily thông qua vi khuẩn A. tumefaciens hiệu quả cao
Ly tâm thu cặn khuẩn, hòa tan cặn trong ½MS
+ 100 µM AS (OD600 0,6 – 0,9)
Củ lily in vitro Chủng vi khuẩn A. tumefaciens
mang gen cần chuyển
Tách vảy củ, cắt thành từng lát kích thước khoảng 3 mm - 5 mm
Nuôi lỏng khuẩn tạo huyền phù
Lây nhiễm (biến nạp):
ngâm mảnh vảy củ trong dịch khuẩn 30 phút (lắc nhẹ)
Nuôi cấy trên môi trường đồng nuôi cấy trong điều kiện tối (MS + 30 g/l sucrose + 100 µM AS + 10 mM Mes + 7,5 g/l agar, pH 5,8)
3 ngày
Rửa khuẩn 2 lần:
- lắc nhẹ 5 phút trong H2O + Cefotaxime 500 mg/l),
- lắc 2 tiếng (200 vòng/ phút, 250C) trong dung dịch ½ MS + 500 mg/l Cefotaxime)
Nuôi cấy lát cắt vảy củ trên môi trường diệt khuẩn và tái sinh củ (MS + 90 g/l sucrose + 250 mg/l Cefotaxime + 7,5 g/l agar, pH 5,8)
Chọn lọc chồi lily chuyển gen trên môi trường tái sinh chọn lọc
(MS + 90 g/l sucrose + 250 mg/l Cefotaxime + 75 mg/l Hygromycine + 7,5g/l agar, pH 5,8)
>3 tuần
Kiểm tra cây chuyển gen