3.2.3.1. Xác định con lai bằng chỉ thị RAPD:
Hiện nay, kỹ thuật phân tử đã và đang là một công cụ hữu hiệu trong công tác phân loại một cách chính xác hơn cho các giống lily. Theo nghiên cứu của (Orlikowska et al., 2001) đã chỉ ra rằng, có thể xẩy ra sự tiếp hợp vô tính trong quá trình sinh sản của lily. Chính vì vậy, cần sử dụng chỉ thị phân tử như RAPD (Yamagishi et al., 2002; Ploszai, 2007) để đánh giá tình trạng của con lai lily thu được. Chính vì vậy, chúng tôi cũng bước đầu sử dụng chỉ thị RAPD cho xác định con lai thu được, kết quả thể hiện như sau:
Ở ảnh điện di sản phẩm PCR- RAPD, chỉ có 6 trong 12 chỉ thị RAPD (OPD11, OPD 08, RA159, RA46, OPR08 và OPM 02) cho thấy sự xuất hiện các băng ADN đa hình và sai khác giữa dòng bố, mẹ và con lai (hình 3.8).
Hình 3.8.A là ảnh điện di sản phẩm PCR của các mẫu ADN của dòng bố mẹ và con lai FS với mồi OPD 08. Giếng chứa sản phẩm khuếch đại ADN của cơ thể con FS xuất hiện các băng ADN giống các băng của cơ thể dùng làm mẹ (Sor) mà không giống các băng ADN của cơ thể làm bố. Ví dụ các băng ADN kích thước khoảng 500 bp của dòng con lai FS thì đều xuất hiện ở giếng chứa ADN cơ thể làm mẹ (Sor) mà không xuất hiện ở giếng chứa ADN cơ thể làm bố (F). Chứng tỏ, con lai phát triển từ một tế bào của cơ thể mẹ (vách của túi phôi, bầu nhụy…) chứ không phát triển từ phôi hữu tính. Như vậy, đây là dòng con sinh ra từ hình thức sinh sản vô tính.
A B C D
Hình 3.8. Sản phẩm PCR với mồi RAPD của các cặp bố mẹ và dòng con lai
A: tổ hợp FS (dòng FS) và F, S; B: tổ hợp SB (dòng 134) và S,B;
C: tổ hợp SL (dòng SL11) và S,L; D: tổ hợp FL (dòng I4), LF (dòng I5) và F,L
Sản phẩm PCR của các mẫu ADN của dòng bố mẹ và con lai của các các tổ hợp khác được thể hiện với mồi RA159 và OPG09 (hình 3.8.B), RA46 (hình 3.8.C), OPD11 (hình 3.8.D). Sự xuất hiện các băng ADN đa hình sai khác giữa cặp bố mẹ và dòng con lai chứng tỏ dòng thế hệ con được tạo ra như 134 (của tổ hợp SB), SL11 (của tổ hợp SL) và I4, I5 (tổ hợp F và L) là kết quả của hình thức sinh sản hữu tính (phát triển từ phôi hữu tính). Cụ thể là xuất hiện các băng ADN giống nhau giữa cơ thể con và ở cơ thể dùng làm bố mà không thấy xuất hiện ở cơ thể làm mẹ (ví dụ băng ADN kích thước khoảng 650 bp giếng 2,3 từ trái sang phải hình 3.8.B; băng ADN kích thước khoảng 300 bp giếng 2,3 từ trái sang phải hình 3.8.C; băng ADN kích thước khoảng 400 bp giếng 1,2 và 3 từ trái sang phải hình 3.8.C); xuất hiện các băng ADN giống nhau giữa cơ thể con và ở cơ thể dùng làm mẹ mà không thấy xuất hiện ở cơ thể làm bố (băng ADN kích thước khoảng 700 bp giếng 6,7 từ trái sang phải hình 3.8.B; băng ADN kích thước khoảng 300 bp giếng 2,3 từ trái sang phải hình 3.8.C; băng ADN kích thước khoảng 1400 bp
giếng 2,4 từ trái sang phải hình 3.8.D); đồng thời xuất hiện băng có kích thước giống nhau ở 2 dòng bố mẹ mà không thấy xuất hiện ở cơ thể con hoặc ngược lại (băng ADN kích thước khoảng 700 bp giếng 2,3 từ trái sang phải hình 3.8.B; băng ADN kích thước khoảng 270 bp giếng 4 (con lai) mà không có ở giếng 5,6 (dòng bố, mẹ) từ trái sang phải hình 3.8.B). Những kết quả trên đã bước đầu chứng minh sự thành công của việc tạo một số dòng con lai lily 134, SL11, I4 và I5 trên.
3.2.3.2. Xác định con lai bằng chỉ thị ISSR:
Để nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các giống lily lai và bố mẹ một cách chính xác hơn, 14 mồi ISSR có tên và trình tự tại phần Vật liệu và Phương pháp cũng đã được sử dụng. Sau khi hoàn thành từng phản ứng PCR, sản phẩm được điện di trên gel agarose 1,2 % để phân tích đa hình ADN của các mẫu nghiên cứu (ví dụ hình 3.9).
A B
Hình 3.9. Sản phẩm PCR với mồi ISSR 51(A) và ISSR 55(B) của tổ hợp Sor, Bel và 134
Ghi chú: 134: con lai của tổ hợp Bel và Sor; M: marker 1kb
Hình 3.9.A thể hiện kết quả điện di sản phẩm PCR của tổ hợp lai Bel x Sor và con lai 134 với mồi ISSR 51. Ta có thể thấy, con lai 134 có 3 băng vạch ADN được nhân lên với kích thước khoảng 500 bp, 700 bp và 1000 bp. Trong đó, băng ở vị trí 500 bp trùng với băng 500 bp của dòng Bel, băng 700 bp trùng với băng 700 bp của cả Bel và Sor nên không có ý nghĩa đánh giá sự đa hình các băng ADN, băng 1000 bp trùng với băng của Sor. Tương tự, hình 3.9.B là ảnh điện di sản phẩm PCR-
ISSR của tổ hợp Bel x Sor và con lai 134 với mồi ISSR 55. Con lai 134 có 4 băng vạch ADN được nhân lên với kích thước khoảng 600 bp, 700 bp, 800 bp và 900 bp; trong đó, băng ở vị trí 600 bp và băng 700 bp trùng với băng 600 bp và băng 700 bp của dòng Bel, băng 800 bp trùng với băng 800 bp của Sor, băng 900 bp là băng chung của cả tổ hợp.
Phân tích tổng hợp sự sai khác các băng ADN sản phẩm PCR-ISSR của tổ hợp này với 14 mồi ISSR được thể hiện trong phụ lục 2.
Trong 14 mồi đã sử dụng để đánh giá tập đoàn lily, thì có 2 mồi không cho kết quả đa hình là mồi ISSR8 và ISSR56. Tổng số băng ở con lai thu được là 23 băng ADN, trong đó có 14 băng giống của dòng Bel và 9 băng giống dòng Sor. Như vậy, 134 mang một số băng giống cả hai dòng Bel và Sor, có băng giống với dòng làm mẹ (Bel) mà không xuất hiện ở dòng làm bố (Sor); ngược lại có băng giống với giống làm bố mà không xuất hiện ở giống làm mẹ. Qua đây, bước đầu có thể kết luận được rằng dòng 134 chính là con lai của Bel và Sor. Từ kết quả phân tích ta có thể lập biểu đồ hình cây thể hiện mối liên hệ của con lai với các cặp bố, mẹ của chúng.
A B
Hình 3.10. Sản phẩm PCR với mồi ISSR 7 (a) và ISSR 55 (b) của tổ hợp Sor và L; L và F và các con lai
Hình 3.10 là ảnh điện di sản phẩm PCR-ISSR của con lai SL11 của tổ hợp lai Sor và L; con lai I4, I5 của tổ hợp lai L và F.
Ở hình 3.10A ta thấy con lai SL11 có các băng vạch hoàn toàn trùng với các băng vạch giống với giống Sor. Tuy nhiên, ở hình 3.10B ta thấy, con lai SL11 có 2 băng khoảng 600 bp và 900 bp, trong đó băng 600 bp giống với băng dòng L và băng 900 bp giống với băng của giống Sor. Như vậy, SL11 (tên gọi mới là LLK11) có thể bước đầu xác định là con lai của tổ hợp này.
Trong tổ hợp lai F và L, ở hình 3.10A, con lai I5 có 3 băng là 600 bp, 700 bp và 900 bp trong đó có băng 600 bp giống với băng của dòng L, băng 700 bp là băng xuất hiện ở cả tổ hợp nên không có ý nghĩa đánh giá sự đa dạng ADN, băng khoảng 900 bp giống với băng ở dòng F. Mặc dù, khi kiểm tra tổ hợp lai F x L với mồi ISSR55 (Hình 3.10B) ta có thể thấy rằng, các băng của con lai I5 giống với các băng của dòng L, tuy nhiên vẫn có thể bước đầu xác định I5 là con lai. Điều này được chứng minh rõ hơn khi phân tích với tất cả các chỉ thị ISSR đã sử dụng. Con lai I4 có tất cả các băng ADN giống với băng của dòng F. Như vậy, ta có thể bước đầu cho rằng, dòng I4 có thể là dòng do phôi vô tính của L. x formolongo tạo thành.
Khi kiểm tra 14 chỉ thị ISSR với hai tổ hợp thì cả 14 chỉ thị đều cho các băng vạch giúp xác định con lai. Trong đó, với tổ hợp lai xa Sor và L thì có tất cả 33 băng thu được ở con lai SL11 thì có 22 băng giống với giống Sor và 11 băng giống với dòng L. Với tổ hợp lai xa F và L, dòng I4 có tất cả các băng giống với băng của dòng F (dòng làm mẹ) nên có thể kết luận rằng I4 chính là do phôi vô tính phát triển thành. Với tổ hợp lai F và L thì dòng I5 (với tên mới là LK5) là dòng lai thực sự giữa F và L, trong đó, thu được tổng số 29 băng nhận biết con lai với 22 băng giống với dòng L và 7 băng giống dòng F (Phụ lục 2.1, 2.2).
Hình 3.11. Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ giữa con lai và dòng bố mẹ
Trên hình 3.11. ta có thể thấy, khi đánh giá con lai với chỉ thị tính trội ISSR, ở tổ hợp lai Sor và L thì con lai SL11 nằm gần dòng Sor hơn với L. Tương tự, con lai I5 nằm gần dòng L hơn so với dòng F (tương tự như ở phụ lục 3).
Tóm lại, hạt phấn của 3 giống Sorbonne (Sor), L. xformolongo (F), L. longiflorum Thunb (L) trong 4 giống lily nghiên cứu có tỷ lệ hữu dục và tỷ lệ nảy mầm cao, đạt chất lượng được lựa chọn làm dòng bố trong 9 tổ hợp lai. Các dòng con lily lai của các tổ hợp được tạo thành bằng phương pháp nuôi cấy lát cắt bầu nhụy sau thụ tinh (với quả lai của các tổ hợp FS, SL, SF, FB, LB và LS có tỷ lệ quả lai sống sót ở thời điểm 30 ngày sau thụ phấn thấp) hoặc phương pháp nuôi cấy phôi (với các tổ hợp lai khá gần là SB, FL và LF có tỷ lệ quả sống sót sau thụ phấn 30 ngày cao). Các con lai LLK5, LLK11 và LL134 đã bước đầu được chứng minh bằng chỉ thị phân tử RAPD và ISSR.