2.2.3.1. Thiết kế vector chứa gen mục tiêu (tăng cường khả năng chịu nóng) phục vụ chuyển gen:
a. Nhân các đoạn gen mục tiêu bằng cặp mồi đặc hiệu bằng phản ứng PCR
Tiến hành PCR nhân các đoạn gen đặc hiệu như gen codA, TP- codA, với thành phần phản ứng và chu kì nhiệt phù hợp cho mỗi loại. Với promoter của gen HSP18.2, mồi được thiết kế dựa trình tự mã hóa HSP18.2 của Arabidopsis đã được công bố tại Ngân hàng GenBank NCBI với mã số X17295.1 có chiều dài 1440bp.
b. Thôi gen từ bản gel agarose bằng bộ KIT của hãng Fermentas, Mỹ. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
c. Kỹ thuật tạo vector tái tổ hợp mang gen đích
Thực hiện các phản ứng cắt enzyme giới hạn, lai tạo vector tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào vi khuẩn theo phương pháp sốc nhiệt hoặc xung điện của Cohen et al. (1972). DNA plasmid được tách chiết và làm sạch theo phương pháp của Sambrook et al. (2001).
d. Kiểm tra sự biểu hiện của gen đích trong cây mô hình nhờ kỹ thuật chuyển gen gián tiếp qua vi khuẩn A. tumefaciens (Topping, 1998)
2.2.3.2. Xây dựng qui trình chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily
a. Phương pháp xác định nồng độ kháng sinh thích hợp cho chuyển gen vào lily a1, Xác định nồng độ cefotaxime thích hợp để diệt khuẩn ở mẫu sau biến nạp
Lát cắt vảy củ dày khoảng 3 mm - 5 mm của vảy củ (8 tuần tuổi) có thể tái sinh tạo củ con tốt trong môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) + 7,5 g/l agar + 60 g/l saccharose. Tuy nhiên, sau khi biến nạp, trong mẫu thực vật còn vi khuẩn nên phải bổ sung kháng sinh cefotaxime vào môi trường tái sinh để diệt khuẩn với các nồng độ khác nhau (0 mg/l, 125 mg/l, 250 mg/l, 375 mg/l và 500 mg/l). Xác định khả năng tái sinh của mẫu nuôi cấy sau thời gian 4 tuần với các chỉ tiêu như tỷ lệ mẫu sống sạch (%) (phần trăm số lát cắt vảy củ sống sót, không bị nhiễm khuẩn so với tổng số lát cắt vảy củ nuôi cấy), tỷ lệ mẫu tạo củ (%) (phần trăm số lát cắt
vảy củ tạo củ so với tổng số lát cắt vảy củ nuôi cấy) và hệ số nhân củ (số củ hình thành trung bình của một lát cắt vảy củ nuôi cấy).
a2, Xác định nồng độ hygromycine thích hợp để chọn lọc mẫu củ lily chuyển gen
Củ nhỏ lily in vitro (khoảng 4 tuần tuổi) được cấy trên môi trường MS + 60 mg/l saccharose và bổ sung hygromycine ở các nồng độ khác nhau (0 mg/l, 25 mg/l, 50 mg/l, 75 mg/l và 100 mg/l). Sau 4 tuần, mẫu nuôi cấy được quan sát và đánh giá dựa trên các chỉ tiêu như tỷ lệ mẫu sống (%) (phần trăm số củ sống sót so với tổng số củ nuôi cấy), tỷ lệ mẫu xuất hiện lá (%) (phần trăm số củ hình thành lá so với tổng số củ nuôi cấy) và tỷ lệ mẫu xuất hiện rễ (%) (phần trăm số củ hình thành rễ so với tổng số củ nuôi cấy).
b. Xác định các yếu tố vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen
Sử dụng các chủng vi khuẩn A. tumefaciens (nồng độ dịch khuẩn tương ứng với OD600là từ 0,3 đến 1,2 tùy thí nghiệm) mang vector pCAMBIA1301 chứa gen chỉ thị GUS (với thời gian đồng nuôi cấy từ 3 ngày đến 7 ngày) để xác định hiệu quả chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily.
Các thí nghiệm xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen vào lát cắt vảy củ lily được tiến hành lặp lại 3 lần, với các chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ vảy hình thành củ trong môi trường tái sinh (sau 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần) (%)
=
Số vảy hình thành củ
× 100 % Tổng số vảy biến nạp
- Hệ số nhân củ trong môi
trường tái sinh =
Số củ hình thành Tổng số vảy biến nạp - Tỷ lệ vảy hình thành củ trong
môi trường chọn lọc
(sau 2 tuần, 4 tuần, 6 tuần) (%) = Vảy hình thành củ sống sót × 100 % Tổng số vảy hình thành củ - Tỷ lệ củ sống sót trong môi trường chọn lọc (%) = Số củ sống sót × 100 % Tổng số củ hình thành
2.2.3.3. Chuyển gen đích vào lát cắt vảy củ nhờ vi khuẩn A. tumefaciens a. Chuẩn bị dịch khuẩn
Các chủng vi khuẩn A. tumefaciens được nuôi hoạt hóa trên môi trường gồm 10 g/l Tripton + 10 mg/l NaCl + 5 g/l cao nấm men và bổ sung các kháng sinh chọn lọc phù hợp với từng loại khuẩn, lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ ở 28ºC. Sau đó, dịch vi khuẩn được li tâm thu sinh khối ở tốc độ 5000 vòng/phút ở 4ºC trong 15 phút, hòa tan cặn khuẩn bằng môi trường ½MS lỏng + 3% saccharose, pH = 5,8 có bổ sung 100 µM acetosyringone (AS) để thu được dịch huyền phù vi khuẩn có mật độ vi khuẩn đạt giá trị OD ở bước sóng 600 nm OD600 theo mong muốn (Ogaki & Furuichi, 2008b).
b. Chuẩn bị mẫu lây nhiễm
Vảy củ lily in vitro được sử dụng làm vật liệu chuyển gen do vảy củ có khả năng tái sinh cao, dễ hình thành các củ bất định và có thể sử dụng để chuyển gen khá hữu hiệu (Simmonds & Cumming, 1976; Nguyễn Thị Phương Thảo và CS., 2008). Vảy củ được tách ra, cắt thành từng lát mảnh nhỏ (khoảng 3 mm đến 5 mm) trong tủ cấy vô trùng.
c. Biến nạp và đồng nuôi cấy
Các lát cắt vảy củ được đưa vào dịch huyền phù tế bào vi khuẩn A. tumefaciens
(có nồng độ xác định tùy thí nghiệm), lắc nhẹ trong 30 phút, thấm khô bằng giấy thấm vô trùng và sau đó được nuôi cấy vào môi trường đồng nuôi cấy (MS + 3% saccharose+ 100 µM AS + 10 mM Mes + 2 g/l gellan, pH = 5,8) (Ogaki & Furuichi, 2008b) trong điều kiện tối ở nhiệt độ 25oC, thời gian đồng nuôi cấy từ 1 ngày đến 7 ngày tùy thuộc vào công thức thí nghiệm (Hoshi et al., 2005; Li et al., 2008b; Li et al., 2009; Azadi et al., 2010b; Wang et al., 2012b).
d. Tái sinh, sàng lọc cây chuyển gen
Mẫu sau khi được biến nạp và đồng nuôi cấy được rửa khuẩn 3 lần bằng dung dịch ½ MS có bổ sung 500 mg/l cefotaxime, thấm khô và chuyển sang môi trường tái sinh có kháng sinh diệt khuẩn (MS + 6% saccharose + cefotaxime (nồng độ thích hợp tùy thí nghiệm) + 7,5 g/l agar, pH = 5,8). Sau khoảng 2 tuần đến 4 tuần, các mảnh vảy củ bắt đầu phát sinh các củ lily nhỏ được chuyển sang môi trường có kháng sinh chọn lọc cây chuyển gen (MS + 6% saccharose + hygromycine nồng độ
thích hợp tùy thí nghiệm) + 7,5 g/l agar, pH = 5,8) đặt trong điều kiện tối ở nhiệt độ 25oC khoảng 4 tuần đến 6 tuần.
e. Xác định khả năng chuyển gen đích vào lát cắt vảy củ lily e1, Phương pháp nhuộm mô tế bào
Nhuộm GUS được thực hiện nhằm xác định biểu hiện tạm thời ở chồi, chồi mầm và rễ mới tái sinh. Nhuộm GUS cũng để khẳng định gen chuyển được di truyền sang thế hệ sau khi nhuộm phôi của hạt hình thành từ cây chuyển gen (Nguyễn Đức Thành, 2000; Lê Trần Bình, 2003). Các mẫu sau khi đồng nuôi cấy và các mẫu rễ, vảy củ và lá tái sinh trong môi trường chọn lọc được ngâm ngập trong dung dịch X-gluc 1% (để trong khoảng thời gian 20 đến 30 giờ trong tối ở nhiệt độ 37oC ± 1oC), loại bỏ diệp lục bằng cách ngâm mẫu trong cồn 70%, 1 ngày đến 2 ngày. Sau đó, mẫu được quan sát bằng mắt thường hoặc kính hiển vi soi nổi, mẫu chuyển gen sẽ có màu xanh chàm đặc trưng, mẫu đối chứng không chuyển màu.
Xác định ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu quả chuyển gen qua các chỉ tiêu như hệ số nhân củ (số củ hình thành trung bình của một lát cắt vảy củ sau 4 tuần nuôi cấy trong môi trường tái sinh có cefotaxime); tỷ lệ mẫu sống sót trên môi trường chọn lọc (%) (phần trăm số củ sống sót so với tổng số củ (đã hình thành trong môi trường tái sinh) sau 4 tuần nuôi cấy trong môi trường chọn lọc có hygromyxine), tỷ lệ dòng dương tính với X-gluc (%) (hiệu suất chuyển gen (%)) (phần trăm số cây in vitro (dạng củ) có ít nhất một điểm bất kỳ có màu xanh chàm đặc trưng so với tổng số cây khi chúng được nhuộm với X-gluc 1%) (phương pháp đánh giá sự biểu hiện tạm thời sau biến nạp và bền vững sau 1 thời gian tái sinh của gen GUS trong các mẫu biến nạp hay mẫu tái sinh theo Jefferson et al. (1987).
- Tỷ lệ dương tính
X-gluc tạm thời (%) =
Số lát cắt sau biến nạp dương tính
× 100 % Tổng số lát cắt biến nạp
- Hiệu suất
chuyển gen (%) =
Số dòng dương tính với Xgluc
× 100 % Tổng số lát cắt biến nạp
2.2.3.4. Phương pháp kiểm tra sự biểu hiện gen ở cây chuyển gen a. Phương pháp RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu
a1. Tách chiết ARN:
Thực hiện theo kit tách ARN của GenElute TM Total RNA Miniprep (hãng Sigma). Tiến hành nghiền mẫu và giải phóng ARN từ các tế bào hoặc mô. Thực hiện gắn ARN vào cột lọc và rửa để loại bỏ tạp chất.
a2. Tổng hợp cDNA
ARN sau khi tách chiết được dùng để tổng hợp cDNA theo kit First Strand cDNA synthesis của (hãng Fermentas) để chuẩn bị khuôn cho phản ứng PCR.
a3. Phản ứng PCR:
Phản ứng được thực hiện theo kit GoTaq®Green Master Mix của hãng Promega. Thành phần của phản ứng như sau:
Thành phần Thể tích phản ứng (µl) Master Mix (2X) 10 cDNA 3 Forward Primer 5 pM 1 Reverse Primer 5 pM 1 H2O 5 Tổng thể tích 20
Chu kỳ nhiệt của phản ứng RT-PCR kiểm tra sự có mặt của gen (TP)-codA-cmyc
Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
Khởi đầu 940C 3 phút 1
Biến tính 940C 1 phút 35
Gắn mồi 550C 50 giây
Kéo dài 720C 1 phút 30 giây
720C 10 phút 1
b. Đánh giá sự biểu hiện gen mức độ dịch mã bằng lai Weston blot
Tách chiết protein bằng PBS (Phosphate-buffered saline) 0,05% Tween 20, biến tính protein và thực hiện điện di SDS.
2.2.3.5. Định lượng Glycine betaine trong cây chuyển gen (Grieve và Grattan, 1983)
Nghiền mẫu trong nước cất và rồi lọc sau đó bổ sung HCl 2N, potassium triiodide và 1-2-diclometan. Bỏ lớp nước phía trên và xác định mật độ quang học của lớp chất hữu cơ phía dưới ở bước sóng 365 nm.
* Nồng độ của glycine betaine được tính toán từ đường chuẩn:
(Hàm lượng glycine betain (mg/g) = Y(µg/ml).V(ml).df / 1000.w(g))
X: giá trị OD365 nm của mẫu; V: thể tích dịch chiết (= số ml 1,2 diclometan); df: hệ số pha loãng (trong trường hợp này là “80” là 40 ml dịch chiết đã pha loãng bằng H2SO4 2N/0,5 ml phân tích); w: khối lượng mẫu (= 0,5 g); 1000: hệ số chuyển đổi đơn vị µg/g sang mg/g mẫu). Nồng độ glycine betain được chuẩn bị ở 50 µg/ml đến 200 µg/ml trong axit H2SO4 1N để dựng đường chuẩn.
2.2.3.6. Đánh giá khả năng chịu nóng của các dòng lily in vitro chuyển gen a. Chọn dòng lily chuyển gen in vitro có khả năng chịu nóng:
Các củ nhỏ in vitro (3 mm2 đến 5 mm2) của dòng lily chuyển gen được nuôi cấy trong môi trường MS + 60 g/l sucrose + 7,5 g agar và đặt ở điều kiện sốc nhiệt (37oC ± 1oC, 13 ngày), tiếp đó chuyển sang môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ phòng (25oC đến 27oC) để phục hồi. Tiến hành xác định khả năng sống sót của các mẫu thí nghiệm tại các thời điểm sau sốc nhiệt 0 ngày, 10 ngày, 20 ngày và 30 ngày.
Xác định tỷ lệ sống sót sau sốc nhiệt (0 ngày,10 ngày, 20 ngày và
30 ngày) (%)
=
Số mẫu sống sót sau phục hồi
x 100 Tổng số mẫu đem sốc nhiệt
b. Đánh giá khả năng chịu nóng và khả năng tái sinh sau sốc nhiệt của mô vảy củ một số dòng lily chuyển gen
Lát cắt vảy củ lily in vitro của các dòng chuyển gen đã được chọn lọc qua nhiệt được nuôi cấy trong môi trường MS + 60 g/l sucrose + 7,5 g agar và được đặt
ở điều kiện sốc nhiệt (37oC ± 1oC, 13 ngày), tiếp đó chuyển sang môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ phòng (25oC đến 27oC) để đánh giá mức độ chịu nhiệt và khả năng tái sinh củ của mẫu mô vảy củ. Khả năng chịu nhiệt của mô lát cắt vảy củ cũng được xác định bằng khả năng sống sót của các mẫu thí nghiệm tại các thời điểm sau sốc nhiệt 10 ngày và 30 ngày.
- Tỷ lệ mẫu sống sót sau sốc nhiệt (10 ngày và 30 ngày)
(%)
=
Số mẫu sống sót sau phục hồi
x 100 % Tổng số mẫu đem sốc nhiệt
Các mẫu mô sống sót sau sốc nhiệt được đánh giá khả năng tái sinh củ con và hệ số nhân củ như sau:
- Tỷ lệ mẫu sống
sót tạo củ (%) =
Số mẫu sống sót tạo củ
x 100% Tổng số mẫu nuôi cấy được xử lý nhiệt
- Hệ số nhân củ là số củ tạo ra trung bình của một lát cắt vảy củ khi nuôi cấy trên môi trường tái sinh củ.