Để một phần giải thích khả năng chịu nóng của một số dòng lily chọn lọc, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng GB tích lũy một số cây lily.
Bảng 3.18. Mối quan hệ sự tích lũy glycine betain trong lá và một số đặc điểm khác của một số dòng lily in vitro
STT Tên dòng Cấu trúc chuyển gen Biểu hiện gen GUS Khả năng chịu nóng RT- PCR Hàm lượng GB (mM/g) Tỷ lệ so với ĐC (%) 1.0 BelWT (không) - - - 7.32 100 1.1 Belcod2.16 *1 - - - 6.57 89,75 1,2 Belcod1.4 *1 + - - 9,89 135,11 1.3 Belcod2.1 *1 + + + 15,19 207,51 1.4 BelspA8.4 *2 - - - 8,11 110,79 1.5 BelspA9.1 *2 + + + 10,97 149,86 BelspA9.1(toC) 17,41 237,84 1.6 BelHspA5.1 *3 + + + 17,5 239,07 BelHspA5.1(toC) 37,99 518,99 2.0 YelWT (không) - - - 6,43 100 2.1 Yelcod1.4 *1 + + + 31,58 491,14 2.2 YelHspA6.3 *3 + + + 8,88 138,1 YelHspA6.3 (toC) 10,14 157,7 3.0 Sor WT (không) - - - 5,44 100 3.1 SorspA2.14 *2 - - - 5,72 105,15 3.2 SorspA2.4 *2 + + + 9,56 175,74
Ghi chú : (*1): 35S/Hyg/35SpolyA/35S/codA-cmyc/Nos/ 35S-GUS-Nos (*2): 35S/Hyg/35SpolyA/35S/TP-codA-cmyc/Nos/ 35S-GUS-Nos (*3): 35S/Hyg/35SpolyA/HSP/TP-codA-cmyc/Nos/ 35S-GUS-Nos
(-) Biểu hiện âm tính của gen GUS; (+) Biểu hiện dương tính của gen GUS (toC): Dòng được xử lý nhiệt 37 oC ± 1oC, qua đêm trước khi định lượng GB
Kết quả thể hiện qua bảng 3.18 ta thấy, những mẫu không chuyển gen và chuyển gen không thành công đều có lượng GB thấp và khả năng chịu nóng kém hoặc không có (-). Ngay trong bản thân của giống hoa lily Sor, Bel và Yel chưa chuyển gen (WT) đã có tích lũy GB (tương ứng 5,44 mM/g; 6,42 mM/g và 7,32 mM/g). GB cũng có mặt trong các mẫu lá cây chuyển gen được cho là không thành công (những dòng âm tính với X- glux và âm tính RT- PCR), tuy nhiên với lượng không nhiều, tương đương với mẫu không chuyển gen (mẫu SorspA2.14 với 5,72 mM/g; mẫu BelcodA2.16 với 6,57 mM/g; mẫu BelspA8.4 với 8,11 mM/g). Những dòng dương tính với Xgluc và dương tính với phản ứng PCR thì có sự tích lũy GB cao. Các dòng lily được chuyển gen thì có hàm lượng GB cao hơn đáng kể (8,88 mM/g - 37,99 mM/g), cao hơn so với đối chứng, từ 138,1 % đến 518, 99% (coi đối chứng là 100%). Dòng BelHscodA5.1 tích lũy được GB lớn nhất là 37,99 mM/g khi được cảm ứng nhiệt độ cao (37oC ± 1oC, 13 ngày), lúc chưa cảm ứng nhiệt là 17,5 mM/g. Có lẽ gen codA trong cây chuyển gen này đã được kích hoạt và biểu hiện mạnh bởi promoter HSP cảm ứng nhiệt.
Tóm lại, các dòng lily chuyển gen được chọn lọc bởi nhiệt độ cao (37oC ± 1oC, 13 ngày) có khả năng sống sót và tỷ lệ phát sinh củ cao, đặc biệt là các giống Belladonna, Yelloween ở cả ba cấu trúc chuyển gen.
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Nhằm đáp ứng việc cải tiến, chọn tạo ra các giống lily mới vừa có kiểu dáng sang trọng, màu sắc đẹp quyến rũ vừa thích hợp với các điều kiện khí hậu địa phương, các nhà nghiên cứu đã và đang áp dụng nhiều phương pháp khác nhau. Với việc áp dụng một số công nghệ hiện đại như công nghệ tế bào và công nghệ gen, chúng tôi bước đầu đã thu được một số kết quả, phục vụ công tác tạo giống lily mới có khả năng chịu nóng.
Đầu tiên, để chọn lọc nguồn vật liệu cho nghiên cứu, tập đoàn mẫu gồm 13 giống lily đã được tiến hành khảo sát tính đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử ISSR. Kết quả thể hiện ở ảnh điện di sản phẩm PCR với 11 mồi ISSR. Sự xuất hiện hay không của các băng ADN trên gel agarose của các phản ứng PCR-ISSR với 11 mồi ISSR đã được tổng hợp xử lý bằng phần mềm NTSYS 2.0 và 2.2. Hệ số đa hình di truyền cho mỗi locus (PIC) của từng chỉ thị ISSR trên lily dao động từ 0,6954 (mồi ISSR 5) đến 0,886 (mồi ISSR 56), trung bình đạt 0,82. Nó thể hiện rằng, các chỉ thị ISSR sử dụng đã tạo sự đa dạng về các phân đoạn ADN của 13 giống lily rất cao nên có ý nghĩa trong việc đánh giá chúng. Đây là những kết quả đầu tiên ở Việt Nam sử dụng chỉ thị ISSR này trong đánh giá mối quan hệ di truyền các giống lily nghiên cứu. Kết quả phân tích còn cho thấy, hệ số tương đồng di truyền giữa các cặp giống dao động là từ 0,3 (Bel và SP) đến 0,79 (Ber và Tib). Tương tự như theo công bố trước của chúng tôi trong bước đầu đánh giá mối quan hệ di truyền các giống lily thương mại và hoang dại bằng chỉ thị RAPD (Trịnh Khắc Quang và cs., 2009) cũng cho thấy độ tương đồng di truyền giữa các cặp giống nằm trong khoảng từ 0,42 đến 0,82. Các giống với số lượng mẫu nhiều hơn trong thí nghiệm đánh giá này được chia thành các nhóm tương ứng với sự phân nhóm theo nguồn gốc như nhóm lily lai Oriental Trumpet, nhóm lai Oriental, nhóm Trumpet và SP (loại lily hoang dại Lilium poilanei mọc ở Sapa, Lào cai). Bên cạnh đó, với mục đích chọn được những cặp lai có khả năng chịu nhiệt, chúng tôi tiến hành chọn lọc những cặp vừa có thể mang lại ưu thế lai cao, thế hệ con lai có khả năng chịu nhiệt và sinh sản tốt dựa hệ số tương đồng này, bên cạnh sự khảo
nghiệm đồng ruộng các giống để nhận biết sự sai khác về điểm nông sinh học, năng suất chất lượng cũng như khả năng sinh trưởng của từng giống lily với điều kiện khí hậu Việt Nam. Cũng như theo công bố nghiên cứu trước của chúng tôi, một số cặp giống có khả năng tạo ưu thế lai khi sinh sản hữu tính đặc biệt ở các cặp lai có độ tương đồng di truyền nằm trong khoảng 0,6-0,7 (Trịnh Khắc Quang và CS., 2009). Mặt khác, trong các giống lily nghiên cứu, hai giống loa kèn ta L và loa kèn Tứ Quý F thuộc nhóm Trumpet và hai giống thuộc nhóm Oriental Trumpet là giống ‘Belladonna’ và giống ‘Yellowine’ đã được khảo nghiệm và được cho rằng có khả năng sinh trưởng, chịu nhiệt tốt tại Hà Nội và một số tỉnh lân cận. Các giống tiềm năng này có thể làm đối tượng cho lai tạo giống mới có nhiều điểm ưu việt và chịu nóng (Đặng Văn Đông & Nguyễn Thị Duyên, 2009), (Đặng Văn Đông & Mai Thị Ngoan, 2014). Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn các tổ hợp lai có ít nhất một bên bố hoặc mẹ thuộc nhóm Trumpet hoặc Oriental Trumpet. Tuy nhiên, để tăng hiệu quả tạo ra con lai thành công, trong các tổ hợp lai xa giữa các cặp giống mà một hoặc cả hai bên bố (hoặc mẹ) thuộc nhóm Trumpet hoặc Oriental Trumpet, chúng tôi đã thực hiện với sự hỗ trợ của phương pháp thụ phấn mới kết hợp cứu phôi in vitro.
Kết quả thứ hai thu được trong quá trình nghiên cứu là đánh giá khả năng tái sinh, nhân dòng lily in vitro. Trong thí nghiệm này, chúng tôi lựa chọn một số giống tiêu biểu của các nhóm thuộc tập đoàn lily nghiên cứu ở phần đánh giá mối quan hệ di truyền (3 nhóm). Đó là các giống Bel, Yel (nhóm I), Sor (nhóm II); F, L (nhóm III) và SP nhóm IV. Sự chọn lọc này cũng dựa vào thực tế làBel và Yel có khả năng thích ứng cao, có màu sắc đẹp, sinh trưởng phát triển tốt, cho chất lượng hoa cao và có khả năng chống chịu tốt với một số loài sâu hại chủ yếu và có thể trồng vào mùa đông xuân ở miền trung Việt Nam (Đặng Văn Đông & Mai Thị Ngoan, 2014).. Giống Sor đã được Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn công nhận là giống chính thức được trồng mở rộng ở miền Bắc Việt nam, có động thái tăng trưởng mạnh nhất (theo Quyết định số 162/QĐ-TT- CLT ngày 4/6/2009). Bên cạnh đó, giống L đã được trồng lâu đời ở Việt Nam
(có tên gọi là loa kèn hay huệ tây), loài lily SP được mọc phổ biến ở Lào Cai cũng đang bước đầu khảo nghiệm trồng trọt nhằm phát triển ở Việt Nam (Nguyễn Văn Tỉnh và cs., 2009). Giống loa kèn Tứ Quý (F) cũng được khảo nghiệm có khả năng sinh trưởng tốt, có thể trồng quanh năm tại Hà Nội và một số tỉnh thành khác trong cả nước. Giống này bước đầu được cho rằng có khả năng chịu nhiệt khá tốt và có thể trồng trọt được ở mùa hè Việt Nam (Đặng Văn Đông & Nguyễn Thị Duyên, 2009). Những kết quả này là cơ sở cho việc áp dụng những công nghệ gen, công nghệ tế bào sau đó để tạo dòng lily mới như là công nghệ cứu phôi, công nghệ chuyển gen in vitro. Kết quả nghiên cứu cho thấy, 6 giống lily khảo sát đều có khả năng tái sinh củ in vitro trong môi trường MS có bổ sung đường saccharose có nồng độ 9% với hệ số nhân từ 1,1 củ/ lát cắt vảy củ (giống F) đến 1,89 củ/ lát cắt vảy củ (giống Sor). Kết quả này cho thấy sự tương tự với kết quả của nhiều nhà nghiên cứu khác trên thế giới cũng cho rằng, đường với nồng độ cao (9% saccharose) là điều kiện tối ưu cho sự phát triển củ lily cũng như số lượng củ lily, ví dụ như Vasrshney et al., (2000) với dòng lai châu Á- Asiatic hybrids 'Gran Paradiso' và 'Sanciro'; Kumar et al., (2005) với lily lai Phương đông - Oriental hybrid lily 'Star Gazer') L. ledebourii.
Nội dung nghiên cứu tiếp theo là lai tạo nhằm tạo dòng con lai theo mục đích có khả năng chịu nhiệt. Sự lai tạo có thể tăng độ bền của hoa, tạo ra màu sắc hoa lạ và kiểu dáng hoa mới, cũng có thể làm tăng khả năng kháng bệnh, tăng khả năng chống chịu với các điều kiện bất thuận của môi trường. Với mục đích tạo con lily lai có khả năng chịu nhiệt, các dòng bố, mẹ có đặc tính sinh trưởng, phát triển tốt và/hoặc có đặc tính chịu nhiệt được chọn lọc và lai với nhau. Tuy nhiên, hầu hết các trường hợp không đạt kết quả như mong muốn do các dòng bố mẹ có quan hệ di truyền xa nhau. Điều này có thể do một vài nguyên nhân như sự không tương hợp về bộ nhiễm sắc thể, sự không tương hợp về di truyền (bất dục di truyền) hay do những nhân tố khác mà chúng ta vẫn chưa biết đến (Van Tuyl & De Jeu, 1997). Để hạn chế hiện tượng bất hợp ở lily, các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp thụ phấn cắt ngắn vòi nhụy để vượt qua rào cản trước thụ tinh (Asano & Myodo,
1977; Van Tuyl & De Jeu, 1997). Tuy nhiên, phương pháp thụ phấn cắt ngắn vòi nhụy chỉ đạt hiệu quả khi tiến hành phối hợp với phương pháp nuôi cấy phôi (Asano, 1980).
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy, khi tiến hành lai tạo 9 tổ hợp lai (7 tổ hợp lai xa và 2 tổ hợp lai gần làm đối chứng), sau 7 ngày thụ phấn, tỷ lệ đậu quả ở các tổ hợp khá cao (từ 45,5% -100%). Tuy nhiên, các quả lai bắt đầu teo dần rồi chết sau thụ phấn 15 - 30 - 45 ngày; trừ các tổ hợp FS, SF, SB, FL và LF. Mặc dù chúng tôi đã sử dụng phương pháp thụ phấn cắt ngắn vòi nhụy với mục đích giảm rào cản trước thụ tinh (do hạt phấn không nảy mầm trên bầu nhụy hoặc vòi nhụy quá dài làm cho mầm của hạt phấn không tiếp cận được với noãn) (Lim & VanTuyl, 2006). Chỉ có một số ít quả lai còn sống sót sau 30 – 45 ngày thụ phấn, điều này được giải thích bởi cơ chế bất hợp sau thụ tinh, đó là quá trình thụ tinh vẫn diễn ra bình thường nhưng phôi không phát triển được biểu hiện là quả non bị héo và chết sớm (VanTuyl et al., 1991).
Để khắc phục hiện tượng trên, phương pháp cứu phôi đã được chúng tôi áp dụng trong nghiên cứu của mình với hai kỹ thuật là nuôi cấy lát cắt bầu nhụy hoặc tách và nuôi phôi in vitro bước đầu đã mang lại hiệu quả nhất định. Các tổ hợp FS, SL và SF thu được một lượng nhỏ hạt lai nảy mầm và tạo củ trên cả 3 môi trường MS có bổ sung BA. Trong đó môi trường chứa 0,5 mg/l BA cho tỷ lệ hạt nảy mầm và tỷ lệ hạt nảy mầm thành củ cao nhất (5,0% tỷ lệ hạt nảy mầm và 1,7% tỷ lệ hạt nảy mầm thành củ đối với tổ hợp SF; 8,9% và 6,7% với tổ hợp SL và 11,1% và 8,9% với tổ hợp FS).
Tác giả Trịnh Khắc Quang (2012) cũng đã thu được một số kết quả bước đầu tương tự khi đưa hạt lai của một số tổ hợp lily trong môi trường có bổ sung BA 0,5 mg/l. Khi tăng nồng độ BA lên 1,0mg/l hạt lai nảy mầm và nảy mầm tạo củ với tỷ lệ thấp và số còn lại phát sinh mô sẹo. Điều này có thể giải thích rằng khi bổ sung BA ở nồng độ cao 1,0 mg/l làm cho tỷ lệ giữa cytokinin và auxin (nội sinh và ngoại sinh) đạt mức cân bằng, thích hợp cho việc tạo mô sẹo. Như vậy, sự có mặt của BA trong môi trường đã làm tăng tỷ lệ hạt lai nảy mầm và tạo
củ ở những tổ hợp này. Phôi của các tổ hợp SB, LF và FL sau 45 ngày thụ phấn được tách ra và tiến hành nuôi cấy cứu phôi trên môi trường MS +30g/l saccharosesaccharose+ 0,01 mg/l NAA + 0,1 mg/l BA (VanTuyl et al., 1991). Do môi trường nuôi cấy có chất kích thích sinh trưởng thực vật thích hợp đã giúp cho phôi nảy mầm thành cây in vitro hoàn chỉnh (Chi, 2002).
Nghiên cứu của Orlikowska et al. (2001) đã chỉ ra rằng, có thể xảy ra sự tiếp hợp vô tính trong quá trình sinh sản của lily. Chính vì vậy, cần sử dụng chỉ thị phân tử như RAPD (Yamagishi Masumi et al., 2002), (Ploszai Beata, 2007) để đánh giá tình trạng của con lai lily thu được. Bên cạnh RAPD, chỉ thị ISSR cũng được sử dụng để đánh giá con lai ở lily, tuy nhiên số lượng các nghiên cứu được công bố còn chưa nhiều (Yamagishi Masumi et al., 2002). Chỉ thị ISSR có nhiều đặc tính đã vượt qua các giới hạn mà các kỹ thuật RAPD và AFLP gặp phải để đánh giá di truyền (Meyer et al., 1993; Gupta et al., 1994; Wu et al., 1994). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng kết hợp giữa kỹ thuật RAPD và chỉ thị ISSR để xác định các con lai. Trong các cá thể được chúng tôi tạo ra bằng phương pháp lai, chỉ có các cá thể SL11, I5 và 134 được bước đầu được xác định là con lai thực thụ và chúng có mối quan hệ di truyền với cả dòng bố và dòng mẹ.
Ba dòng con lai lily với số lượng có hạn về mẫu nên chúng tôi chỉ đánh giá khả năng chịu nóng điều kiện in vitro mức độ mô (lát cắt vảy củ). Kết quả đã cho thấy rằng, dòng lai SL11 không có khả năng chịu nhiệt (thể hiện tỷ lệ mẫu sống sót sau sốc nhiệt sau 30 ngày bằng 0%). Mặc dù, đây là tổ hợp lai có một bên bố mẹ (trong trường hợp này là mẹ - L) có khả năng chịu nhiệt (Đặng Văn Đông & Đinh Thế Lộc, 2004) nhưng con lai đã không thừa hưởng đặc điểm chịu nhiệt từ dòng mẹ. Dòng lai I5 (con lai của tổ hợp của 2 dòng bố mẹ (L, F) đều có khả năng chịu nhiệt tương đối (Đặng Văn Đông & Đinh Thế Lộc, 2004)) thể hiện tiềm năng chống chịu nhiệt cũng chỉ gần bằng với dòng bố mẹ (thể hiện ở tỷ lệ mẫu vảy củ sống sót sau sốc nhiệt, tỷ lệ mẫu sống sót tạo củ và hệ số tạo củ tương đương với bố mẹ). Dòng lai 134 có tỷ lệ sống sót sau sốc nhiệt sấp xỉ giống dòng làm mẹ (Bel – thuộc nhóm OT, nhóm lai giữa dòng lily
thơm phương đông và dòng loa kèn có khả năng chịu nóng), cao hơn dòng làm bố (Sor - thuộc nhóm O, nhóm lily phương đông có khả năng chịu nóng kém). Tuy nhiên, tỷ lệ mẫu sống sót tạo củ và hệ số nhân củ của dòng con lai này và bố mẹ sai khác nhau không phụ thuộc vào tỷ lệ mẫu sống sót sau sốc nhiệt mà có lẽ phụ thuộc hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng nội sinh trong mẫu giống. Các dòng lily lai này cần được nhân lên về số lượng để đánh giá khả năng chịu nóng mức độ cá thể.
Nhiều dòng lily in vitro mới cũng bước đầu được ghi nhận là được tạo ra thành công nhờ kỹ thuật chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium. Kỹ thuật chuyển gen đã được nghiên cứu trên thế giới từ lâu và mới gần đây người ta bắt đầu thực hiện chuyển gen vào lily. Những gen được chuyển gồm chủ yếu là các gen chỉ thị và gen chọn lọc như gen neomycin phosphotransferase II (nptII),
hygromycine phosphotransferase (hpt) và gen β-glucuronidase (GUS) (Hoshi et al., 2004, 2005; Ogaki & Furuichi, 2008a; Li et al., 2008a; Nguyễn Thị Phương Thảo và CS., 2008; Nguyễn Thị Lý Anh và CS., 2009; Azadi et al., 2010; Xi et al., 2012; Yue Wang et al., 2012). Các kết quả thu được đang dừng ở việc xây